Cellule progenitrici coronariche e biomarcatori solubili nella prognosi cardiovascolare dopo l'angioplastica coronaria

Riepilogo

Lo sviluppo di importanti eventi cardiovascolari avversi, che influenzano la prognosi cardiovascolare dopo l'angioplastica coronarica, sono influenzati dall'entità del danno coronarica e dalla riparazione vascolare. L'uso di nuovi biomarcatori cellulari e solubili, reattivi ai danni vascolari e alla riparazione, sono utili per prevedere lo sviluppo di MACE e prognosi.

Abstract

I principali eventi cardiovascolari avversi (MACE) influiscono negativamente sulla prognosi cardiovascolare dei pazienti sottoposti a angioplastica coronarica a causa di lesioni ischemiche coronariche. L'entità del danno coronario e i meccanismi di riparazione vascolare sono fattori che influenzano il futuro sviluppo dei MACE. Caratteristiche vascolari intrinseche come le caratteristiche della placca e la complessità dell'arteria coronaria hanno dimostrato informazioni prognostiche per i MACE. Tuttavia, l'uso di biomarcatori circolanti intracoronarici è stato postulato come un metodo conveniente per l'identificazione precoce e la prognosi dei MACE, in quanto riflettono più da vicino meccanismi dinamici che coinvolgono danni coronarici e riparazione. La determinazione dei biomarcatori circolanti coronarici durante l'angioplastica, come il numero di sottopopolazioni di cellule progenitrici mononucleari (PPC) e la concentrazione di molecole solubili che riflettono l'infiammazione, l'adesione cellulare e la riparazione, valutazione degli sviluppi futuri e della prognosi dei MACE 6 mesi dopo l'angioplastica coronarica. Questo metodo è evidenziato dalla sua natura traslazionale e dalle migliori prestazioni rispetto ai biomarcatori periferici circolanti sul sangue per quanto riguarda la previsione dei MACE e il suo effetto sulla prognosi cardiovascolare, che possono essere applicati per la stratificazione del rischio dei pazienti con malattia coronarica in fase di angioplastica.

Introduzione

L'angioplastica coronarica e lo stenting rappresentano una procedura di recupero per i pazienti con malattia coronarica (CAD). Tuttavia, importanti eventi cardiovascolari avversi (MACE), tra cui la morte cardiovascolare, l'infarto miocardico, la restenosi coronarica e gli episodi di angina o insufficienza cardiaca di scompensare, possono verificarsi mesi dopo l'intervento coronarico, spingendo visite non programmate in ospedale. I MACE sono comuni in tutto il mondo e la loro morbi-mortalità è alta¹.

La lesione coronarica ischemica induce la risposta vascolare precoce e meccanismi riparativi che coinvolgono la mobilitazione dei MMP a causa della loro capacità di differenziazione e/o del potenziale angio-reparativo, così come la produzione di molecole solubili come molecole di adesione intercellulare (ICAM), metalloproteine a matrice (MMM), e specie reattive dell'ossigeno, che riflette l'adesione cellulare, la rimodellamento dei tessuti e lo stress ossidativo. Anche se caratteristiche vascolari intrinseche come le caratteristiche della placca e la complessità dell'arteria coronaria sono state utilizzate per prevedere i MACE, alcuni studi hanno suggerito che i biomarcatori correlati ai meccanismi di lesione e riparazione che si verificano nell'endotelio coronario potrebbero essere molto utili per l'identificazione precoce e la prognosi di eventi cardiovascolari in pazienti con CAD sottoposti all'angioplastica coronaria^2,3,4,5.

Il continuo interesse per la comprensione dei meccanismi alla base delle lesioni e della riparazione CAD ha motivato gli sperimentatori a studiare i biomarcatori circolanti intracoronari, perché il campionamento coronarica riflette più da vicino i danni vascolari e la riparazione⁶. Tuttavia, la caratterizzazione dei biomarcatori coronarici negli studi sull'uomo è stata scarsa^7,8,9. Pertanto, lo scopo del presente studio era descrivere un metodo per determinare la quantità di MPC circolanti coronarici e molecole solubili, riflettendo sia lesioni vascolari che riparazioni, e per mostrare se questi biomarcatori sono associati ai MACE e alla prognosi clinica dei pazienti CAD che hanno subito un'angioplastica coronarica. Questo metodo si basa sull'uso di MPC vascolari circolanti, circolanti e molecole solubili ottenute campionando posizioni più vicine al danno del vaso. Può anche essere utile per studi clinici per l'ischemia degli arti inferiori, ictus, vavulite, trombosi venosa, e altre lesioni che coinvolgono lesioni vascolari e riparazione.

Protocollo

Questo protocollo soddisfa le linee guida istituzionali del Comitato Etico per la ricerca umana.

1. Angiografia coronaria, ultrasuoni e campionamento del sangue

1. Richiedere informazioni cliniche e demografiche di base prima dell'intervento coronarica. Raccogliere i dati dell'individuo: età, sesso, stato di fumo attuale, indice di massa corporea (BMI), alta pressione sanguigna, dilipidemia, diabete mellito, farmaci e l'indicazione per l'attuale angiografia coronarica.
2. Eseguire l'angiografia coronarica attraverso la cateterizzazione cardiaca utilizzando un approccio radiale. Questa procedura deve essere eseguita sotto una guida alla fluoroscopia nella stanza dell'emodinamica da cardiologi esperti.
   NOTA: Identificare i recipienti valutabili. Per il presente studio, i vasi valutabili sono stati definiti come arterie con sezioni superiori a 1,5 mm e stenosi di lumen di oltre il 50%.
3. Avanzare il catetere ad ultrasuoni intravascolari nella regione di interesse e registrare le immagini. Utilizzare il software appropriato per individuare e misurare la più piccola area luminale.
4. Utilizzare un catetere coronarico per raccogliere 10 mL di sangue dalla posizione più vicina alla placca.
5. Dopo la dimissione del paziente, programmare valutazioni mediche periodiche per seguire gli endpoint dello studio. Se il contatto telefonico non è possibile o una visita medica viene ritardata di più di 2 mesi, richiedere a una persona autorizzata (precedentemente progettata) di verificare gli endpoint dello studio.
   NOTA: Si consideri uno dei seguenti un MACE: 1) morte cardiovascolare, 2) nuova infarto miocardico, 3) angina instabile che richiede una visita medica non programmata entro 24 h, 4) resienosi stent come dimostrato da angiografia coronarica, 5 episodi) di scompensato insufficienza cardiaca che richiede attenzione clinica.

2. Determinazione dei PMC circolanti (Figura 2)

1. Elaborare il sangue entro 1 h dalla raccolta. Trasferire 6 mL del sangue raccolto su un tubo conico da 15 mL e diluire 1:1 (v/v) con 1x fosfato buffered saline (PBS), pH - 7.4.
2. Aggiungere 2 mL di grado di pendenza di densità a tre provette. Trasferire con attenzione tre aliquote di uguale volume di sangue diluito in ogni provetta contenente il mezzo di pendenza di densità.
   NOTA: Il volume totale del gradiente di densità medio e del sangue diluito non deve superare i tre quarti della capacità massima della provetta.
3. Centrifuga a 1.800 x g, 4 gradi centigradi per 30 min. Trasferire la banda all'interfaccia tra gli strati in un nuovo tubo. Aggiungere 2 mL di PBS e centrifuga a 1.800 x g, 4 gradi centigradi per 6 min. Il pellet conterrà i MPC.
4. Lavare il pellet più volte. Aspirare la soluzione precedente e risospendere delicatamente il pellet cellulare in PBS fresco. Per i furici successivi, centrifugare a 1.800 x g, 4 C per 2 min. Ripetere il processo 6x.
5. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS. Mescolare 20 - L della sospensione cellulare con 0.4% trypan blu, diluito 1:1 (v/v). Applicare una goccia su un emocitometro e contare le cellule non colorate al microscopio luminoso.
6. Procedere alla determinazione dei PMC. Etichettare 5 mL tubo di citometria di flusso e fuori aliquota 1 x 10⁶ cellule per tubo. Preparare gli anticorpi di controllo corrispondenti abbinati all'isotipo. Centrifuga a 1.800 x g,4 gradi centigradi per 6 min e scartare il supernatante.
7. Aggiungere l'anticorpo primario diluito in 100 gradi di una soluzione di incubazione degli anticorpi costituita da 1x PBS (pH - 7,4), 2 mM di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) e 0,05% albumina del siero bovino (BSA). Risospendere per 10 s e incubare per 20 min a 4 gradi centigradi, protetto dalla luce. Il protocollo può essere sospeso a questo passo fissando i linfociti nel 4% di paraformaldeide in PBS e conservando campioni fino a 24 h a 4 gradi centigradi.
   NOTA: le concentrazioni finali degli anticorpi primari utilizzati nel presente protocollo erano CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
8. Centrifuga a 1.800 x g,4 gradi centigradi per 2 min e scartare il supernatante. Risospendere in 500 - L di 1x PBS (pH - 7,4), 2 mM EDTA.
9. Eseguire l'analisi della citometria di flusso. Utilizzare anticorpi di controllo associati a isotipi per impostare la colorazione dello sfondo. Quindi, selezionare i linfociti sparsi nella trama FSC/SSC, cercando di escludere i granulociti residui, i detriti cellulari e altre particelle, che di solito si trovano nella parte inferiore, distribuita a sinistra nella trama. Tale distribuzione è considerata al 100%.
10. Utilizzare un cancello contenente un elevato numero di cellule con immunofenotipo comune CD45 e CD34^. Per gli immunofenotipi doppio positivo, utilizzare un cancello che in precedenza identifica CD45^,CD34, con l'aggiunta di KDR (VEGFR-2)^,CD133^,o CD184. Identificare le sottopopolazioni MPC in base ai marcatori di superficie cellulare specifici. Segnalare la percentuale di eventi con cancello.
11. Identificare le principali sottopopolazioni di MPC. Nel presente studio i principali immunofenotipi sono stati CD45^,CD34^,CD33^,CD45 , CD184 , CD45^,CD34 , CD34^,CD34 , CD133^,CD184^,CD45^,CD34^,KDR^,CD45 , CD45 , CD34 , CD34 , CD133 , e CD45 , CD34^,CD14 , KDR , CD14 .
    NOTA: I marcatori di superficie cellulare utilizzati erano CD45 (linfociti), CD34 (cellule endoteliali e/o vascolari), KDR (VEGFR-2), marcatore di membrana delle cellule endoteliali), CD133 (cellule progenitrici endoteliali) e CD184 (cellule staminali ematopoietiche e cellule endoteliche).

3. Determinazione dei biomarcatori solubili al plasma

1. Utilizzare un saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) per determinare la concentrazione di SICAM-1 e MMP-9(Figura 3, fila superiore).
   1. Centrifugare i campioni di sangue a 3.000 x g, temperatura ambiente per 5 min e raccogliere il plasma.
   2. Etichettare gli standard, i tubi campione e i tubi di controllo. Egli i pozzi pre-rivestiti nella piastra di prova lavando 2x con il buffer di lavaggio fornito nel kit ELISA.
   3. Trasferire gli standard, i campioni e i controlli nei pozzi. Sigillare e incubare a 37 gradi centigradi per 90 min.
      NOTA: Non lasciare asciugare completamente i pozzi.
   4. Eliminare il contenuto e aggiungere l'anticorpo antibio di biotina-rilevamento. Sigillare e incubare a 37 gradi centigradi per 60 min.
   5. Scartare il contenuto e lavare 3x. Sigillare la placca e incubare in sequenza con soluzione di lavoro streptavidina seguita da substrato tetramethylbenzidine a 37 gradi centigradi per 30 min, protetto dalla luce. Lavare 3volte tra le incubazioni. Quando il colore si sviluppa, aggiungere la soluzione di arresto e leggere l'assorbimento della densità ottica in un lettore ELISA a microplacca.
2. Utilizzare un saggio immunomagnetico multiplexing per determinare la concentrazione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF) e dell'interleumina 1 beta (IL-1) (Figura 3, riga inferiore).
   1. Etichettare gli standard, i tubi campione e i tubi di controllo.
   2. Vorticare le fiale magnetiche per 30 s. Trasferire la sospensione del tallone a tubi di dimensioni appropriate, e quindi ai pozzi nella piastra di assaggio multiplexing. Il vortice periodico evita la precipitazione delle perline.
   3. Inserire in modo sicuro la lavapiastra magnetica portatile. Attendere 2 min per le perline di accumularsi sul fondo di ogni pozzo e rapidamente invertire sia la lavatrice a lapiastra magnetica a mano e l'assemblaggio della piastra, su un lavandino o contenitore di rifiuti. Ricordarsi di utilizzare la lavatrice a piastra magnetica portatile per mantenere le perline all'interno dei pozzi.
   4. Aggiungere 150 l di tampone di lavaggio in ogni pozzo e attendere 30 s per consentire alle perline di accumularsi sul fondo. Eliminare il contenuto come nel passaggio 3.2.3. Quindi, aggiungere 25 l di buffer di asino universale (fornito nel kit) seguito da 25 - L di standard, campioni e controlli preparati.
   5. Sigillare la piastra e incubare per almeno 60 min a temperatura ambiente, leggera, con agitazione costante a 500 giri/m. In alternativa, incubare durante la notte a 4 gradi centigradi, protetti dalla luce, con agitazione costante a 500 giri/min, se possibile.
   6. Lavare 2x aggiungendo 150 l di tampone di lavaggio e attendere 30 s. Scartare il contenuto inserendo la lavatrice a mano. Attendere 2 min e invertire su un lavandino o contenitore di rifiuti.
   7. Incubare in sequenza con 25 l di miscela di anticorpi di rilevamento seguita da 25 - L di soluzione streptavidin-PE a temperatura ambiente per 30 min, sigillato e protetto dalla luce, con agitazione costante a 500 rpm. Lavare 2x tra le incubazioni, come descritto al punto 3.2.6.
   8. Ottenere le letture. Aggiungere 120 l di buffer di lettura. Sigillare la piastra e incubare 5 min a temperatura ambiente, protetto dalla luce, con agitazione costante a 500 rpm. Eseguire la lettura su un lettore di saggi multiplexing. Regolare i parametri di lettura in base a ciascun analita.

Risultati

Coronaria, seno venoso e sangue periferico sono stati raccolti da 52 pazienti sottoposti ad angiografia coronarica (Figura 1) e hanno mostrato un'alta prevalenza di ipertensione e dislipidemia. Al follow-up clinico, 11 (21,1%) I MACE si sono verificati 6 mesi dopo l'angiografia coronarica: morte (n ) e angina che richiedono la frequenza ospedaliera (n . 6), infarto miocardico (n ) e/o prove di insufficienza cardiaca (n . 4).

Discussione

La raccolta di sangue dall'arteria coronaria interessata può essere difficile. A volte, l'arteria coronaria è a malapena accessibile. In questo caso, il campionamento dal seno venoso può essere un'alternativa. Abbiamo eseguito test di convalida confrontando biomarcatori circolanti nell'arteria coronaria contro il seno venoso, senza differenze significative. Tuttavia, le prestazioni dei biomarcatori circolanti sono state convalidate solo per il campionamento coronario. Pertanto, le prestazioni dei biomarcatori ottenuti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm