Koronare Vorläuferzellen und lösliche Biomarker bei kardiovaskulärer Prognossie nach koronarer Angioplastie

Zusammenfassung

Die Entwicklung von schweren kardiovaskulären Ereignissen, die die kardiovaskuläre Prognose nach der koronaren Angioplastie beeinflussen, wird durch das Ausmaß der koronaren Schäden und der Gefäßreparatur beeinflusst. Die Verwendung neuartiger koronarer zellulärer und löslicher Biomarker, die auf Gefäßschäden und -reparaturen reagieren, sind nützlich, um die Entwicklung von MACEs und Prognosen vorherzusagen.

Zusammenfassung

Wichtige unerwünschte kardiovaskuläre Ereignisse (MACEs) wirken sich negativ auf die kardiovaskuläre Prognose von Patienten aus, die aufgrund einer koronaren ischämischen Verletzung einer koronaren Angioplastie unterzogen werden. Das Ausmaß der koronaren Schäden und die Mechanismen der Gefäßreparatur sind Faktoren, die die zukünftige Entwicklung von MACEs beeinflussen. Intrinsische gefäßliche Merkmale wie die Plaqueeigenschaften und die Komplexität der Koronararterie haben prognostische Informationen für MACEs gezeigt. Die Verwendung von intrakoronar zirkulierenden Biomarkern wurde jedoch als bequeme Methode zur Früherkennung und Prognose von MACEs postuliert, da sie dynamische Mechanismen mit koronaren Schäden und Reparaturen stärker widerspiegeln. Die Bestimmung koronar zirkulierender Biomarker während der Angioplastie, wie die Anzahl der Subpopulationen mononuklearer Vorläuferzellen (MPCs) sowie die Konzentration löslicher Moleküle, die Entzündungen, Zellhaftung und -reparatur reflektieren, Bewertung zukünftiger Entwicklungen und Prognose von MACEs 6 Monate nach der koronaren Angioplastie. Diese Methode wird durch ihre translationale Natur und bessere Leistung als periphere blutzirkulierende Biomarker in Bezug auf die Vorhersage von MACEs und ihre Auswirkungen auf die kardiovaskuläre Prognose, die für die Risikoschichtung von Patienten angewendet werden kann, hervorgehoben. mit koronaren Herzkrankheit unter angioplasty.

Einleitung

Koronare Angioplastie und Stents stellen ein Bergungsverfahren für Patienten mit koronaren Herzerkrankungen (CAD) dar. Jedoch, große unerwünschte kardiovaskuläre Ereignisse (MACEs), einschließlich Herz-Kreislauf-Tod, Myokardinfarkt, koronare Restenose, und Episoden von Angina oder Dekompensierung Herzinsuffizienz, kann Monate nach koronaren Eingriff auftreten, was zu ungeplanten Besuchen im Krankenhaus. MACEs sind weltweit verbreitet und ihre Morbi-Sterblichkeit ist hoch¹.

Koronare ischämische Verletzungen induzieren eine frühe vaskuläre Reaktion und reparative Mechanismen, die die Mobilisierung von MPCs aufgrund ihrer Differenzierungsfähigkeit und/oder ihres angio-reparativen Potenzials sowie der Produktion von löslichen Molekülen wie interzellulären Adhäsionsmolekülen (ICAMs), Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und reaktiven Sauerstoffspezies, die die Zelladhäsion, gewebeumbauenund, reflektieren, reflektieren. Obwohl intrinsische gefäßliche Merkmale wie Plaque-Eigenschaften und koronare Arterienkomplexität verwendet wurden, um MACEs vorherzusagen, haben einige Studien vorgeschlagen, dass Biomarker im Zusammenhang mit den Mechanismen der Verletzung und Reparatur im koronaren Endothel sehr nützlich für die frühe Identifizierung und Prognose von kardiovaskulären Ereignissen bei Patienten mit CAD, die koronare Angioplastie^2,3,4,5.

Kontinuierliches Interesse am Verständnis der Mechanismen, die CAD-Verletzungen und -Reparaturen zugrunde liegen, hat die Forscher motiviert, intrakoronar zirkulierende Biomarker zu untersuchen, da die koronare Probenahme Gefäßschäden genauer widerspiegelt und⁶repariert. Die Charakterisierung von koronaren Biomarkern in Studien am Menschen war jedoch knapp^7,8,9. Daher bestand der Zweck dieser Studie darin, eine Methode zur Bestimmung der Menge an koronar zirkulierenden MPCs und löslichen Molekülen zu beschreiben, die sowohl Gefäßverletzungen als auch Reparaturen widerspiegeln, und zu zeigen, ob diese Biomarker mit MACEs und der klinischen Prognose von CAD-Patienten, die einer koronaren Angioplastie unterzogen wurden, in Verbindung gebracht werden. Diese Methode basiert auf der Verwendung von vaskulären, zirkulierenden MPCs und löslichen Molekülen, die durch Probenahmevonstellen am nächsten an der Gefäßschädigung gewonnen werden. Es kann auch nützlich sein für klinische Studien für Dieschämien unterden Gliedmaßen, Schlaganfall, Vaskulitis, venöse Thrombose, und andere Verletzungen mit Gefäßverletzungen und Reparatur.

Protokoll

Dieses Protokoll entspricht den institutionellen Leitlinien der Ethikkommission für die menschliche Forschung.

1. Koronare Angiographie, Ultraschall und Blutentnahme

1. Fordern Sie klinische und demografische Basisinformationen an, bevor koronare Interventionen vorliegen. Sammeln Sie die Daten des Einzelnen: Alter, Geschlecht, aktueller Raucherstatus, Body-Mass-Index (BMI), Bluthochdruck, Dyslipidämie, Diabetes mellitus, Medikamente und die Indikation für die aktuelle koronare Angiographie.
2. Führen Sie die koronare Angiographie durch Herzkatheterisierung mit einem radialen Ansatz durch. Dieses Verfahren sollte unter einem Fluoroskopie-Leitfaden im Hämodynamikraum von erfahrenen Kardiologen durchgeführt werden.
   HINWEIS: Identifizieren Sie auswertbare Schiffe. Für die vorliegende Studie wurden auswertbare Gefäße als Arterien mit Abschnitten größer als 1,5 mm und Lumenstenose von mehr als 50 % definiert.
3. Fördern Sie den intravaskulären Ultraschallkatheter in den Bereich des Interesses und zeichnen Sie Bilder auf. Verwenden Sie die entsprechende Software, um die kleinste Luminalfläche zu lokalisieren und zu messen.
4. Verwenden Sie einen koronaren Katheter, um 10 ml Blut von der nächstgelegenen Stelle zur Plaque zu sammeln.
5. Planen Sie nach der Entlassung des Patienten periodische medizinische Bewertungen, um Studienendpunkte zu verfolgen. Wenn ein telefonischer Kontakt nicht möglich ist oder sich ein Arztbesuch um mehr als 2 Monate verzögert, bitten Sie eine autorisierte Person (zuvor entworfen), die Studienendpunkte zu überprüfen.
   ANMERKUNG: Betrachten Sie einen der folgenden MACE: 1) herzkardialen Tod, 2) neuen Myokardinfarkt, 3) instabile Angina, die zu einem außerplanmäßigen Arztbesuch innerhalb von 24 h, 4) Stent-Restenose führt, wie die koronare Angiographie zeigt, 5) Episoden von dekompensierten Herzinsuffizienz, die klinische Aufmerksamkeit erfordert.

2. Bestimmung der zirkulierenden MPCs (Abbildung 2)

1. Verarbeiten Sie das Blut innerhalb von 1 h aus der Sammlung. 6 ml des gesammelten Blutes in ein 15 ml konisches Rohr geben und 1:1 (v/v) mit 1x Phosphatgepufferter Saline (PBS), pH = 7,4 verdünnen.
2. Fügen Sie 2 ml Dichtegradientenmedium zu drei Reagenzgläsern hinzu. Übertragen Sie vorsichtig drei gleich große Volumen-Aliquots verdünntes Blut in jedes Reagenzglas, das das Dichtegradientenmedium enthält.
   HINWEIS: Das Gesamtvolumen des Dichtegradienten mittleres und verdünntes Blut sollte drei Viertel der maximalen Kapazität des Reagenzglases nicht überschreiten.
3. Zentrifuge bei 1.800 x g, 4 °C für 30 min. Übertragen Sie das Band an der Schnittstelle zwischen den Schichten in ein neues Rohr. Fügen Sie 2 ml PBS und Zentrifuge bei 1.800 x g, 4 °C für 6 min. Das Pellet enthält die MPCs.
4. Waschen Sie das Pellet mehrmals. Die vorherige Lösung absaugen und das Zellpellet in frischem PBS vorsichtig wieder aufhängen. Für nachfolgende Wähehen Zentrifuge bei 1.800 x g,4 °C für 2 min. Wiederholen Sie den Vorgang 6x.
5. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml PBS wieder auf. Mischen Sie 20 l der Zellsuspension mit 0,4% Trypan blau, verdünnt 1:1 (v/v). Tragen Sie einen Tropfen auf ein Hämozytometer auf und zählen Sie die ungefärbten Zellen unter einem Lichtmikroskop.
6. Fahren Sie mit der MPCs-Bestimmung fort. Etikettieren Sie 5 ml Durchflusszytometrieröhrchen und aliquotout aus 1 x 10⁶ Zellen pro Röhre. Bereiten Sie die entsprechenden isotypübereinstimmenden Kontrollantikörper vor. Zentrifuge bei 1.800 x g, 4 °C für 6 min und den Überstand entsorgen.
7. Fügen Sie den primären Antikörper hinzu, der in 100 l einer Antikörper-Inkubationslösung verdünnt wurde, die aus 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,05% Rinderserumalbumin (BSA) besteht. 10 s aufsetzen und 20 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren. Das Protokoll kann bei diesem Schritt angehalten werden, indem die Lymphozyten in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert und Proben bis zu 24 h bei 4 °C gelagert werden.
   HINWEIS: Die letzten Konzentrationen der primären Antikörper, die im vorliegenden Protokoll verwendet wurden, waren CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
8. Zentrifuge bei 1.800 x g, 4 °C für 2 min und den Überstand entsorgen. Resuspend in 500 l mit 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM EDTA.
9. Führen Sie eine Flusszytometrieanalyse durch. Verwenden Sie isotypübereinstimmende Kontrollantikörper, um die Hintergrundfärbung einzurichten. Wählen Sie dann Lymphozyten aus, die sich im FSC/SSC-Plot ausbreiten und versuchen, Restgranulozyten, Zellablagerungen und andere Partikel auszuschließen, die sich normalerweise im unteren, links verteilten Diagramm befinden. Eine solche Verteilung wird als 100% betrachtet.
10. Verwenden Sie ein Tor, das eine hohe Anzahl von Zellen mit dem gemeinsamen Immunophenotyp CD45⁺ und CD34⁺enthält. Verwenden Sie für doppelt positive Immunophenotypen ein Gate, das zuvor CD45⁺, CD34⁺identifiziert, wobei entweder KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺oder CD184⁺hinzufügt sind. Identifizieren Sie die MPC-Subpopulationen anhand ihrer spezifischen Zelloberflächenmarker. Melden Sie sich als Prozentsatz der Gated-Ereignisse.
11. Identifizieren Sie die wichtigsten Teilpopulationen von MpCs. In der vorliegenden Studie waren die wichtigsten Immunophenotypen CD45⁺CD34⁺CD133⁺, CD45⁺CD34⁺CD184⁺, CD45⁺CD34⁺CD184⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺und CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184.
    HINWEIS: Die verwendeten Zelloberflächenmarker waren CD45 (Lymphozyten), CD34 (endotheliale und/oder vaskuläre Zellen), KDR (VEGFR-2, Membranmarker von Endothelzellen), CD133 (endotheliale Vorläuferzellen) und CD184 (hämatopoetische Stammzellen und Endothelzellen).

3. Bestimmung von plasmalöslichen Biomarkern

1. Verwenden Sie einen enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA), um die Konzentration von SICAM-1 und MMP-9 zu bestimmen(Abbildung 3, obere Reihe).
   1. Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 3.000 x g,Raumtemperatur für 5 min und sammeln Sie das Plasma.
   2. Beschriften Sie die Normen, Probenröhrchen und Steuerröhrchen. Die vorbeschichteten Brunnen in der Assayplatte durch Waschen des 2x mit dem im ELISA-Kit enthaltenen Waschpuffer ausdemaieren.
   3. Übertragen Sie die Standards, Proben und Kontrollen auf die Brunnen. Bei 37 °C 90 min versiegeln und inkubieren.
      HINWEIS: Lassen Sie die Brunnen nicht vollständig trocknen.
   4. Entsorgen Sie den Inhalt und fügen Sie den Biotin-Detektionsantikörper hinzu. Bei 37 °C 60 min versiegeln und inkubieren.
   5. Entsorgen Sie den Inhalt und waschen Sie 3x. Versiegeln Sie die Plaque und inkubieren Sie nacheinander mit Streptavidin-Arbeitslösung gefolgt von Tetramethylbenzidin-Substrat bei 37 °C für 30 min, lichtgeschützt. Waschen Sie 3x zwischen Inkubationen. Wenn sich die Farbe entwickelt, fügen Sie die Stop-Lösung hinzu und lesen Sie die optische Dichteabsorption in einem Mikroplatten-ELISA-Reader.
2. Verwenden Sie einen immunmagnetischen Multiplexing-Test, um die Konzentration des Tumornekrosefaktors alpha (TNF) und Interleukin 1 beta (IL-1) zu bestimmen (Abbildung 3, untere Reihe).
   1. Beschriften Sie die Normen, Probenröhrchen und Steuerröhrchen.
   2. Wirbel die magnetischen Perlen Fläschchen für 30 s. Übertragen Sie die Perlensuspension auf entsprechend große Rohre, und dann auf die Brunnen in der Multiplexing-Assay-Platte. Periodische Wirbel vermeidet Niederschlag der Perlen.
   3. Setzen Sie die handgehaltene Magnetplattenscheibe sicher ein. Warten Sie 2 min, bis sich die Perlen auf dem Boden jedes Brunnens ansammeln und sowohl die handgehaltene Magnetische Plattenscheibe als auch die Plattenmontage schnell über einem Waschbecken oder Abfallbehälter umkehren. Denken Sie daran, die handgehaltene magnetische Plattenscheibe zu verwenden, um die Perlen in den Brunnen zu halten.
   4. Fügen Sie 150 L Waschpuffer in jeden Brunnen und warten Sie 30 s, damit sich die Perlen auf der Unterseite ansammeln. Verwerfen Sie den Inhalt wie in Schritt 3.2.3. Fügen Sie dann 25 L universellen Assay-Puffer (im Kit vorgesehen) hinzu, gefolgt von 25 L vorbereiteten Standards, Proben und Kontrollen.
   5. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie für mindestens 60 min bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, mit konstantem Schütteln bei 500 Rpm. Alternativ über Nacht bei 4 °C bebrüten, lichtgeschützt, möglichst bei 500 Umdrehungen von 15.00 Uhr.
   6. Waschen Sie 2x durch Zugabe von 150 l Waschpuffer und warten Sie 30 s. Entsorgen Sie den Inhalt durch Einsetzen der handgehaltenen magnetischen Plattenscheibe. Warten Sie 2 min und invertieren Sie über ein Waschbecken oder einen Abfallbehälter.
   7. Sequenziell mit 25 l Detektions-Antikörpergemisch, gefolgt von 25 L Streptavidin-PE-Lösung bei Raumtemperatur für 30 min, versiegelt und lichtgeschützt, mit konstantem Schütteln bei 500 Umdrehungen pro Minute inkubieren. 2x zwischen Inkubationen waschen, wie in Schritt 3.2.6 beschrieben.
   8. Erhalten Sie die Messwerte. Fügen Sie 120 L Lesepuffer hinzu. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten 5 min bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, mit konstantem Schütteln bei 500 Umdrehungen von 15.00 Uhr. Führen Sie die Lesung auf einem Multiplexing-Assay-Reader aus. Passen Sie die Messparameter entsprechend jedem Analyten an.

Ergebnisse

Koronare, venöse Sinus und peripheres Blut wurden von 52 Patienten entnommen, die einer koronaren Angiographie unterzogen wurden (Abbildung 1) und eine hohe Prävalenz von Bluthochdruck und Dyslipidämie zeigten. Bei der klinischen Nachbeobachtung wurden 11 (21,1%) MACEs traten 6 Monate nach koronarer Angiographie auf: Tod (n = 1), Angina, die einen Krankenhausaufenthalt erfordert (n = 6), Myokardinfarkt (n = 2) und/oder Hinweise auf Herzinsuffizienz (n = 4)...

Diskussion

Die Blutentnahme aus der betroffenen Herzkranzgefäße kann schwierig sein. Manchmal ist die Herzkranzgefäße kaum zugänglich. In diesem Fall kann die Probenahme aus der venösen Sinus eine Alternative sein. Wir führten Validierungstests durch, in denen zirkulierende Biomarker in der Herzkranzgefäße mit venösen Sinus verglichen wurden, ohne signifikante Unterschiede. Die Leistung zirkulierender Biomarker wurde jedoch nur für koronare Proben validiert. Daher muss die Leistung von Biomarkern, die aus der venösen Si...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm