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摘要

受损的线粒体迁移和形态学涉及各种神经退行性疾病。提出的协议使用诱导多能干细胞衍生前脑神经元来评估线粒体迁移和遗传性痉挛性截瘫的形态。该协议允许沿斧子对线粒体贩运进行表征，并分析其形态，这将有助于神经退行性疾病的研究。

摘要

神经元对高能量有强烈的需求，以支持其功能。在人类神经元中观察到沿着斧子的线粒体传输受损，这可能导致各种疾病状态的神经退化。虽然研究活人类神经中的线粒体动力学具有挑战性，但这种模式对于研究线粒体在神经退化中的作用至关重要。本文介绍一个协议，用于分析前脑神经元的线粒体迁移和线粒体形态学，该词从人类诱导多能干细胞（iPSCs）中提取。iPSCs 使用成熟的方法分化为端脑谷氨酸神经元。神经元的线粒体被MitoTracker CMXRos染色，并且使用装有细胞培养箱的活细胞成像显微镜捕获斧子内的线粒体运动。使用带有"多Kymograph"、"生物格式导入器"和"宏"插件的软件对延时图像进行分析。生成线粒体传输的线粒体图，并从测速仪中读取反逆向线粒体的平均线粒体速度。在线粒体形态分析方面，利用ImageJ获得线粒体长度、面积和纵横比。总之，该协议允许沿斧子对线粒体贩运进行表征，并分析其形态，以促进神经退行性疾病的研究。

引言

线粒体运动和分布在满足极化神经元的可变和专门能量需求方面发挥着至关重要的作用。神经元可以延长极长的斧子，通过形成突触与目标连接，而突触对Ca2+缓冲和电电流需要高水平的能量。线粒体从索马到斧子的传输对于支持神经元的斧突和突触功能至关重要。空间和时空动态线粒体运动是通过快速的辅助体传输以每秒几微米的速度进行。

具体来说，运动或适配器蛋白，如激酶和dynein，参与沿着微管的快速细胞器传输，以控制线粒体2，3的运动。正常的神经元活动需要将新组装的线粒体从神经元索马正确传输到远端斧子（异端等向等同体传输），并将线粒体从远端斧子反向运输回细胞体（逆向传输）。最近的研究表明，不正确的线粒体分配与神经元缺陷和运动神经元退行性疾病4，5密切相关。因此，要剖析线粒体在神经退化中的作用，必须建立研究活文化中沿斧突运动的线粒体运动的方法。

在检查和分析线粒体的跟踪时，有两个主要挑战:（1） 从每个帧的背景识别线粒体，（2） 分析和生成每个帧之间的连接。在解决第一个挑战时，广泛使用荧光标记方法区分线粒体与背景，如MitoTracker染料或荧光融合线粒体靶向蛋白（例如mito-GFP）6、7、8的转染。为了分析帧之间的关联，在前面的研究9中描述了几种算法和软件工具。在最近的一篇论文中，研究人员比较了四种不同的自动化工具（例如，沃洛蒂、伊马里斯、wrMTrck和差异跟踪器），以量化线粒体传输。结果表明，尽管轨道长度、线粒体位移、运动持续时间和速度存在差异，但这些自动化工具适用于治疗后的运输差异。除了这些工具，一个集成插件"宏"为ImageJ（由Rietdorf和Seitz编写）已广泛用于分析线粒体传输11。此方法生成可用于分析线粒体运动（包括逆向和逆行方向的速度）的图形。

线粒体是高度动态的细胞器，在数量和形态上不断变化，以响应生理和病理条件。线粒体裂变和融合严格调节线粒体形态和平衡。线粒体裂变和融合之间的不平衡可诱发极短或长线粒体网络，从而损害线粒体功能，导致神经元异常活动和神经退化。受损的线粒体传输和形态涉及各种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症和遗传性痉挛性截瘫（HSP）12、13、14、15。HSP是一个异质的遗传性神经系统疾病组，其特征是皮质脊柱退化，随后未能控制下肢肌肉16、17。在这项研究中，iPSC衍生前脑神经元用于评估HSP中的线粒体迁移和形态。该方法为检查活培养体中神经元斧子的线粒体动力学提供了独特的范例学范式。

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研究方案

1. 从iPSC生成端脑谷氨酸神经元

注:用于维护iPSC及其分化为端脑谷氨酸神经元的详细协议与前面描述的18相似。在这里，介绍并强调了人类多能干细胞分化过程中的关键过程。

  1. 人类胚胎干细胞（hESC）培养基细胞（MEF）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分供器的培养iPSC，辅以成纤维细胞生长因子（bFGF，4纳克/mL）。
  2. 用消炎（1mg/mL）孵育3分钟后，将iPSC分离成小团块。然后，在 hESC 介质中培养 iPSC 聚集的悬浮物 4 天。参考此时间点，当 iPSC 作为挂起区域性开始时，如第 1 天 （D1）。每天更换媒体4天。
  3. 在 D5 中，在 200 x g离心后收集 iPSC 聚集，2 分钟，在神经诱导介质 （NIM） 中培养 3 天。通过每2天更换一半的介质，使细胞聚集在悬浮状态中聚集3天。将 DMH-1 （2 μM） 和 SB431542 （2 μM） 添加到 NIM 介质中，以提高神经诱导效率。
  4. 在 D8，在离心 200 x g后收集 iPSC 骨料 2 分钟，并让他们粘附在 6 孔板（每孔约 20–30 个集料）上，在 NIM 中用 10% FBS（或与层压涂层板）在 NIM 中过夜。第二天，删除旧介质，每 2 天更改为 NIM，直到 D17。
    注:在此期间观察到神经皮细胞的生成，该细胞由具有玫瑰花层结构的柱状细胞的形成所指示。
  5. 在D17，机械地分离菌落中心的神经皮间细胞（通过向菌落中心施加小压力直接解除）或酶（用去巴治疗）。将分离的神经皮质细胞转移到未处理的组织培养T25烧瓶中，其中含有8 mL的NIM，并加入B27（1x）、cAMP（1 μM）和IGF（10纳克/mL）。
    注:悬浮培养允许细胞形成神经球，这些神经球富含皮质投影神经祖子。
  6. D35 后，在多球体和 LDEV 上将神经球板在无生长因子基底膜基质（材料表）上涂覆 35 mm 玻璃底盘，以生成端膜谷氨酸神经元（皮质投影神经元）。在电镀之前，在37°C下用1mg/mL细胞分离溶液孵育2分钟，将神经球分离为小簇。
  7. 通过离心去除细胞分离溶液，并在1 mL的神经分化介质（NDM）中重新悬浮。玻璃底盘上的板状细胞（每盘100μL的介质中约5个簇），以使它们附着。然后，添加NDM（每盘1毫升）并培养含有B27（1x）、cAMP（1μM）、IGF（10纳克/mL）、hBDNF（10纳克/mL）和GDNF（10纳克/mL）的NDM中的细胞。
    注:小簇被镀，因为它们能很好地存活，并产生长投影神经元。或者，细胞可以分离和镀层，密度约为每盘20，000个细胞，以更好地分离。
  8. 通过免疫染色Tbr1和βIII-tubulin标记物来表征端脑谷氨酸神经元。

2. 沿端脑谷氨酸神经元的斧子线粒体迁移检查

  1. 预热 NDM 并打开荧光显微镜的培养箱，其设置为 37°C 和 5% CO2。
  2. 为了沿前脑神经元的斧头可视化线粒体，用50 nM红色荧光染料孵育神经元，在NDM中染色活细胞（例如MitoTracker CMXRos）中的线粒体3分钟，在37°C下。接下来，用加热的NDM清洗细胞2倍。神经元在NDM中孵育。
  3. 为了记录沿着斧突的线粒体传输，使用40x物镜使用荧光显微镜拍摄线粒体运动的延时图像。
    注:为了稳定培养，当细胞在培养箱中孵育20分钟后线粒体染色时，进行活细胞成像。
  4. 在相位场下，根据形态特征（直接从神经元细胞体中出现，恒定的细长神经质，无分枝）识别斧头。线粒体在异位（从细胞体到远端斧子）和逆行方向（从斧尾端到细胞体）中移动。要区分沿着斧突的线粒体运动方向，请清楚地识别神经元的细胞体。在此步骤中，将斧头聚焦相位场以减少光漂白。
  5. 区分细胞体和斧子后，调整线粒体在斧子中的暴露时间和焦点。然后，每 5 秒捕获一次在斧内内传输线粒体的传输，总持续时间为 5 分钟，产生 60 帧。随机捕获每个菜至少五个位置，每组重复3倍。

3. 皮质神经元线粒体迁移和形态的数据分析

注:使用图像分析软件（例如ImageJ或MetaMorph19）分析收集的线粒体传输数据。由于ImageJ是现成的，使用图像J使用多Kymograph、宏和分析粒子插件来分析线粒体传输和形态学。

  1. 使用 ImageJ 分析线粒体传输
    1. 在捕获线粒体运动时间的延时图像后，使用多Kymograph插件分析线粒体的速度和运动。图像保存为 .tiff 格式文件，由斐济软件按照先前报告的方法20进行分析。
    2. 下载斐济软件。下载分析线粒体移动速度所需的插件。下载生物格式包和Kymograph插件以及这四个.class插件，包括:多Kymograph.class，多倍Overlay.class，Stackdifference.类，和步行平均类（材料表）。将这些文件移动到斐济插件文件夹。下载"tsp050706.txt"插件到插件文件夹。当文件移动到插件文件夹时，重新启动斐济软件。
    3. 打开斐济软件。选择插件，然后导入.tiff系列的图像，通过生物格式导入器下生物格式。请确保在堆栈查看中选择标准图像J，选择"打开所有系列"，选中"自动缩放"，然后单击"确定"。记下图像的帧数和大小（以像素为单位）显示在图像顶部。
      注:每幅图像拍摄 60 帧。
    4. 考虑通过调整所有 60 帧的"图像"菜单下的亮度/对比度来使图像更清晰。
    5. 右键单击线工具以选择分段线，并绘制一条分段线，从像元体开始，到终端斧尾结束。通过在插件下选择多Kymograph来生成Kymograph。选择多Kymograph后，将提示选择线宽。确保这是一个奇数。为行宽选择1。此步骤后将生成图形。
      注: 可以从图形中读取几条重要信息。kymograph 的 y 轴是 60 帧的持续时间 （5 分钟）。x 轴表示所选轴线的位置。
    6. 在测速仪中使用对角线确定线粒体的运动方向（反逆、逆行或稳定）。例如，沿 y 轴向右向下移动的线表示逆向移动，沿 y 轴向左向下的线表示逆行移动。垂直线表示线粒体中没有运动。
    7. 使用斐济软件中的宏插件测量移动线粒体的距离、时间值和速度。转到插件 |宏 |安装 |tsp050607.txt.在图形仪上的线粒体运动轨迹上绘制一条分段线，并始终绘制从上级到下级区域（y 轴）的线。
    8. 绘制线条后，转到插件|宏 |从 tsp 读取速度。由于沿跟踪绘制了分段线，因此插件读取与直线对应的分段速度。
      注: 所有数据的单位是像素。dy 和是从起始点消耗的时间，dx 和表示在 x 轴中移动的线粒体的距离。dy 现在和dx 分别显示每个段的周期时间和移动距离。实际速度显示每个段的速度（现在/现在 dx）。平均速度表示线粒体移动的平均速度（dx 和/dy 和）。
    9. 通过测量刻度条，将dx的单位从像素更改为 μm，即像素（以 μm 为单位）的比例。通过测量图像中的刻度条，将像素到 μm 的距离单位转换为像素到μm。使用直线工具沿比例尺绘制一条线，并通过在"分析 "下选择"度量"来测量线的长度。在此实验中，将时间从像素更改为秒，为 1 像素 = 5 秒。
    10. 在电子表格文件中，计算平均速度并相应地标记逆行或逆行运动。平均逆行或逆行运动速度。
    11. 确定从kymograph的固定和活动线粒体的百分比。逆向或逆行移动线粒体被定义为在整个周期21期间从原点向前或向后移动5μm。线粒体在5分钟内移动不超过5μm，则被视为静止。
  2. 使用图像J线粒体形态分析
    注:通过使用 ImageJ 测量线粒体长度、面积和纵横比，确定线粒体形态。为此，请按照以下步骤操作。
    1. 为了分析线粒体长度和在斧内的区域，从ImageJ网站下载Straighten_.jar插件（见材料表），并将其移动到插件的文件夹。重新启动 ImageJ 软件。
    2. 通过"文件"下的打开函数打开图片，并使用"图像"下的"类型"将 32 位图像转换为 8 位。
    3. 沿斧子绘制一条分段线。在插件下选择"拉直"，并为"丝"/宽线宽度设置 50 像素。这将生成一个拉直的斧子。
    4. 在"图像"下调整阈值，并通过选择"区域|周边 |拟合椭圆 |形状描述符。
    5. 使用线函数测量比例尺，并通过填充像素的距离、知道距离和长度单位来设置"分析"下的比例。然后，选择"全局"以设置此比例设置。
    6. 使用"分析"下的"分析粒子"确定区域。提示参数为大小（像素^2） = 0.20=无穷大，循环 = 0.00=1.00，并显示 = 椭圆。选择显示结果。
      注: 测量将生成多个线粒体形态参数的结果，包括面积、周长、长度（主要）、宽度（次要）和纵横比 （AR）。还列出了相应的线粒体编号。
    7. 使用线粒体数除以斧尾长度计算每个斧子 （μm） 的线粒体数。

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结果

在这里，人类iPSCs被分化为端脑谷氨酸神经元，其特征是用Tbr1和βIII图布林标记进行免疫染色（图1A）。为了检查线粒体的同线体传输，这些细胞被红色荧光染料染色，并进行了延时成像。由于ImageJ是现成的，更容易获得，线粒体传输被进一步分析与"多Kymograph"和"宏"图像J插件，如图1所示。

线粒体运动有三种各自的状?...

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讨论

本文介绍了一种利用红色荧光染料和ImageJ软件分析神经元斧子线粒体迁移和形态的方法，为神经退行性疾病的斧子退化和线粒体形态学研究提供了独特的平台。该协议中有几个关键步骤，包括线粒体的染色、活细胞成像和分析图像。在这种方法中，使用荧光染料染色线粒体。由于人类iPSC衍生的神经元很容易从培养皿中分离，因此在培养皿中保留一些溶液并轻轻添加神经基质介质非常重要。洗涤可...

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披露声明

作者声明没有相互竞争的经济利益。

致谢

这项工作得到了痉挛性截瘫基金会、布雷泽基金会和NIH（R21NS109837）的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase Cell Detachment SolutionInnovative Cell TechnologiesAT104
Biosafety hoodThermo Scientific1300 SERIES A2
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA-7906
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02
CentrifugeThermo ScientificSorvall Legend X1R/ 75004261
CoverslipsChemiglass Life Sciences1760-012
Cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Serum-Free SupplementGemini400-160
Glass Bottom DishesMatTekP35G-0.170-14-C
9'' glass pipetesVWR14673-043
Glial derived neurotrophic factor (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparinSigmaH3149
Insulin growth factor 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Knockout Serum ReplacerGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoethanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Neurobasal mediumGibco21103-049
Non Essential Amino AcidsGibco11140-050
N2 NeuroPle Serum-Free SupplementGemini400-163
Olympus microscope IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Phase contrast microscopeOlympusCKX41/ IX2-SLP
6 well platesCorning353046
24 well platesCorning353047
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus MembraneMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDFMilliporeSCGVU10RE
Tbr1 antibody (1:2000)ChemiconAB9616
Trypsin inhibitorGibco17075029
50 ml tubesPhenixSS-PH50R
15 ml tubesPhenixSS-PH15R
T25 flasks (untreated)VWR10861-572
Plugins for softwares
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji softwarehttps://fiji.sc/
Kymograph Pluginhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html

参考文献

  1. Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
  2. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
  3. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
  4. Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
  5. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  6. Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
  7. Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
  8. Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948(2009).
  9. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  10. Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
  11. Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
  12. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  13. Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
  14. Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
  15. Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
  16. Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
  17. Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
  18. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321(2013).
  19. Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
  20. Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
  21. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  22. Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
  23. Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
  24. Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
  25. Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
  26. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  27. Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
  28. De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
  29. Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
  30. Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
  31. Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
  32. Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
  33. Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
  34. Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
  35. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1(2016).
  36. Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
  37. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
  38. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
  39. Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).

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