JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Нарушение митохондриального транспорта и морфологии участвуют в различных нейродегенеративных заболеваний. Представленный протокол использует индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов мозга для оценки митохондриального транспорта и морфологии в наследственной спастической параплегии. Этот протокол позволяет охарактеризовать митохондрийный оборот по аксонам и анализ их морфологии, что облегчит изучение нейродегенеративных заболеваний.

Аннотация

Нейроны имеют интенсивные потребности в высокой энергии для того, чтобы поддерживать свои функции. Нарушение митохондриального переноса вдоль аксонов наблюдается в человеческих нейронов, которые могут способствовать нейродегенерации в различных состояниях болезни. Хотя это сложно изучить митохондриальной динамики в живых человеческих нервов, такие парадигмы имеют решающее значение для изучения роли митохондрий в нейродегенерации. Описано здесь протокол для анализа митохондриального транспорта и митохондриальной морфологии в аксонах нейронов предмозга, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). IPSCs дифференцированы в теленецефалические глутаметергические нейроны с использованием устоявшихся методов. Митохондрии нейронов окрашены MitoTracker CMXRos, а митохондриальные движения в аксонах фиксируются с помощью живого изображения микроскопа, оснащенного инкубатором для клеточной культуры. Изображения замедленного анализа анализируются с помощью программного обеспечения с помощью плагинов "MultiKymograph", "Bioformat importer" и "Macros". Сгенерированы гирографы митохондриального транспорта, а средняя митохондриальная скорость в антероградских и ретроградных направлениях считывается с кимографа. Что касается анализа митохондриальной морфологии, митохондриальной длины, области и соотношения сторон получаются с помощью ImageJ. Таким образом, этот протокол позволяет охарактеризовать митохондриальный оборот вдоль аксонов и анализ их морфологии для облегчения исследований нейродегенеративных заболеваний.

Введение

Митохондриальная подвижность и распределение играют жизненно важную роль в выполнении переменных и специализированных энергетических требований в поляризованных нейронах. Нейроны могут расширять очень длинные аксоны, чтобы соединиться с целями через образование синапсов, которые требуют высоких уровней энергии для буферизации Ca2 и ионных токов. Перенос митохондрий от сомы к аксону имеет решающее значение для поддержки аксональной и синаптической функции нейронов. Пространственно и временно динамическое митохондриальное движение осуществляется быстрым аксональным транспортом со скоростью несколько микрометров всекунду 1.

В частности, моторные или адаптерные белки, такие как кинезин и динейн, участвуют в быстром переносе органелл ы вдоль микротрубок, чтобы контролировать движение митохондрий2,3. Нормальная нейрональная активность требует надлежащей транспортировки вновь собранных митохондрий от нейрональной сомы к дистальной аксон (антероградный аксональный транспорт) и обратной транспортировки митохондрий из дистального аксона обратно в клеточное тело (ретроградный транспорт). Недавние исследования показали, что неправильное распределение митохондрий тесно связано с дефектами нейронов и двигательных нейронных дегенеративных заболеваний4,5. Поэтому, чтобы вскрыть роль митохондрий в нейродегенерации, важно установить методы изучения митохондриального движения вдоль аксонов в живых культурах.

Существует две основные проблемы в изучении и анализе отслеживания митохондрий: (1) выявление митохондрий от фона в каждом кадре, и (2) анализ и генерация связей между каждым кадром. При решении первой задачи широко используется подход к маркировке флуоресценции для разграничения митохондрий от фона, таких как краситель MitoTracker или трансфекция флуоресценции, слитого митохондриального прицеливания белка (например, мито-ГФП)6,7,8. Для анализа связи между кадрами, несколько алгоритмов и программных средств были описаны в предыдущих исследованиях9. В недавней работе исследователи сравнили четыре различных автоматизированных инструмента (например, Volocity, Imaris, wrMTrck и Difference Tracker) для количественной оценки митохондриального транспорта. Результаты показали, что, несмотря на расхождения в длине трека, митохондриальной смещения, продолжительности движения и скорости, эти автоматизированные инструменты подходят для оценки разницы в транспортировке после обработки10. В дополнение к этим инструментам, интегрированный плагин "Macros" для ImageJ (написано Rietdorf и Seitz) широко используется для анализа митохондриального транспорта11. Этот метод генерирует kymographs, которые могут быть использованы для анализа митохондриальных движений, в том числе скорости как в антероградных и ретроградных направлениях.

Митохондрии являются высокодинамическими органеллами, которые постоянно меняются в численности и морфологии в ответ как на физиологические, так и на патологические состояния. Митохондриальная расщепление и слияние жестко регулируют митохондриальную морфологию и гомеостаз. Дисбаланс между митохондриальным делением и слиянием может вызвать чрезвычайно короткие или длинные митохондриальные сети, которые могут ухудшить митохондриальную функцию и привести к аномальной нейронной деятельности и нейродегенерации. Нарушение митохондриального транспорта и морфологии участвуют в различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, и наследственной спастической параплегии (HSP)12,13,14,15. HSP является неоднородной группой наследственных неврологических расстройств, характеризующихся дегенерацией кортикоспинального тракта и последующей неспособностью контролировать мышцы нижних конечностей16,17. В этом исследовании, iPSC полученных предмозг нейронов используются для оценки митохондриального транспорта и морфологии в HSP. Этот метод обеспечивает уникальную парадигму для изучения митохондриальной динамики нейрональных аксонов в живых культурах.

протокол

1. Поколение теленецефалических глутаматергических нейронов от iPSCs

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол для поддержания iPSCs и их дифференциации в теленецефалических глутамергических нейронов аналогичны описанным ранее18. Здесь вводится и подчеркивается критический процесс при дифференциации плюрипотентных стволовых клеток человека.

  1. Культура iPSCs на мыши эмбриональной фибробласт (MEF) фифрыров в человеческой эмбриональной стволовых клеток (hESC) среде дополнены фактором роста фибробластов (bFGF, 4 нг/мл).
  2. После инкубации с dispase (1 мг/мл) в течение 3 мин, разъединить iPSCs в небольших сгустков. Затем, культура iPSC агрегатирует в подвеске в среде hESC в течение 4 дней. Обратитесь к этому временному пункту, когда iPSCs начинают как культуру подвески, как день 1 (D1). Изменение среды ежедневно в течение 4 дней.
  3. На D5, собирать агрегаты iPSC после центрифугации на 200 х г в течение 2 минут и культуры в нервной индукции средств (NIM) в течение 3 дней. Культура ячейки агрегатирует в подвеске в течение 3 дней, меняя половину средств массовой информации каждые 2 дня. Добавьте DMH-1 (2 мкм) и SB431542 (2 мкм) в NIM-среду для повышения эффективности нейронной индукции.
  4. На D8, собирать агрегаты iPSC после центрифугации на 200 х г в течение 2 мин и пусть они придерживаются 6 хорошо пластин (около 20-30 агрегатов на хорошо пластины) путем культивирования в НИМ с 10% FBS (или с ламинина покрытием пластин) на ночь. На следующий день, удалить старые среды и изменить на НИМ каждые 2 дня до D17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот период наблюдается генерация нейроэпителиальных клеток, на что указывает образование колоннарных клеток со структурами розетки.
  5. На D17, механически изолировать нейроэпителиальные клетки в центре колоний (подъем непосредственно путем применения небольшого давления в центре колоний) или ферментативно (лечение с диспазей). Передача изолированных нейроэпителиальных клеток в необработанную ткань культуры T25 колбу, содержащую 8 мл НИМ с добавлением B27 (1x), cAMP (1 мкм) и IGF (10 нг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культура подвески позволяет клеткам образовывать нейросферы, которые обогащаются корковой проекцией нейронных прародителей.
  6. После D35, пластины нейросфер на поли-орнитин и LDEV-бесплатно снижение фактора роста подвале мембранной матрицы (Таблица материалов) покрытием 35 мм стеклянные bottom dishes для генерации телецефалических глутамергических нейронов (кортикальная проекция нейронов). Перед покрытием, диссоциировать нейросферы на небольшие кластеры путем инкубации с 1 мг / мл раствор отслоения клеток в течение 2 мин при 37 градусов по Цельсию.
  7. Удалите раствор отслоения клеток центрифугированием и повторно притяните в 1 мл нейронной дифференциации среды (NDM). Плиты клетки на стеклянной нижней блюдо (около пяти кластеров в 100 л среднего на блюдо), чтобы позволить им прикрепить. Затем добавьте NDM (1 мл на блюдо) и культуры клеток в NDM, содержащих B27 (1x), cAMP (1 мкм), IGF (10 нг/мл), hBDNF (10 нг/мл), и GDNF (10 нг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие кластеры покрыты, потому что они хорошо выживают и приводят к длинным проекционным нейронам. Кроме того, клетки могут быть разобщены и покрыты при плотности около 20000 клеток на блюдо для лучшего разделения.
  8. Характеризуйте теленефалические глутаметергические нейроны, иммуностоинцев Tbr1 и ЗИИ-тубулин маркеров.

2. Изучение митохондриального переноса вдоль аксонов теленецефалических глутаматергических нейронов

  1. Разогрейте NDM и включите инкубатор для флуоресцентного микроскопа, установленного при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
  2. Чтобы визуализировать митохондрии вдоль аксонов нейронов переднего мозга, инкубировать нейроны с 50 НМ красный флуоресцентный краситель пятно митохондрий в живых клетках (например, MitoTracker CMXRos) в NDM в течение 3 мин при 37 градусов по Цельсию. Далее, мыть клетки 2x с разогретым NDM. Нейроны инкубируются в NDM.
  3. Для записи митохондриального транспорта вдоль аксонов, возьмите замедленное изображение митохондриального движения с помощью 40-кратной цели с флуоресцентным микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы стабилизировать культуру, выполнять живые изображения клеток, когда клетки инкубируются в инкубаторе в течение 20 минут после митохондриального окрашивания.
  4. Под фазовым полем идентифицируйте аксоны на основе морфологических характеристик (непосредственно возникают из нейронального клеточного тела, постоянных тонких длинных нейритов без ветвления). Митохондрии перемещаются в антерограде (от клеточного тела к дистальной аксон) и ретроградных направлениях (от аксонального терминала до клеточного тела). Различать направление митохондриального движения вдоль аксонов, четко определить клеточные тела нейронов. На этом этапе фокусааа аксонов под фазовым полем, чтобы уменьшить фотоотбеление.
  5. После различения клеточного тела и аксона, отрегулируйте время экспозиции и фокус митохондрий в аксонах. Затем, захват транспорта митохондрий в аксоны каждые 5 с в общей продолжительности 5 мин, что дает 60 кадров. Случайно захватить по крайней мере пять мест для каждого блюда и повторить 3x для каждой группы.

3. Анализ данных митохондриального транспорта и морфологии в корковых нейронах

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ собранных данных о митохондриальной транспортировке с помощью программного обеспечения для анализа изображений (например, ImageJ или MetaMorph19). Так как ImageJ легко доступен, выполнять анализ митохондриального транспорта и морфологии с помощью ImageJ с MultiKymograph, Макрос, и анализ частиц плагинов.

  1. Анализ митохондриального транспорта с помощью ImageJ
    1. После захвата замедленного изображения митохондриальной подвижности, проанализировать скорость и движение митохондрий с помощью плагина MultiKymograph. Изображения сохраняются как файлы формата .tiff, которые анализируются программным обеспечением Фиджи после ранее сообщенного метода20.
    2. Скачать программное обеспечение Фиджи. Скачать плагины, которые будут необходимы для анализа митохондриальной скорости перемещения от kymographs. Скачать Био-форматы пакет и Kymograph Plugin вместе с этими четырьмя плагинами .class, в том числе: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class, и WalkingAverage.class (Таблица материалов). Переместите эти файлы в папку плагинов Фиджи. Скачать плагины "tsp050706.txt" в папку плагинов. Перезапустите программное обеспечение Фиджи, когда файлы перемещаются в папку плагинов.
    3. Открытое программное обеспечение Фиджи. Выберите плагины,а затем импортировать изображения серии .tiff через Bio-Formats Importer под Био-форматами. Убедитесь в том, чтобы выбрать Стандартный ImageJ в стек просмотра,выбрать Открыть все серии, проверить Autoscale, а затем нажмите OK. Обратите внимание на количество кадров и размер изображений в пикселях, которые отображаются в верхней части изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 60 кадров на изображение.
    4. Рассмотрите возможность сделать изображения более четкими, регулируя яркость/контрастность в меню изображения для всех 60 кадров.
    5. Нажмите правой линии инструмент, чтобы выбрать сегментированную линию и нарисовать сегментированную линию, начиная с тела клетки и заканчивая на терминале аксон. Создайте kymograph, выбрав MultipleKymograph под плагинами. Выбор ширины линии подсказочен после выбора MultipleKymograph. Убедитесь, что это нечетное число. Выберите 1 для ширины линии. После этого шага образуется кимограф.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько важных частей информации можно прочитать из kymograph. Y-оси kymograph является время продолжительности (5 мин) для 60 кадров. Ось x-оси представляет положение выбранных аксонов.
    6. Используйте диагональ в kymograph для определения направления движения митохондрий (антероградных, ретроградных или стабильных). Например, линия, спускаясь вправо вдоль оси y, указывает на антироградное движение, а линия, спускаясь влево вдоль оси y, указывает на ретроградное движение. Вертикальная линия указывает на отсутствие движения в митохондрии.
    7. Измерьте расстояние, временные значения и скорость движущихся митохондрий с помощью плагина Macros в программном обеспечении Фиджи. Перейти к плагинам Макрос Установка tsp050607.txt. Нарисуйте сегментированную линию над следом митохондриального движения на kymograph, и всегда рисуйте линию от начальника к низшей области (y-оси).
    8. После рисования линии, перейдите к Плагины Макрос читать скорости из чайной ложки. Так как сегментированная линия вдоль трассы нарисована, плагин считывает сегментированные скорости, соответствующие линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Единица для всех данных является пикселей. dy сумма время, потребляемые от отправной точки, и dx сумма указывает расстояние митохондриона, движущегося в x-оси. dy now and dx теперь показывает время периода и расстояние движения для каждого сегмента, соответственно. фактическая скорость показывает скорость для каждого сегмента (dx сейчас / dy сейчас). средняя скорость указывает среднюю скорость для митохондриального перемещения (сумма dx/dy).
    9. Измените единицу dx теперь от пикселя к мкм, как соотношение пикселей в мкм, измеряя бар масштаба. Преобразуйте устройство на расстояние от пикселя до мм, измерив бары масштаба на изображениях. Используйте линейный инструмент, чтобы провести линию вдоль барной стойки масштаба и измерить длину линии, выбрав Measure' под "Анализ. Измените время от пикселя к секундам, как 1 пиксель и 5 секунд в этом эксперименте.
    10. В файле электронной таблицы вычислите среднюю скорость и соответственно обозначьте ретроградное или антероградное движение. Средняя скорость антероградного или ретроградного движения.
    11. Определите процент стационарных и подвижных митохондрий от кимографа. Антероградные или ретроградные движущиеся митохондрии определяются как движущиеся 5 мкм вперед или назад от происхождения в течение всего периода21. Митохондрии считаются неподвижными, если они не двигались более чем на 5 мкм в течение 5 минут.
  2. Анализ митохондриальной морфологии с использованием ImageJ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите митохондриальную морфологию путем измерения митохондриальной длины, области и соотношения аспектов с помощью ImageJ. Для этого выполните приведенные ниже шаги.
    1. Для того, чтобы проанализировать митохондриальной длины и области в аксоны, скачать Straighten_.jar плагин с веб-сайта ImageJ (см. Таблица материалов) и переместить его в папку плагинов. Перезапуск программного обеспечения ImageJ.
    2. Откройте изображение через открытую функцию под файлом и преобразуйте 32-битное изображение в 8 бит с помощью Type under Image.
    3. Нарисуйте сегментированную линию вдоль аксонов. Выберите выпрямить под плагины и установить 50 пикселей для ширины нити / Wide Line. Это будет генерировать выпрямленный аксон.
    4. Отрегулируйте порог под изображением и установите измерение под анализом, выбрав "Область Периметр и периметр Пригонка эллипса Дескрипторы формы.
    5. Измерьте панель масштаба, используя функцию линии и установите шкалу под Анализ, заполнив расстояние в пиксель, знайте расстояние,и единицу длины. Затем выберите Глобальный для установки этой шкалы.
    6. Используйте анализ частиц под анализом, чтобы определить область. Быстрые параметры: размер (пиксель-2) - 0,20-бесконечность, круговость - 0,00-1,00, а также отображение эллипсов. Выберите результаты отображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение даст результаты нескольких параметров митохондриальной морфологии, включая площадь, периметры, длина (основной), ширина (небольшая) и соотношение аспектов (AR). Также указан соответствующий митохондриальный номер.
    7. Рассчитайте митохондрийное число на аксон (мкм) с помощью митохондриального числа, разделенного на аксональную длину.

Результаты

Здесь, человека iPSCs были дифференцированы в теленецефалических глутамерных нейронов, которые были разработаны иммуно-пятно с Tbr1 и III тубулина маркеров (Рисунок 1A). Для изучения аксонального переноса митохондрий эти клетки были окрашены красным флуоресцентным ?...

Обсуждение

В этой статье описывается метод анализа митохондриального транспорта и морфологии в нейрональных аксонах с использованием красного флуоресцентного красителя и программного обеспечения ImageJ, оба из которых обеспечивают уникальную платформу для изучения аксональной дегенерации и мит...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом Спастик Параплегия, Фондом Блейзера и NIH (R21NS109837).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase Cell Detachment SolutionInnovative Cell TechnologiesAT104
Biosafety hoodThermo Scientific1300 SERIES A2
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA-7906
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02
CentrifugeThermo ScientificSorvall Legend X1R/ 75004261
CoverslipsChemiglass Life Sciences1760-012
Cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Serum-Free SupplementGemini400-160
Glass Bottom DishesMatTekP35G-0.170-14-C
9'' glass pipetesVWR14673-043
Glial derived neurotrophic factor (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparinSigmaH3149
Insulin growth factor 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Knockout Serum ReplacerGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoethanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Neurobasal mediumGibco21103-049
Non Essential Amino AcidsGibco11140-050
N2 NeuroPle Serum-Free SupplementGemini400-163
Olympus microscope IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Phase contrast microscopeOlympusCKX41/ IX2-SLP
6 well platesCorning353046
24 well platesCorning353047
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus MembraneMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDFMilliporeSCGVU10RE
Tbr1 antibody (1:2000)ChemiconAB9616
Trypsin inhibitorGibco17075029
50 ml tubesPhenixSS-PH50R
15 ml tubesPhenixSS-PH15R
T25 flasks (untreated)VWR10861-572
Plugins for softwares
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji softwarehttps://fiji.sc/
Kymograph Pluginhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html

Ссылки

  1. Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
  2. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
  3. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
  4. Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
  5. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  6. Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
  7. Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
  8. Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
  9. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  10. Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
  11. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  12. Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
  13. Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
  14. Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
  15. Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
  16. Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
  17. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
  18. Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
  19. Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
  22. Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
  23. Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
  24. Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
  25. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  26. Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
  27. De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
  28. Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
  29. Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
  30. Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
  31. Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
  32. Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
  33. Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
  34. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
  35. Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
  36. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
  37. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
  38. Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены