JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.

Abstract

נוירונים יש דרישות אינטנסיבי לאנרגיה גבוהה על מנת לתמוך בתפקודים שלהם. לקויי הובלה מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים נצפתה בנוירונים אנושיים, אשר עשויים לתרום נוירוניוון במצבי מחלה שונים. למרות שהוא מאתגר לבחון דינמיקה מיטוכונדריאלי בעצבים אנושיים חיים, תפיסות כאלה הן קריטיות ללימוד התפקיד של המיטו, בניוון שחור. המתואר כאן הוא פרוטוקול לניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה מיטוכונדריאלי בתאי המוח המוחזקים שמקורם האדם המושרה pluripotent תאים גזע (. IPSCs מובחנים לתוך הנוירונים telencephalic glutamatergic באמצעות שיטות מבוססות היטב. המיטוטור של הנוירונים מוכתם עם MitoTracker CMXRos, ותנועה מיטוכונדריאלי בתוך האקסונים נלכדים באמצעות מיקרוסקופ לחיות הדמיה מצויד בחממה לתרבות התא. תמונות בזמן קפיצה מנותח באמצעות תוכנה עם "MultiKymograph", "היבואן Bioformat", ו "מאקרו" תוספים. הקייגרפים של תחבורה מיטוכונדריאלי מופקים, ומהירות מיטוכונדריאלי ממוצעת בכיוונים המודרכים והנסיגה מקריאה מהקימוגרף. בנוגע לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלי, אורך מיטוכונדריאלי, אזור ויחס גובה-רוחב מתקבלים באמצעות ImageJ. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של המבנה שלהם כדי להקל על מחקרים של מחלות ניווניות.

Introduction

תנועתיות מיטוכונדריאלי והפצה ממלאים תפקיד חיוני במילוי הדרישות האנרגטיות המיוחדות בנוירונים מקוטטים. נוירונים יכולים להאריך אקסונים ארוכים מאוד כדי להתחבר עם מטרות דרך היווצרות של הסינפסות, אשר דורשים רמות גבוהות של אנרגיה עבור Ca2 + אגירה וזרמים יון. תחבורה של המיטו, מ סומה כדי אקסון הוא קריטי לתמיכה בתפקוד אקסון ו סינפטית של נוירונים. התנועה מיטוכונדריאלי דינמי באופן זמני מתנהל על ידי הובלה סיבי מהירה בשיעורי מיקרומטר מספר1לשנייה.

במיוחד, חלבונים מוטוריים או מתאם, כגון קינזין ו dynein, להשתתף בתחבורה ארגונית מהירה לאורך microtubules לשלוט על התנועה שלהמיטומטר 2,3. פעילות עצבית נורמלית דורשת העברה נאותה של המיטו, החדשים מתוך הנוירואליות החדשה (הובלה אקסון) והעברה הפוכה של המיטוטרים מן המרוחק בחזרה אל גוף התא (הובלה רטרוגרדית). מחקרים שנעשו לאחרונה ציינו כי הקצאת מיטוכונדריאלי לא ראויה קשורה בחוזקה עם פגמים עצביים ומחלות ניווניות תא מנוע4,5. לכן, כדי לנתח את התפקיד של המיטו, בניוון נוירולוגי, חשוב להקים שיטות לבדיקת תנועה מיטוכונדריאלי לאורך האקסונים בתרבויות חיות.

ישנם שני אתגרים עיקריים בבדיקת וניתוח מעקב אחר המיטו, (1) זיהוי המיטוטרים מהרקע בכל מסגרת, ו (2) ניתוח ויצירת הקשרים בין כל מסגרת. בפתרון האתגר הראשון, גישה תיוג פלואורסצנטית משמש באופן נרחב כדי להבחין המיטומטר מן הרקע, כגון מיטואו לצבוע או העברה של מיטוכונדריזה של התמזגו פלואורסצנטי (למשל, mito-gfp)6,7,8. לניתוח הקשר בין מסגרות, מספר אלגוריתמים וכלי תוכנה תוארו במחקרים קודמים9. בעיתון האחרון, החוקרים לעומת ארבעה כלים אוטומטיים שונים (למשל, Volocity, Imaris אריס, wrMTrck, וההבדל עוקב) כדי לכמת הובלה מיטוכונדריאלי. התוצאות הראו כי למרות אי-התאמות באורך המסלול, העקירה מיטוכונדריאלי, משך התנועה, ומהירות, אלה כלים אוטומטיים מתאימים להערכת הפרשי התחבורה לאחר הטיפול10. בנוסף לכלים אלה, תוסף משולב "מאקרו" עבור ImageJ (נכתב על ידי Rietdorf ו-Seitz) נעשה שימוש נרחב לניתוח הובלה מיטוכונדריאלי11. שיטה זו מייצרת קימוגרפים שניתן להשתמש בהם לניתוח תנועה מיטוכונדריאלי, כולל מהירות בכיוונים כוללים וכיווני נסיגה.

מיטוכונמיטוa הם אורגלות דינמיות ביותר, שמשתנים באופן קבוע במספר ובמבנה מתוך תגובה לתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. ביקוע מיטוכונדריאלי והיתוך בחוזקה להסדיר מורפולוגיה והומאוסטזיס. חוסר האיזון בין ביקוע מיטוכונדריאלי ופיוז'ן יכול לגרום לרשתות מיטוכונדריאליות קצרות או ארוכות במיוחד, שיכולות לפגוע בתפקוד מיטוכונדריאלי ולגרום לפעילות עצבית חריגה וניוון עצבי. הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, ו מצנח העיוותים תורשתי (hsp)12,13,14,15. Hsp היא קבוצה הטרוגנית של הפרעות נוירולוגיות תורשתית המאופיינת הניוון של corticospinal בדרכי והכשל הבאים לשלוט שרירי הגפיים התחתונות16,17. במחקר זה, הנוירונים הנגזרות iPSC מראש משמשים להערכת הובלה מיטוכונדריאלי מורפולוגיה ב HSP. שיטה זו מספקת פרדיגמה ייחודית לבדיקת דינמיקה מיטוכונדריאלי של האקאונים העצביים בתרבויות חיות.

Protocol

1. הדור של נוירונים telencephalic glutamatergic מ iPSCs

הערה: הפרוטוקול המפורט לשמירת iPSCs והבידול שלהם לתוך הנוירונים telencephalic glutamatergic דומים לאלה שתוארו בעבר18. כאן, התהליך הקריטי במהלך הבידול של תאי גזע האדם רב עוצמה מוצג ומודגש.

  1. תרבות iPSCs על העכבר מעובריים מתחלקים (MEF) מזינים בתא גזע האדם העובריים (hESC) בינונית בתוספת עם גורם הצמיחה פיברוהפיצוץ (bFGF, 4 ng/mL).
  2. לאחר דגירה עם dispase (1 מ"ג/mL) עבור 3 דקות, הנתק את iPSCs לתוך גושים קטנים. לאחר מכן, התרבות האגרגטים של iPSC בהשעיה במדיום hESC במשך 4 ימים. עיין בנקודת זמן זו, כאשר iPSCs מתחילות כתרבות ההשעיה, כיום 1 (D1). לשנות את המדיום מדי יום במשך 4 ימים.
  3. ב D5, לאסוף את האגרגטים iPSC לאחר צנטריפוגה ב 200 x g עבור 2 דקות ותרבות השראה עצבית מדיה (נים) במשך 3 ימים. התרבות מאגרגטים את התא בהשעיה במשך 3 ימים על ידי שינוי מחצית התקשורת כל יומיים. הוסף DMH-1 (2 μM) ו SB431542 (2 μM) כדי מדיום נים כדי להגדיל את יעילות האינדוקציה העצבית.
  4. ב D8, לאסוף את האגרגטים iPSC לאחר צנטריפוגה ב 200 x g עבור 2 דקות ולתת להם לדבוק 6 טוב צלחות (סביב 20 – 30 אגרגטים לכל טוב של הצלחת) על ידי CULTURING ב נים עם 10% fbs (או עם צלחות מצופה למינציה) לילה. ביום שלמחרת, להסיר את המדיום הישן ולשנות ל נים כל 2 ימים עד D17.
    הערה: הדור של תאים נוירואפיתל, אשר מצוין על ידי היווצרות של תאים טורי עם מבנים שושנת, הוא נצפתה בתקופה זו.
  5. בשעה D17, לבודד מכנית את התאים הנוירואפיתל במרכז המושבות (הסרת ישירות על ידי הפעלת לחץ קטן למרכז המושבות) או אנזימטי (מטופלים עם dispase). להעביר את התאים נוירואפיתל מבודדים לתרבות רקמה שאינה מטופלת T25 תרמוס המכיל 8 מ ל נים עם תוספת של B27 (1x), מחנה (1 μM), ו IGF (10 ng/mL).
    הערה: התרבות ההשעיה מאפשרת תאים ליצור נוירוספירות המועשרת עם ושלתי עצביים עצבית.
  6. לאחר D35, צלחת הנוירוספירות על פולי האורלים ו LDEV-מופחתת הצמיחה מופחת מטריצת ממברנה מטריצה (טבלה של חומרים)-מצופה 35 מ"מ זכוכית מנות התחתון כדי לייצר נוירונים telencephalic glutamatergic (הקרנת קליפת המוח נוירונים). לפני ציפוי, הנתק את הנוירוספירות לאשכולות קטנים על ידי הדגירה עם 1 mg/mL הניתוק התא פתרון עבור 2 דקות ב 37 ° c.
  7. הסר את פתרון הניתוק התא על-ידי צנטריפוגה והשהה מחדש 1 mL של בידול עצבי בינוני (NDM). תאים לוחית על המנה התחתונה זכוכית (סביב חמישה אשכולות ב 100 μL של בינוני לכל מנה) כדי לתת להם לצרף. לאחר מכן, להוסיף NDM (1 מ"ל לכל מנה) ותרבות התאים ב-NDM המכיל B27 (1x), מחנה (1 μM), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL), ו GDNF (10 ng/mL).
    הערה: אשכולות קטנים מצופים כי הם שורדים היטב ולתת נוירונים הקרנה ארוכה. לחילופין, תאים יכולים להיות מנוכה ומצופה בצפיפות סביב 20,000 תאים לכל מנה עבור הפרדה טובה יותר.
  8. אפיון הנוירונים telencephalic glutamatergic על ידי חיסוני מכתים את Tbr1 ו βIII טובולין סמנים.

2. בחינת הובלה מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים של נוירונים telencephalic glutamatergic

  1. לחמם את NDM ולהפעיל את החממה עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטית להגדיר ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  2. כדי להמחיש את המיטו, לאורך אקסונים של נוירונים במוח מוקדם, דגירה של הנוירונים עם 50 ננומטר לצבוע בצבעי פלורסנט אדום כדי כתם המיטומטר בתאים חיים (למשל, mitotracker cmxros) ב ndm עבור 3 דקות ב 37 ° c. לאחר מכן, שטוף תאים 2x עם החמם NDM. הנוירונים מודבטים ב-NDM.
  3. על מנת להקליט את ההובלה היטוכונדריאלי לאורך האקסונים, לקחת תמונות בזמן הקפיצה של תנועה מיטוכונדריאלי באמצעות מטרה 40x עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית.
    הערה: כדי לייצב את התרבות, בצע את הדמיה של התא החי כאשר התאים מודבטים בחממה עבור 20 דקות של כתמים מיטוכונדריאלי לאחר.
  4. תחת שדה שלב, לזהות את אקסונים מבוסס על מאפיינים מורפולוגיים (ישירות לצאת מהגוף הגוף העצבי, ארוך דק מאוד neurites ללא הסתעפות). המיטוa מהלך בתוך כיתה (מתא הגוף לתוך המחשב המרוחק) וכיווני נסיגה (ממסוף axon לגוף התא). כדי להבדיל בין הכיוון של תנועה מיטוכונדריאלי לאורך axons, לזהות בבירור את גופי התא של נוירונים. בשלב זה, למקד אקסונים תחת שדה שלב כדי להפחית את הלבנת התמונות.
  5. לאחר הבחנה את גוף התא ואת axon, להתאים את זמן חשיפה ומיקוד של המיטו, באקסונים. לאחר מכן, ללכוד את ההובלה של המיטו, בתוך אקסונים כל 5 s עבור משך כולל של 5 דקות, מניב 60 מסגרות. לכוד באופן אקראי לפחות חמישה מיקומים עבור כל מנה וחזור על 3x עבור כל קבוצה.

3. ניתוח נתונים של הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בנוירונים

הערה: לנתח את הנתונים שנאספו על הובלה מיטוכונדריאלי באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (למשל, ImageJ או התמרה19). מאחר ImageJ זמין בקלות, בצע ניתוח של הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה באמצעות ImageJ עם Multikymograph, פקודות מאקרו וניתוח תוספים של חלקיקים.

  1. ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי באמצעות ImageJ
    1. לאחר לכידת תמונות הזמן מעידה של תנועתיות מיטוכונדריאלי, לנתח את המהירות ואת התנועה של המיטו, באמצעות תוסף Multikymograph . התמונות נשמרות כקבצי תבנית. tiff, שנותחו על-ידי תוכנת פיג'י בעקבות שיטה20שדווחה קודם לכן.
    2. הורד את תוכנת פיג'י. הורד תוספים כי יהיה צורך לנתח מהירות הנעה מיטוכונדריאלי מ kymographs. הורד את חבילת ביו-פורמטים ואת התוסף kymograph יחד עם ארבעת אלה תוספים . Class , כולל: ריבוב, מחלקה, ריבוב. class, הפרש stackdifference class, ו WalkingAverage. class (רשימת חומרים). העבר קבצים אלה לתיקיית התוספים של פיג'י. הורד "tsp050706. txt" תוספים לתיקיה התוספים. הפעל מחדש את התוכנה של פיג'י כאשר הקבצים מועברים לתיקיית התוספים.
    3. פתח את תוכנת פיג'י. בחר תוספים, ולאחר מכן לייבא תמונות של סדרת. tiff באמצעות ביוגרפיה בפורמטים יבואן תחת תבניות ביו. הקפידו לבחור באפשרות ' ImageJ סטנדרטי ' בתצוגת אוסף, בחרו ' פתח את כל הסדרות', בידקו את ' קנה מידה אוטומטי' ולחצו על ' אשר'. שימו לב למספר המסגרת ולגודל התמונות בפיקסלים, המוצגים בחלק העליון של התמונה.
      הערה: קח 60 מסגרות לכל תמונה.
    4. שקול להפוך את התמונות ברורות על ידי התאמת בהירות/ניגודיות תחת תפריט תמונה עבור כל 60 מסגרות.
    5. לחצו לחיצה ימנית על כלי השורה כדי לבחור קו מקוטע וציירו קו מקוטע החל מגוף התא ומסתיימת ב-axon המסוף. צור את הקימוגרף על-ידי בחירת ריבוב מתחת לתוספים. בחירת רוחב הקו מוצגת לאחר בחירת ריבוב. ודא שזהו מספר אי-זוגי. בחר 1 עבור רוחב הקו. לאחר שלב זה נוצר קימוגרף.
      הערה: ניתן לקרוא מספר פיסות מידע חשובות מתוך הקימוגרף. ציר y של kymograph הוא זמן המשך (5 דקות) עבור 60 מסגרות. ציר ה-x מייצג את מיקומו של האקסונים שנבחרו.
    6. השתמש בקו אלכסוני ב-kymograph כדי לקבוע את כיוון התנועה של המיטואים (כיתה, נסיגה, או יציב). לדוגמה, שורה היורדת לימין לאורך ציר-y מציינת תנועה של כיתה, ושורה היורדת לשמאל לאורך ציר-y מצביעה על תנועת נסיגה. קו אנכי מצביע על כך שאין תנועה במיטופיוטס.
    7. למדוד את המרחק, ערכי זמן, ומהירות עבור המיטו, המעבר באמצעות תוסף פקודות מאקרו בתוכנת פיג'י. עבור לתוספים | פקודות מאקרו | התקנת | tsp050607. txtלצייר קו מקוטע על העקבות של תנועה מיטוכונדריאלי על kymograph, ותמיד למתוח את הקו מן העליון לאזור נחות (y-ציר).
    8. לאחר ציור הקו, עבור לתוספים | פקודות מאקרו | קרוא את המהירויות של כפית. מאז קו מקוטע לאורך העקבות מצויר, התוסף קורא המהירויות מקוטעת המתאימים לקו.
      הערה: היחידה עבור כל הנתונים היא פיקסלים. dy sum הוא הזמן הנצרך מנקודת ההתחלה, וסכום dx מציין את מרחק המיטו, הנעים בציר ה-x. dy עכשיו ו-dx מציג כעת את זמן התקופה ואת מרחק התנועה עבור כל קטע, בהתאמה. מהירות בפועל מראה את המהירות עבור כל פלח (dx עכשיו/dy עכשיו). מהירות ממוצעת מציינת את המהירות הממוצעת למעבר מיטוכונדריאלי (סכום dx/dy sum).
    9. שינוי יחידת dx כעת מפיקסל ל-יקרומטר כיחס של פיקסל ב-יקרומטר על-ידי מדידת סרגל הסרגל. המר את היחידה למרחק מפיקסל ל- יקרומטר על-ידי מדידת פסי קנה מידה בתמונות. השתמש בכלי קו כדי לצייר קו לאורך הסרגל סרגל ולמדוד את אורך הקו על ידי בחירת מדידה ' תחת "לנתח. שנה את השעה מפיקסל לשניות, כמו 1 פיקסל = 5 שניות בניסוי זה.
    10. בקובץ הגיליון האלקטרוני, לחשב את המהירות הממוצעת בהתאמה לנסיגה תווית או תנועה במקביל. ממוצע כיתות הכיוון או מהירות התנועה הרטרוגרדית.
    11. לקבוע את האחוז של המיטוגרפים מורצפת מתוך kymograph. כיתות הכיוון או המיטומטר הנעות מוגדרים כמעבר 5 יקרומטר קדימה או אחורה מהמקור במהלך התקופה כולה21. המיטומטר נחשבים נייחים אם הם לא זזים יותר 5 יקרומטר במהלך 5 דקות.
  2. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלי באמצעות ImageJ
    הערה: קביעת מורפולוגיה מיטוכונדריאלי על ידי מדידת אורך, אזור ויחס גובה מיטוכונדריאלי באמצעות ImageJ. לשם כך, בצע את השלבים שלהלן.
    1. על מנת לנתח את אורך ואזור מיטוכונדריאלי בתוך axons, להוריד את Straighten_. jar התוסף מאתר imagej (ראה טבלת חומרים) ולהעביר אותו לתיקיה של תוספים. הפעל מחדש את תוכנת ImageJ.
    2. פתח את התמונה באמצעות הפונקציה open תחת הקובץ והמר את התמונה 32 bit ל-8 סיביות באמצעות הסוג תחת תמונה.
    3. ציירו קו מקוטע לאורך האקסונים. בחר ' יישר תחת תוספים ' והגדר 50 פיקסלים לרוחב של קו להט/רוחב. . זה ייצור מגוון
    4. כוונן את הסף תחת התמונה והגדר את המדידה תחת ניתוח באמצעות בחירת "שטח | היקף | אליפסה מתאימה | מתארי צורה.
    5. מדדו את סרגל קנה המידה באמצעות הפונקציה line וקבעו את קנה המידה תחת ניתוח על-ידי מילוי המרחק בפיקסל, דע מרחק ויחידת אורך. לאחר מכן, בחרו ' כללי ' לקביעת הגדרת קנה המידה.
    6. השתמש בנתח חלקיקים תחת ניתוח כדי לקבוע את האזור. פרמטרי הבקשה הם גודל (פיקסל ^ 2) = 0.20 – אינסוף, מעגליות = 0.00 – 1.00, ולהציג = אליפסות. בחר תוצאות תצוגה.
      הערה: המדידה תניב את תוצאות הפרמטרים של מורפולוגיה מרובה מיטוכונדריאלי, כולל שטח, מטרים, אורך (מרכזי), רוחב (מינורי) ויחס גובה-רוחב (AR). מספר מיטוכונדריאלי המקביל מופיע גם הוא.
    7. חישוב מספר מיטוכונדריאלי לכל אקסון (μm) באמצעות מספר מיטוכונדריאלי המחולק באורך של אקסון.

תוצאות

כאן, האדם iPSCs היו מובחנים לתוך telencephalic glutamatergic נוירונים, אשר התאפיין בהכתמים חיסוני עם Tbr1 ו βIII טובולין סמנים (איור 1א). כדי לבחון את התחבורה האקונלית של המיטו, תאים אלה היו מוכתמים בצבע פלורסנט אדום, והדמיה זמן בוצע. מאז ImageJ הוא זמין וקל להשגה, הובלה מיטוכונדריאלי היה ...

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בדפוס עצבי באמצעות צבע פלורסנט אדום ותוכנת imagej, שניהם מספקים פלטפורמה ייחודית לחקר ניוון אקסונים ומורפולוגיה מיטוכונדרילית במחלות ניווניות. קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, כולל כתמים של המיטו, הדמיה של תאים חיים וניתוח התמו?...

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

העבודה הזאת נתמכת על ידי הקרן הפרספסטית, קרן בלייזר ו-NIH (R21NS109837).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase Cell Detachment SolutionInnovative Cell TechnologiesAT104
Biosafety hoodThermo Scientific1300 SERIES A2
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA-7906
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02
CentrifugeThermo ScientificSorvall Legend X1R/ 75004261
CoverslipsChemiglass Life Sciences1760-012
Cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Serum-Free SupplementGemini400-160
Glass Bottom DishesMatTekP35G-0.170-14-C
9'' glass pipetesVWR14673-043
Glial derived neurotrophic factor (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparinSigmaH3149
Insulin growth factor 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Knockout Serum ReplacerGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoethanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Neurobasal mediumGibco21103-049
Non Essential Amino AcidsGibco11140-050
N2 NeuroPle Serum-Free SupplementGemini400-163
Olympus microscope IX83OlympusIX83-ZDC2
PBSCorning21-031-CV
Phase contrast microscopeOlympusCKX41/ IX2-SLP
6 well platesCorning353046
24 well platesCorning353047
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus MembraneMilliporeSCGP00525
Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDFMilliporeSCGVU10RE
Tbr1 antibody (1:2000)ChemiconAB9616
Trypsin inhibitorGibco17075029
50 ml tubesPhenixSS-PH50R
15 ml tubesPhenixSS-PH15R
T25 flasks (untreated)VWR10861-572
Plugins for softwares
Bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
Fiji softwarehttps://fiji.sc/
Kymograph Pluginhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html

References

  1. Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
  2. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
  3. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
  4. Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
  5. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  6. Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
  7. Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
  8. Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
  9. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  10. Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
  11. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  12. Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
  13. Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
  14. Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
  15. Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
  16. Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
  17. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
  18. Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
  19. Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
  22. Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
  23. Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
  24. Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
  25. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  26. Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
  27. De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
  28. Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
  29. Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
  30. Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
  31. Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
  32. Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
  33. Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
  34. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
  35. Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
  36. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
  37. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
  38. Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156pluri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved