使用多盐皮下聚乙烯醇海绵植入和外向尾皮肤伤口模型进行急性伤口愈合评估。

摘要

这里描述了两个鼠伤愈合模型，一个旨在评估细胞和细胞因子伤口愈合反应，另一个用于量化伤口愈合率。这些方法可用于复杂的疾病模型，如糖尿病，以确定伤口愈合不良的各个方面的机制。

摘要

伤口愈合是一个复杂的过程，需要炎症、造粒组织形成、纤维化和解决的有序进展。毛林模型为这些过程提供了宝贵的机械洞察力;然而，没有一个模型完全解决伤口愈合反应的所有方面。相反，最好使用多个模型来解决伤口愈合的不同方面。在这里，描述了两种不同的方法来处理伤口愈合反应的不同方面。在第一个模型中，聚乙烯醇海绵被皮下植入鼠标多糖。在海绵回收后，细胞可以通过机械中断进行分离，流体可以通过离心提取，从而能够详细描述急性伤口环境中的细胞和细胞因子反应。此模型的一个局限性是无法评估伤口闭合率。为此，使用了尾皮肤切除模型。在此模型中，沿着尾部底部附近的背表面切除了 10 mm x 3 mm 矩形尾皮。该模型可以很容易地拍摄平面分析，以确定愈合率，并可以切除组织学分析。这两种描述的方法可用于基因改变的小鼠菌株，或与合并条件模型（如糖尿病、衰老或继发感染）结合使用，以阐明伤口愈合机制。

引言

有许多鼠模型系统可用于检查伤口愈合过程，每个系统具有特定的优点和限制^1，,2。以下方法提出了两种鼠伤模型，每个模型都涉及伤口愈合反应的特定方面，可用于识别损伤反应中扰动的因因和效果。伤口愈合的过程发生在不同的阶段。第一阶段是炎症，其特点是血小板、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞的迅速涌入，以及产生亲炎细胞因子和化学因子。炎症的解决后，环境过渡到一种更具弹性的状态，引入亲纤维和血管生成细胞因子和生长因子。造血组织沉积，新血管形成与肌纤维细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞的迁移。在最后阶段，临时细胞外基质进行改造，疤痕形成和伤口封闭进行²³2、3、4、5、6、7、8。^6,7,84,5,,,

没有一个鼠模型提供一个系统来研究伤口愈合的所有阶段^2。在这里，描述了两个手术伤口模型:一个阐明急性细胞和细胞因子伤口愈合反应，另一个允许评估伤口闭合以及组织分析。这两种方法可以以补充的方式用于评估扰动或合并症对伤口愈合反应不同方面的影响。聚苯乙烯醇（PVA）海绵的背皮下植入是一个系统，几十年来一直用于啮齿动物模型，阐明细胞和造粒组织反应的诸多方面^9,109、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20^{,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ，21，,22，,23，,24}.这种方法允许检索富含细胞因子的伤口液体和细胞渗透。在此模型中，1 厘米 x 1 厘米 x 0.5 厘米的 PVA 海绵通过后背背中线做出的 2 厘米切口放入皮下口袋。切口用手术夹闭合，以后可以取回海绵，用于细胞和流体隔离。分离海绵的细胞和细胞因子环境反映了急性伤口愈合的正常阶段，在植入后长达14天左右。在以后的时间点，该模型更有利于研究造粒组织的形成和异物反应^1。有了这个系统，可以分离>10⁶细胞，这为球形和功能测定和RNA分离提供了明显的优势，而不是从其他活检方法^{11，22，23，25，2622,23,25分离26}细胞。

使用尾皮切除模型确定伤口闭合率。在这个模型中，如Falanga等人最初描述，并由其他人报告^{27，28，29，30，28,29}一个1厘米x0.3厘米全厚的尾皮部分被去除附近的尾巴底部。^,3027伤口区域易于可视化，并可随时间测量。或者，尾组织可以分离进行组织分析。这种方法可以用作替代或结合成熟的背孔活检方法。这两种型号的主要区别是伤口闭合率、毛皮的存在或缺失以及皮肤结构^{2,2、31、32。,32}尾皮伤口提供了一个较长的时间框架来评估伤口关闭，因为它大约需要21天，完全关闭发生。这与未溅的背孔活检相反，这种活检愈合得更快（+7~10天），主要通过收缩引起的泛素性腺作用。溅条背孔活检愈合较慢，减少收缩愈合的影响，但依靠一个外国机构的存在来限制基于收缩的机制¹1，2，27，30，31，33。^{,2,27,30,31,33}

所述伤口模型对于了解在无扰动的情况下正常伤口愈合过程的信息量很大。虽然啮齿动物皮肤的愈合与人类皮肤有非常显著的差异，包括结构松散、依赖收缩愈合和其他解剖学差异，但鼠系为机械和筛选研究提供了某些优势。其中最重要的是近亲繁殖菌株和遗传突变体的可用性、遗传可得性和更低的成本。从鼠学研究中获得的机械学见解可以转化为更复杂的动物模型，更密切地模仿人类皮肤愈合，如猪系统^2,2，31。

除了检查伤口愈合反应在稳定状态，这些模型可以结合合并条件，以了解伤口愈合缺陷在细胞，细胞因子和毛组织水平的基础。正是在这个特殊环境中，两种模型可以协同评估特定合并症（如术后肺炎）对急性细胞伤口愈合反应和伤口闭合率^的影响。

研究方案

这里描述的所有动物研究都得到布朗大学机构动物护理和使用委员会的批准，并根据《国家卫生研究院动物护理和使用指南》进行。 注:在视频中，手术窗帘被省略用于演示目的。

1. PVA海绵的皮下植入

1. 使用剪刀将 PVA 海绵片切割成 8 毫米 x 8 毫米 x 4 毫米件。通过将 PVA 海绵碎片浸入无菌的 1x PBS 中，将其浸入烧杯中，使这些海绵重新补充水分。
2. 在 1x PBS 中高压海绵进行消毒，并完全冷却。在 4 °C 下将自灭海绵存放在无菌的 1x PBS 中。
3. 在进行手术植入之前，在层压流量罩无菌条件下，将必要数量的海绵分入无菌培养皿中。将多余的海绵存放在无菌的 1x PBS 中，温度为 4°C，供将来使用。补水后，确保海绵膨胀至 1 厘米 x 1 厘米 x 0.5 厘米。如图1A所示有脱水PVA海绵的图像。
   注:为了保持手术部位的无菌性，PVA海绵植入程序要求一个人处理小鼠并准备手术部位，第二人进行植入。
4. 麻醉8-12周大的男性C57BL/6J小鼠通过腹内注射80毫克/千克氯胺酮。为肛门口服40毫克/千克的木拉辛。 通过失去踏板反射确认麻醉深度。准备手术部位，通过去除头发沿多德姆与剪子。使用无菌纱布，将波维酮碘溶液涂在2倍的沙液中，然后施以70%乙醇。
5. 将鼠标放在无菌手术窗帘上。将加热垫放在手术窗帘下方，以保持鼠标的核心温度。
6. 戴上无菌手术手套进行手术。用钳子将背皮从底层组织拉开，并使用无菌手术剪刀，沿着背底中线向尾部底部约2厘米前约2厘米的切口进行切口。当用无菌钳子保持切口打开时，使用无菌弯曲的钝尖手术剪刀，在图1B所示的位置之一沿多香形成皮下口袋。
7. 继续使用钳子将皮肤从底层组织抬走。使用无菌手术剪刀，轻轻挤压培养盘中的一块 PVA 海绵，以去除多余的 PBS。用无菌手术剪刀从一个角落捡起PVA海绵，然后用剪刀的角，将海绵放入步骤1.4中形成的皮下口袋中。
8. 重复此过程 5 倍，将总共六块海绵放入皮下口袋，如图1B所示。
9. 用无菌钳子将切口背皮捏在一起，用两个不锈钢伤口夹关闭切口。
10. 每只老鼠使用一套新的无菌手术器械。或者，使用珠子消毒器对小鼠之间的仪器进行消毒。

2. 从 PVA 海绵中分离液体

1. 为了评估急性伤口细胞因子环境，在植入后1-14天之间分离海绵。
2. 通过将 5 mL 注射器的桶嵌套到 16 mL 培养管中，准备流体收集管。
3. 通过 CO₂窒息后使用植入 PVA 海绵对小鼠进行安乐死，然后进行宫颈脱位。
4. 取出手术钉，用齿性钳子打开切口。使用剪刀沿背道中线延伸切口。
5. 使用钳子，从皮下口袋中提取一块海绵，并将其转移到准备好的注射器桶中，小心尽量减少对海绵的压力。分离任何仍附着在海绵表面的结缔组织。如有必要，使用剪刀从周围组织解剖海绵。用剩余的海绵重复海绵去除过程。将装有海绵的管子放在冰上。
6. 要分离伤口液，请将含有 5 mL 注射器的培养管与海绵在 700 x g上离心 10 分钟。
7. 离心后，丢弃注射器和海绵。伤口液将收集到16 mL培养管中。图1D显示了从第7天伤口中收集的具有代表性的液体图像。将伤口液转移到干净的管中，在-80°C长期储存。

3. 从PVA海绵中分离细胞

1. 为了评估急性伤口愈合细胞环境，在海绵植入后1-14天之间收集海绵。植入后7天从伤口获得的海绵如图1E所示。
2. 制备含有 1x HBSS（+钙/=镁/+酚红色）的收集介质，辅以 1% FBS、1% HEPES 和 1% 青霉素链霉素。
3. 将 5 mL HBSS 收集介质的阿利quot5输入 15 mL 锥形管。
4. 从安乐死小鼠中提取PVA海绵，如2.2~2.4所述。将海绵放入含有 5 mL HBSS 收集介质的锥形管中。
5. 通过浇注将海绵和 HBSS 收集介质转移到 80 mL 搅拌机袋中。悬挂搅拌器从桨搅拌机的舱口，定位，使桨击中海绵和媒体。调整桨搅拌机的设置，在 60 s 高空运行。
6. 将介质从搅拌袋转移到15 mL锥形管与移液器，留下海绵在袋子。挤压海绵以彻底释放介质。调整桨搅拌机的设置，在高高时运行 30 s。将 5 mL 的介质添加到搅拌袋中，重复胃部过程 2 倍，总共进行三次海绵处理。
7. 将锥形管在 250 x g下离心 5 分钟。离心后，在圆锥管底部可以看到细胞和红血球的红色颗粒。
8. 丢弃上清液并进行红血球压网:将900μL的dH₂O添加到细胞颗粒和移液器中混合。用 100 μL 的 10x PBS 中和。将 4 mL 的 1x PBS 添加到管中，以完全中和套结塞，然后在 250 x g下离心 5 分钟。
   注:lysis 步骤应简短;让水与细胞接触超过3~5s，可能导致非红血球的收缩。
9. 离心后，圆锥管底部将存在一个含有无红血细胞的伤口细胞的白细胞颗粒。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在所需的介质中，以便进行下游分析。

4. 从PVA海绵伤口分离的先天白细胞的可选流动细胞学分析

1. 在含有10 μg/mL抗CD16/CD16/CD32 FCR®II/III抗体的2倍溶液中重新悬浮0.5×1 x10⁶个伤口细胞，在1倍PBS+ 1%BSA中稀释。
   注:所有抗体都应进行定化，以确定流细胞学分析的最佳浓度。
2. 用阻塞抗体在冰上孵育细胞10分钟。
3. 制作含有 2.5 mg/mL PerCP-eFluor710-Ly6G 的抗体 2x 主混合物，5 mg/mL 的 FITC-Ly6C、APC-Fire750-CD45.2、APC-R700-Siglec-F 和 10 mg/mL 的 eFluor660-F4-80 稀释 1 倍 = 1% BSA。直接加入25μL的抗体鸡尾酒的细胞孵化阻断抗体。
4. 在冰上孵育细胞20分钟，免受光的影响。
5. 用 1x PBS 清洗 2 倍的细胞。
6. 在 1x PBS 中，将胺反应性可修复的可活性染料-eFluor506 稀释 1:1，000 进行主组合。将细胞颗粒重新悬浮在50μL的可生存染料溶液中。
   注:血清必须排除在可修复的生存能力步骤之外，因为它可以防止染料与内源性蛋白质结合。在冰上孵育细胞20分钟，免受光的影响。
7. 用 1x PBS 清洗 2 倍的细胞。将细胞颗粒重新悬浮在50μL的1%甲醛中。
8. 用1%的副甲醛在冰上孵育15分钟，防止光。
9. 用 1x PBS 清洗细胞 1x，并在 1x PBS 中重新悬浮颗粒，以便进行流式细胞测量分析。

5. 尾皮切除

1. 麻醉8-12周大的男性C57BL/6J小鼠通过腹内注射80毫克/千克氯胺酮。为肛门口服40毫克/千克的木拉辛。通过失去踏板反射确认麻醉深度。
2. 使用无菌纱布将波维酮碘溶液2倍，然后一次应用70%乙醇，在麻醉小鼠尾部准备手术部位。
3. 在尾部的背面上定义一个 10 mm x 3 mm 的截面，从尾部底部（图 1C）处定义 10 mm x 3 mm 截面，使用永久标记从预制模板进行跟踪。
4. 将麻醉小鼠放在无菌手术窗帘上。
5. 戴上无菌手术手套进行外科手术。使用无菌手术刀刀片，沿伤口区域的右边缘、底部和左边缘进行全厚切口。
6. 使用无菌钳子，剥去被切除的皮肤从尾巴，并使用无菌手术剪刀切开伤口区域的顶部边缘。
7. 用无菌纱布施加压力以止血。
8. 在伤口床上涂上喷雾阻隔膜。
9. 定期拍摄固定距离的伤口。通过平面分析分析照片以确定伤口区域测量值。或者，使用卡钳获取伤口长度和宽度测量。

结果

PVA海绵植入后的全身炎症反应
PVA海绵植入手术产生了全身炎症反应，如伤伤1天后血浆中IL-6的诱导（图2A）。其他亲炎细胞因子，包括TNF-α和IL-1+，以及包括CCL2和CXCL1在内的一系列化学因子在PVA海绵植入后的前7天被系统诱导，并在其他地方描述了^{26，30。26,}

从PVA海绵伤口分离细胞和液体

讨论

本文介绍了两种可处理的鼠伤模型，可用于评估急性伤口愈合反应。第一种方法涉及在背皮皮空间中植入PVA海绵。这种方法比基于活检的伤口模型具有明显的优势，用于研究细胞伤口愈合反应，因为从分离海绵中获得的细胞数量和伤口液体数量众多。为了成功实施这一程序，通过彻底清洁切口周围的皮肤来维持无菌手术场势在必行，因为细菌在伤口中的易位将大大改变愈合过程。使用此处描述的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus	Genesee	28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red)	ThermoFisher Scientific	14025076
5ml Syringe	BD	309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750	BioLegend	109852	Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660	ThermoFisher Scientific	50-4801-82	Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC	BD Biosciences	553104	Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710	ThermoFisher Scientific	46-9668-82	Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700	BD Biosciences	565183	Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier	Braintree Scientific	NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm	Braintree Scientific	NC9334081
Blender Bag, 80mL	Fisher Scientific	14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100	Genesee Scientific	21-130
Fetal Bovine Serum - Standard	ThermoFisher Scientific	10437028
Fixable Viability Dye eFluor506	ThermoFisher Scientific	65-0866-14
Hepes Solution, 1M	Genesee Scientific	25-534
ImageJ Software	NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size	Ivalon/PVA Unlimited		www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10%	Fisher Scientific	3955-16
Spray barrier film, Cavilon	3M	3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V	Seward	0080/000/AJ