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  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

这里描述的是一种接近标记方法，用于识别尼科蒂亚娜本查米亚叶组织中NLR免疫受体的TIR域的相互作用伙伴。还提供了一个详细的协议，用于识别其他感兴趣的蛋白质之间的相互作用使用这种技术在尼科蒂亚纳和其他植物物种。

摘要

使用工程抗坏血球过氧化物酶（APEX）或大肠杆菌生物丁加体比拉（称为BioID）的接近标记（PL）技术已成功用于识别哺乳动物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。然而，基于APEX的PL对过氧化氢（H2O2）的要求、生物素（16~24小时）的孵育时间较长，以及基于BioID的PL的孵育温度（37°C）较高，严重限制了其在植物中的应用。最近描述的基于 TurboID 的 PL 解决了 BioID 和 APEX 的许多限制。TurboID 允许在室温 （RT） 条件下只需 10 分钟即可快速贴贴蛋白质标签。尽管 TurboID 的效用已在动物模型中得到证明，但我们最近发现，与 BioID 相比，基于 TurboID 的 PL 在植物中性能更好，用于标记接近感兴趣的蛋白质的蛋白质。此处提供了一个分步协议，用于使用核苷酸结合白氨酸富一种重复（NLR）蛋白质系列的N端收费/微素-1受体（TIR）域作为模型来识别蛋白质相互作用伙伴。该方法通过亲和力纯化，描述了生物微化蛋白的载体构造、蛋白质表达结构的农业渗透、生物结合处理、蛋白质提取和脱盐、定量和富集。这里描述的协议可以很容易地适应研究尼科蒂亚纳和其他植物物种感兴趣的其他蛋白质。

引言

PPI 是各种细胞过程的基础。识别PPI的传统方法包括酵母-双杂交（Y2H）筛查和免疫沉淀，加上质谱（IP-MS）1。1然而，两者都面临一些缺点。例如，Y2H 筛查要求提供目标植物或动物物种的 Y2H 库。这些图书馆的建设是劳动密集型和昂贵的。此外，Y2H方法在异质单细胞真核生物酵母中执行，这可能不代表高真核细胞的细胞状态。

相比之下，IP-MS在捕获瞬态或弱PPI方面效率较低，也不适合低丰度或高水性的蛋白质。植物信号通路中涉及的许多重要蛋白质，如受体状激酶（RLKs）或NLR系列免疫受体以低水平表达，并经常与其他蛋白质短暂相互作用。因此，它极大地限制了对这些蛋白质调节机制的理解。

最近，基于工程抗坏血球过氧化物酶（APEX）和突变大肠杆菌生物丁加体酶比拉R118G（称为BioID）的接近标记（PL）方法已经开发和用于PPIs2，3，4的研究。2,3,4PL的原理是，感兴趣的目标蛋白与酶融合，酶催化了生物仿生-AMP（生物-AMP）的形成。这些自由生物AMP由PL酶释放，并扩散到目标蛋白附近，允许在估计半径为10 nm5的初级胺处对近端蛋白进行生物微化。

与传统 Y2H 和 IP-MS 方法相比，此方法具有显著优势，例如捕获瞬态或弱 PPI 的能力。此外，PL 允许在其原生细胞环境中标记目标蛋白的近端蛋白。不同的PL酶在应用于不同的系统时有独特的缺点。例如，虽然APEX提供比BioID更高的标记动力学，并成功地应用于哺乳动物系统，但这种方法对过氧化氢（H2O2）的要求使其不适合植物的PL研究。

相反，基于 BioID 的 PL 避免了使用有毒的 H2O2，但标记速度很慢（需要 18-24 h 才能完成生物小化），从而使暂时性 PPI 的捕获效率降低。此外，BioID 高效PL所需的较高孵育温度（37 °C）给一些生物体（如植物4）带来了外部压力。7,8,因此，据报告，,在植物（即水稻原发体、阿拉比多普西和北本查米亚纳）中有限地部署基于BioID的PL。最近描述的TurboID酶克服了APEX和基于BioID的PL的不足，TurboID表现出高活性，使PL在RT10的10分钟内达到。基于TurboID的PL已成功应用于哺乳动物细胞、苍蝇和蠕虫10。最近，我们和其他研究小组独立优化和扩展了基于TurboID的PL用于研究不同植物系统中的PPI，包括N.本查米亚和阿拉迪多普西植物和番茄毛根11，12，13，14。11,12,13,14比较分析表明，与BioID11、14相比，TurboID14在植物中的PL性能更好。它还通过识别一些与NLR免疫受体11的新相互作用来证明基于TurboID的PL在植物中的鲁棒性，NLR免疫受体11是一种蛋白质，其相互作用伙伴通常很难用传统方法获得。

该协议通过描述N.本查米亚纳植物中NLR免疫受体的N端TIR域的相互作用蛋白的识别，从而说明了植物中基于TurboID的PL。该方法可以扩展到任何感兴趣的蛋白质在N.本查米亚纳。更重要的是，它为调查其他植物物种（如阿拉伯、番茄和其他）的PPI提供了重要参考。

研究方案

注: 方法的概述如图1所示。

1. 植物材料制备

  1. 在潮湿的土壤中高密度地生长N.本查米亚纳种子，并在16小时光（约75μmol/m2s）和8小时暗光周期在23~25°C的气候室中保持。
  2. 大约1周后，小心地将每只幼苗转移到4'x 4'盆中，并将幼苗放在同一室。
  3. 保持在室内的植物约4周，直到它们成长为4-8的叶子阶段，为随后的农业渗透15。

2. 建造涡轮ID融合

  1. 使用标准分子克隆技术生成目标蛋白与 TurboID （PCR TurboID 从添加基因质粒#107177） 的融合。在这里，我们使用NLR免疫受体的N终端TIR域作为感兴趣的目标蛋白，并在花椰菜马赛克病毒35S促进剂（p35S:TIR-TurboID）的控制下构建了TIR熔融到TurboID。
    注:将 TurboID 酶与目标蛋白的卡博基-终点或氨基内因融合将取决于感兴趣的蛋白质。通常，对于细胞质蛋白，只要TurboID融合不影响目标蛋白的功能，两种终点应该是可以接受的。然而，对于膜局部蛋白，在确定哪种终点体最适合 TurboID 融合之前，应提前确定蛋白质拓扑的特征。
  2. 在同一启动器下构建一个 TurboID 融合的仙音，作为后续定量蛋白体分析的控制。
    注:构建一个 TurboID 控件以识别与目标蛋白的蛋白近端非常重要。TurboID 融合控制应显示与 TurboID 融合目标蛋白类似的表达水平。这可以通过调整农业渗透过程中的农业细菌浓度来根据经验确定。此外，控制蛋白具有类似于目标蛋白的亚细胞定位模式也是很重要的。

3. 农业渗透

  1. 质粒向农业细菌的转化
    1. 加入0.5 μg的质粒产生从步骤2.1和2.2至50μL的农业细菌乳酸菌株GV3101能力细胞，制备如下所述的16。
      注:其他农业细菌菌株，如GV2260，也可以使用。
    2. 在冰上孵育30分钟。
    3. 在 42 °C 的 42°C 下水浴中加热冲击，温度为 60 s。
    4. 将400μL的LB介质（10克/升试管酮，5克/升酵母提取物，和10克/升NaCl;pH = 7.0）添加到农业细菌中，并在28°C孵育90分钟。
    5. 在LB agar上的管中盘整片，辅以适当的抗生素来选择质粒，以及用于农业细菌（GV3101:50毫克/L根卡霉素和50毫克/L里福霉素）。
    6. 在28°C下孵育板，36~48小时，直到个别菌落可见。
  2. 用抗生素将几个单独的菌落挑到新鲜的LB agar盘上（参见步骤3.1.5），并在28°C下过夜生长。
    注:执行菌落PCR以确认农业细菌中特定二元结构的存在更为最佳。根据我们的经验，超过95%的殖民地包含引入的二进制构造。
  3. 接种3 mL的LB介质加上适当的抗生素（见步骤3.1.4），其中含有感兴趣的构造，并在28°C过夜摇动，直到农细菌培养的OD600达到2.0。
  4. 将细胞在 3，000 x g下离心，并在农业渗透缓冲液（10 mM MgCl2、10mM MES [pH = 5.6]、250 μM 乙酰痛酮）中重新悬浮到 OD600 = 1.0。
    注:虽然在农业渗透之前在RT孵育2小时是最佳选择，但根据我们在GV3101菌株方面的经验，目标蛋白表达与无孵育之间并没有太大差异。
  5. 使用 1 mL 无针注射器在完全成熟的N. benthamiana 叶（轴旁）表皮中渗透。
    注:为三种生物复制准备足够数量的叶子材料:整个叶子通常被渗透，每株三片叶子被渗透，每个植物使用三到四株植物。对于每片叶子，1.5~2.0 mL重新悬浮的农细菌就足够了。
  6. 在36小时渗透后（hpi）后，将200μM生物素（在10 mM MgCl2溶液中）渗透到预渗透与TurboID结构的叶子中。
  7. 如第4节所述，在收获叶组织之前，将植物保持3~12小时。
    注:选择36 hpi用于生物tin渗透的原因是，根据以前的研究11，目标蛋白表达在这个时间点达到峰值。建议确定最佳表达感兴趣的目标蛋白所需的时间。生物蛋白渗透后的孵育时间取决于实验设计和研究中的目标蛋白。通常，3-12 h 的生物结合处理允许通过 TurboID 聚变标记大多数接近目标蛋白的蛋白质。

4. 叶样本收集

注:对于叶样品的后续处理，要戴上无菌手套，以避免样品的角蛋白污染。所有试剂也应尽可能不含角蛋白。

  1. 切掉小叶底部的渗入叶，取出叶静脉，然后用液氮对叶组织进行闪冻。
  2. 使用虫子和砂浆研磨叶组织，并将叶粉储存在15 mL或50mL猎鹰管中，温度为-80°C，以便随后使用。
    注:从不同植物的三种生物复制器中，每片叶子取三到四片。协议可以在这里暂停。在后续步骤之前，建议通过免疫布洛特分析评估目标蛋白的蛋白质表达和生物微化。典型的西方印迹如图2所示。

5. 提取叶总蛋白

  1. 将约0.35克叶粉转移到2 mL管。为每个样品准备两个管。
    注意:接触用液氮冷却的任何物体时，请戴上手套。
  2. 加入 RIPA 裂裂液缓冲液 700 μL（50 mM 三分-HCl [pH = 7.5]， 500 mM NaCl，1 mM EDTA，1% NP40 [v/v]，0.1% SDS [w/v]，0.5% 脱氧酸钠 [w/v]，1 mM DTT，1 片蛋白酶抑制剂鸡尾酒）到 0.35 克叶粉。
  3. 将管子旋涡10分钟。
  4. 将样品放在冰上 30 分钟。
  5. 每 4-5 分钟混合一次，将管子倒置几次。

6. 通过脱盐去除游离生物群

注:此部分大约需要 50 分钟。

  1. 平衡脱盐列。
    1. 拆下脱盐柱底部的消减器，将该柱置于 50 mL 管中。
    2. 在 1000 x g和 4 °C 下离心 2 分钟，将存储溶液拆下，并确保盖子松开。
    3. 将脱盐柱放入 50 mL 管中。用 5 mL RIPA 裂裂液缓冲液对柱 3x 进行平衡，每次在 1000 x g和 4 °C 下离心 2 分钟，并丢弃流通。
    4. 将脱盐柱转移到新的 50 mL 管中，并暂时储存在 4 °C 下，以便随后使用。
  2. 从步骤 5.4 旋转管在 16，500 x g和 4 °C 10 分钟，并将上清液从两个管转移到一个新的 2 mL 管。
  3. 将1，500 μL的蛋白质提取物添加到平衡脱盐柱树脂的顶部（从步骤6.1.4起）。当蛋白质提取物进入树脂时，再加入100μL的RIPA裂解缓冲液。
    注:虽然1，400μL的RIPA裂解缓冲液用于从叶子中提取蛋白质，但蛋白质提取和脱盐后的总体积总是比原始体积在一定程度上增加。因此，步骤 5.1 和 5.4 中描述的每个组样本的组合可为每个样品至少产生 1，500 μL 的蛋白质提取物。
  4. 在 1000 x g和 4 °C 下离心 2 分钟，将脱盐样品暂时留在冰上。

7. 使用布拉德福德测定对脱盐蛋白提取物的定量

  1. 制备每个梯度BSA溶液的50μL:0毫克/mL、0.2毫克/米拉、0.4毫克/米拉、0.6毫克/米拉、0.8毫克/米拉和1毫克/米拉。
  2. 将5μL样品与45μL的ddH2O混合，稀释脱盐蛋白提取物。
  3. 通过稀释 5x 布拉德福德原石（100 毫克库马西亮蓝色 G250，47 mL 甲醇，100 mL 85% 磷酸，53 mL ddH2O）制备 1x 布拉德福德摄政。
  4. 将每个梯度BSA溶液的50μL和50μL的稀释蛋白提取物添加到1x布拉德福德晶丽的2.5 mL中。
  5. 在RT孵育10分钟。
  6. 将每个样品的200μL溶液添加到ELISA板的一口井中（每个样品有三个技术复制）。
  7. 使用微孔板读取器测量 OD595。
  8. 根据梯度BSA溶液的值绘制标准曲线，并计算脱盐蛋白样品的浓度。通常，从0.7克叶子中获得的总蛋白质浓度在3~6毫克/米拉之间。
  9. 准备6~8毫克脱盐蛋白提取物，进行后续亲和力纯化。

8. 生物微量蛋白质的富集

  1. 将 200 μL 链球菌-C1 偶联磁珠放入 2 mL 管中。
  2. 在 RT 下，将链球菌-C1 偶联磁珠与 1 mL RIPA 裂裂缓冲液进行平衡 1 分钟。
  3. 每次清洗后，使用磁性架吸附珠 3 分钟，并通过移液轻轻去除溶液。
  4. 重复步骤 8.2 和 8.3。
  5. 将脱盐蛋白提取物转移到平衡链球菌-C1偶联磁珠。
  6. 在旋转器上以4°C孵育管12小时（或过夜），以亲和-纯化生物微化蛋白质。
  7. 在 RT 处将磁架上的珠子捕获 4 分钟，直到磁珠在管的一侧聚集，然后通过移液器轻轻去除上清液。
  8. 将 1.7 mL 的洗涤缓冲液 I（水中 2% SDS）添加到管中，并将其保持在 RT 的旋转器上 8 分钟。 重复步骤 8.3。
  9. 将 1.7 mL 的洗涤缓冲液 II（50 mM HEPES:pH = 7.5，500 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% 脱氧胆酸 [w/v]，1% Triton X-100）添加到管中，并将其保持在 RT 的旋转器上 8 分钟。
  10. 将 1.7 mL 的洗涤缓冲液 III（10 mM Tris-HCl:pH = 7.4、250 mM LiCl、1 mM EDTA、0.1% 脱氧胆酸 [w/v]、1% NP40 [v/v]）添加到管中，并将其保持在 RT 的旋转器上 8 分钟。 重复步骤 8.3。
  11. 加入 1.7 mL 的 50 mM Tris-HCl （pH = 7.5） 去除洗涤剂，然后重复步骤 8.3。
  12. 将珠子转移到新的 1.5 mL 管中，重复步骤 8.11 和 8.3。
  13. 在 RT 上用 50 mM 碳酸氢铵缓冲液将珠子洗涤 6x 5 分钟。
  14. 在磁珠中加入1 mL的50mM铵碳酸氢盐缓冲液，搅拌均匀。
  15. 去除100μL的珠子进行免疫斑点分析，以确认生物微量蛋白的富集。图3显示了典型的西方污点。
  16. 将其余蛋白质样品进行闪光冷冻，并储存在-80°C，或立即将其送去，用于干冰上的LC-MS/MS分析。
    注:典型 MS 结果显示在上一出版物中（张等人 2019 年;图 2、补充数据 1 和补充数据 2）11。使用标识符:MSV000083018 和 MSV000083019，在 MassIVE 上提供整个数据集（见于 ）。

结果

代表数据，说明基于所述协议的预期结果，改编自张等人11。图 1总结了在 N. benthamiana中执行基于 TurboID 的 PL 的过程。图2显示了渗透的N.本查米亚纳叶中的蛋白质表达和生物微化。图3显示，渗透叶片中的生物微化蛋白质有效富集，用于后续质谱分析。需要注意的是，使用链球菌-C1偶联磁珠浓缩生物?...

讨论

TurboID生物体蛋白连体酶是由基于酵母的基于酵母的定向进化产生的BioID10。它比其他PL酶有许多优点。TurboID 允许 PL 应用于其他模型系统，包括苍蝇和蠕虫，其最佳生长温度约为 25°C10。虽然PL方法在动物系统中得到了广泛的应用，但在植物中的应用是有限的。此处描述的协议为在N.benthamiana建立基于TurboID的PL提供了一个分步程序，该示范植物已广泛应用于?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了国家转基因科学技术计划（2019ZX080-003至Y.Z.）、中国国家自然科学基金（31872637至Y.Z.）和中央大学基础研究基金（2019TC028至Y.Z.）和NSF-IOS-1354434的资助， NSF-IOS-1339185 和 NIH-GM132582-01 到 S.P.D.K.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
721 SpectrophotometerMetash, made in ChinaQ/SXFZ6For OD600 measurement
Ammonium bicarbonateSigmaA6141-500G
BiotinSigmaB4639-1G50 mM Stock
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5702
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche11697489001
Deoxycholic acidSigmaD2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001For affinity purification
EDTASigmaE6758-500G
ELISA plateCorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P PVDF membraneMilliporeIPVH00010For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Low speed refrigerated centrifugeZonkia, made in ChinaKDC-2046For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O)SigmaM9272-500G
Magnetic rackInvitrogen123.21DFor bead adsorption
Multiskan FC Microplate PhotometerThermo Fisher ScientificN07710For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Rat anti-HARoche11867423001
Rotational mixerKylin-Bell Lab InstrumentWH-986For IP
Shock incubatorLabotery, made in ChinaZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Sodium deoxycholateSigmaD2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS)SigmaL4390-1KG
Streptavidin-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma baseSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Water-jacket IncubatorBlue pard, made in ChinaGHP-9080For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting ColumnThermo Fisher Scientific89893For removal of biotin

参考文献

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