Étiquetage de proximité basé sur TurboID pour l’identification dans planta des réseaux d’interaction protéines-protéines

Résumé

Décrit ici est une méthode d’étiquetage de proximité pour l’identification des partenaires d’interaction du domaine TIR du récepteur immunitaire NLR dans le tissu foliaire de Nicotiana benthamiana. Un protocole détaillé pour l’identification des interactions entre d’autres protéines d’intérêt utilisant cette technique à Nicotiana et d’autres espèces végétales est également fourni.

Résumé

Les techniques d’étiquetage de proximité (PL) utilisant l’acérétique peroxidase (APEX) ou escherichia coli biotin ligase BirA (connue sous le nom de BioID) ont été utilisées avec succès pour identifier les interactions protéines-protéines (IPP) dans les cellules des mammifères. Cependant, les exigences de peroxyde d’hydrogène toxique (H₂O₂) dans le PL basé sur APEX, le temps d’incubation plus long avec la biotine (16-24 h), et la température d’incubation plus élevée (37 oC) dans le PL basé sur BioID limitent sévèrement leurs applications dans les plantes. Le PL, récemment décrit par TurboID, traite de nombreuses limites de BioID et d’APEX. TurboID permet l’étiquetage de proximité rapide des protéines en seulement 10 minutes dans des conditions à température ambiante (RT). Bien que l’utilité de TurboID a été démontrée dans les modèles animaux, nous avons récemment montré que TurboID-basé PL effectue mieux dans les plantes par rapport à BioID pour l’étiquetage des protéines qui sont proximales à une protéine d’intérêt. Il est prévu ici un protocole étape par étape pour l’identification des partenaires d’interaction protéique à l’aide du domaine du récepteur N-terminal Toll/interleukin-1 (TIR) de la famille de protéines riches en leucine nucléotide-contraignante (NLR) comme modèle. La méthode décrit la construction vectorielle, l’agroinfiltration des constructions d’expression protéique, le traitement de la biotine, l’extraction et le desalting des protéines, la quantification et l’enrichissement des protéines biotinées par purification d’affinité. Le protocole décrit ici peut être facilement adapté pour étudier d’autres protéines d’intérêt pour Nicotiana et d’autres espèces végétales.

Introduction

Les IPP sont à la base de divers processus cellulaires. Les méthodes traditionnelles d’identification des IPP comprennent le dépistage et l’immunoprécipitation de levure-deux hybrides (Y2H) couplés à la spectrométrie de masse (IP-MS)¹. Cependant, les deux souffrent de certains inconvénients. Par exemple, le dépistage de L2H nécessite la disponibilité de la bibliothèque Y2H des espèces végétales ou animales cibles. La construction de ces bibliothèques est exigeante en main-d’œuvre et coûteuse. En outre, l’approche Y2H est effectuée dans la levure hétérologique d’organisme eucaryote à cellule unique, qui peut ne pas représenter le statut cellulaire des cellules eucaryotes supérieures.

En revanche, l’IP-MS montre une faible efficacité dans la capture des IPP transitoires ou faibles, et elle n’est pas adaptée aux protéines à faible abondance ou à haute hydrophobicité. De nombreuses protéines importantes impliquées dans les voies de signalisation végétale telles que les kinases récepteurs (RLKs) ou la famille NLR des récepteurs immunitaires sont exprimées à de faibles niveaux et interagissent souvent avec d’autres protéines de façon transitoire. Par conséquent, il restreint considérablement la compréhension des mécanismes sous-jacents à la régulation de ces protéines.

Récemment, des méthodes d’étiquetage de proximité (PL) basées sur l’ascorbate peroxidase (APEX) et un mutant Escherichia coli biotin ligase BirA^R118G (connu sous le nom de BioID) ont été développées et utilisées pour l’étude des IPP^2,3,4. Le principe de PL est qu’une protéine cible d’intérêt est fusionnée avec une enzyme, qui catalyse la formation de biotinyl-AMP labile (bio-AMP). Ces bio-AMP gratuits sont libérés par les enzymes PL et diffusent à proximité de la protéine cible, permettant la biotinylation des protéines proximales aux amines primaires dans un rayon estimé de 10 nm⁵.

Cette approche présente des avantages significatifs par rapport aux approches traditionnelles du Y2H et de la SPP, comme la capacité de saisir les IPP transitoires ou faibles. En outre, PL permet l’étiquetage des protéines proximales de la protéine cible dans leurs environnements cellulaires indigènes. Différentes enzymes PL ont des inconvénients uniques lors de leur application à différents systèmes. Par exemple, bien que l’APEX offre une cinétique de marquage plus élevée par rapport à BioID et est appliquée avec succès dans les systèmes de mammifères, l’exigence de peroxyde d’hydrogène toxique (H₂O₂) dans cette approche le rend impropre aux études de PL dans les plantes.

En revanche, le PL basé sur BioID évite l’utilisation du H₂O₂toxique, mais le taux d’étiquetage est lent (nécessitant 18-24 h pour compléter la biotinylation), ce qui rend la capture des IPP transitoires moins efficace. En outre, la température d’incubation plus élevée (37 oC) requise pour l’efficacité du PL par BioID introduit un stress externe à certains organismes, tels que les plantes⁴. Par conséquent, le déploiement limité de PL à base de BioID dans les plantes (c.-à-d. les protoplastes de riz, Arabidopsis et N. benthamiana) a été signalé^6,7,8,9. L’enzyme TurboID récemment décrite surmonte les carences de l’APEX et bioID-basé PL. TurboID a montré une forte activité qui permet l’accomplissement de PL dans les 10 minutes à RT¹⁰. Le PL à base de TurboID a été appliqué avec succès dans les cellules de mammifères, les mouches et les vers^10. Récemment, nous et d’autres groupes de recherche indépendamment optimisé et étendu l’utilisation de TurboID-basé PL pour étudier les IPP dans différents systèmes végétaux, y compris N. benthamiana et Arabidopsis plantes et les racines poilues tomate^11,12,13,14. Des analyses comparatives ont indiqué que TurboID obtient de meilleurs résultats pour le PL dans les usines par rapport à BioID^11,14. Il a également démontré la robustesse de TURBOID-basé PL dans planta en identifiant un certain nombre de nouvelles interactions avec un récepteur immunitaire NLR¹¹, une protéine dont les partenaires d’interaction sont généralement difficiles à obtenir en utilisant des méthodes traditionnelles.

Ce protocole illustre le PL à base de TurboID en planta en décrivant l’identification des protéines d’interaction du domaine TIR N-terminal du récepteur immunitaire NLR dans les plantes de N. benthamiana. La méthode peut être étendue à toutes les protéines d’intérêt dans N. benthamiana. Plus important encore, il fournit une référence importante pour l’étude des IPP chez d’autres espèces végétales telles que Arabidopsis,tomate, et d’autres.

Protocole

REMARQUE : Une vue d’ensemble de la méthode est indiquée à la figure 1.

1. Préparation des matériaux végétaux

1. Cultivez les graines de N. benthamiana dans un sol humide à haute densité et maintenez-les dans une chambre climatique avec une lumière de 16 h (environ 75 'mol/m²s) et 8 h photoperiod foncé à 23-25 'C.
2. Environ 1 semaine plus tard, transférer soigneusement chaque jeune semis à 4' x 4' pots et garder les semis dans la même chambre.
3. Maintenir les plantes dans la chambre pendant environ 4 semaines jusqu’à ce qu’elles poussent à un stade de feuille de 4-8 pour l’agroinfiltration ultérieure¹⁵.

2. Construction de fusions TurboID

1. Utilisez la technique de clonage moléculaire standard pour générer la fusion de la protéine cible avec TurboID (PCR TurboID de Addgene plasmid #107177). Ici, nous avons utilisé le domaine TIR N-terminal du récepteur immunitaire NLR comme protéine cible d’intérêt et construit TIR fusionné à TurboID sous le contrôle de la mosaïque de chou-fleur virus 35S promoteur (p35S::TIR-TurboID).
   REMARQUE : La fusion de l’enzyme TurboID au carboxyl-terminus ou à l’amino-terminus de la protéine cible dépendra de la protéine d’intérêt. Habituellement, pour une protéine cytoplasmique, les deux termini devraient être acceptables, tant que la fusion TurboID n’affecte pas la fonction de la protéine cible. Cependant, pour une protéine localisée à membrane, la topologie des protéines doit être caractérisée à l’avance avant de déterminer quel terminus est le meilleur pour la fusion TurboID.
2. Construire une citrine turboréfutée sous le même promoteur pour servir de contrôle pour une analyse protéomique quantitative ultérieure.
   REMARQUE : Il est important de construire un contrôle TurboID pour identifier le protéomome proximale à la protéine cible. Le contrôle de fusion TurboID devrait afficher un niveau d’expression similaire à celui de la protéine cible TurboID.fused. Ceci peut être déterminé empiriquement en ajustant la concentration d’Agrobacterium pendant l’agroinfiltration. En outre, il est important que la protéine de contrôle ait un modèle de localisation subcellulaire semblable à celui de la protéine cible d’intérêt.

3. Agroinfiltration

1. Transformation des plasmides en Agrobacterium
   1. Ajoutez 0,5 g des plasmides générés par les étapes 2.1 et 2.2 à 50 'L de cellules capables de souche GV3101 d’Agrobacterium tumefaciens, préparées comme indiqué précédemment¹⁶.
      REMARQUE : D’autres souches d’Agrobacterium, telles que GV2260, peuvent également être utilisées.
   2. Incuber sur la glace pendant 30 min.
   3. Choc thermique dans un bain d’eau à 42 oC pour 60 s.
   4. Ajouter 400 l de L de milieu LB (10 g/L tryptone, extrait de levure de 5 g/L et 10 g/L NaCl; pH et 7,0) à l’Agrobacterium et incuber à 28 oC pendant 90 min.
   5. Plaquez l’ensemble du contenu dans le tube sur LB agar complété par des antibiotiques appropriés pour sélectionner le plasmide, ainsi que pour l’Agrobacterium (pour GV3101: 50 mg/L gentamicine et 50 mg/L rifampicin).
   6. Plaques incubate à 28 oC pour 36-48 h jusqu’à ce que les colonies individuelles soient visibles.
2. Choisissez et striez plusieurs colonies individuelles sur une plaque d’agar LB fraîche avec des antibiotiques (voir étape 3.1.5) et poussez à 28 oC pendant la nuit.
   REMARQUE: Il est plus optimal d’effectuer la colonie PCR pour confirmer la présence de la construction binaire spécifique dans l’Agrobacterium. D’après notre expérience, plus de 95 % des colonies contiennent les constructions binaires introduites.
3. Inoculer 3 ml de LB moyenne plus antibiotiques appropriés (voir étape 3.1.4) avec la colonie d’Agrobacterium abritant la construction d’intérêt, et incuber en secouant pendant la nuit à 28 oC jusqu’à ce que l’OD₆₀₀ de la culture Agrobacterium atteigne 2,0.
4. Centrifuge les cellules à 3.000 x g et les réutiliser à_{OD 600} ' 1.0 dans le tampon d’agroinfiltration (10 mM MgCl₂, 10 mM MES [pH - 5.6], 250 'M acétosyringone).
   REMARQUE : Bien qu’il soit optimal d’incuber l’inoculum pendant 2 h à RT avant l’agroinfiltration, dans notre expérience avec la souche GV3101, il n’y a pas eu une grande différence entre l’expression de protéine cible avec vs. sans incubation.
5. Utilisez une seringue sans aiguille de 1 mL pour infiltrer l’inoculum dans l’épiderme (abaxial) des feuilles de N. benthamiana entièrement matures.
   REMARQUE : Pour préparer une quantité suffisante de matériaux foliés pour trois répliques biologiques : une feuille entière est habituellement infiltrée, trois feuilles sont infiltrées par plante, et trois à quatre plantes sont utilisées pour chaque construction. Pour chaque feuille, 1,5 à 2,0 ml d’agrobactéries résuspendées suffisent.
6. Après 36 h post-infiltration (hpi), infiltrer 200 m de biotine (dans la solution MgCl₂ de 10 mM) dans les feuilles pré-infiltrées avec des constructions TurboID.
7. Maintenir la plante pour 3 à 12 h supplémentaires avant de récolter le tissu foliaire tel que décrit à la section 4.
   REMARQUE: La raison de choisir le 36 hpi pour l’infiltration de biotine est que l’expression protéique cible culmine à ce moment-là selon les études précédentes¹¹. Il est conseillé de déterminer le temps nécessaire pour l’expression optimale de la protéine cible d’intérêt. L’infiltration post-biotine en temps d’incubation dépend de la conception expérimentale et de la protéine cible à l’étude. Habituellement, 3 à 12 h de traitement de biotine permet l’étiquetage de la plupart des protéines proximales à la protéine cible par les fusions TurboID.

4. Collecte d’échantillons de feuilles

REMARQUE : Pour le traitement ultérieur des échantillons de feuilles, portez des gants stériles pour éviter la contamination par la kératine des échantillons. Tous les réactifs doivent également être aussi exempts de kératine que possible.

1. Couper les feuilles infiltrées à la base du pétiole, enlever la veine des feuilles, puis congeler le tissu foliaire dans de l’azote liquide.
2. Broyer le tissu foliaire à l’aide d’un pilon et un mortier et conserver la poudre de feuilles dans des tubes de faucon de 15 ml ou de 50 ml à -80 oC pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE : Prenez trois à quatre morceaux de feuilles pour chacune des trois répliques biologiques de différentes plantes. Le protocole peut être mis en pause ici. Avant les étapes ultérieures, il est recommandé d’évaluer l’expression des protéines et la biotinylation de la protéine cible par des analyses d’immunoblot. Les taches typiques de l’Ouest sont indiquées dans la figure 2.

5. Extraction de protéines totales de feuilles

1. Transférer environ 0,35 g de poudre de feuilles dans un tube de 2 ml. Préparer deux tubes pour chaque échantillon.
   CAUTION : Portez des gants lorsque vous touchez un objet refroidi par de l’azote liquide.
2. Ajouter 700 l de tampon ripA lysis (50 mM Tris-HCl [pH - 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% de désoxycholate de sodium [w/v], 1 mM DTT, 1 comprimé de cocktail inhibiteur de la protéase) à 0,35 g de poudre de feuilles.
3. Vortex les tubes pendant 10 min.
4. Laisser les échantillons sur la glace pendant 30 min.
5. Mélanger le contenu toutes les 4 à 5 minutes en retournant les tubes à l’envers plusieurs fois.

6. Enlèvement de biotine gratuite par desalting

REMARQUE: Cette section prend environ 50 min.

1. Équilibrez la colonne dessalement.
   1. Retirez le scellant au bas de la colonne de désalting et mettez la colonne dans un tube de 50 ml.
   2. Retirez la solution de stockage par centrifugation à 1000 x g et 4 oC pendant 2 minutes et assurez-vous que le bouchon est desserré.
   3. Placez la colonne de dessalement dans un tube de 50 ml. Équilibrez la colonne 3x avec 5 ml de tampon de lyse RIPA, chaque fois centrifuger à 1000 x g et 4 oC pendant 2 minutes et jeter le flowthrough.
   4. Transférer la colonne de dessalement dans un nouveau tube de 50 ml et entreposer temporairement à 4 oC pour une utilisation ultérieure.
2. Tourner les tubes de l’étape 5.4 à 16.500 x g et 4 'C pendant 10 min et transférer le supernatant des deux tubes dans un nouveau tube de 2 mL.
3. Ajouter 1 500 l d’extrait de protéine au dessus de la résine de la colonne de dessalement équilibrée (de l’étape 6.1.4). Lorsque l’extrait de protéine pénètre dans la résine, ajouter un autre tampon de lyse de 100 L de RIPA.
   REMARQUE : Bien que 1 400 L de tampon de lyse RIPA aient été utilisés pour l’extraction de protéines des feuilles, le volume total après extraction et désalting de protéine a été invariablement augmenté dans une certaine mesure par rapport au volume original. Par conséquent, une combinaison des échantillons de chaque groupe tel que décrit dans les étapes 5.1 et 5.4 peut entraîner au moins 1500 l 'l d’extrait de protéine par échantillon.
4. Centrifugeuse à 1000 x g et 4 oC pendant 2 min et laisser temporairement les échantillons désaltés sur la glace.

7. Quantification des extraits de protéines desalted à l’aide d’un essai Bradford

1. Préparer 50 ll de chaque solution BSA gradient : 0 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL et 1 mg/mL.
2. Diluer l’extrait de protéine desalted en mélangeant un échantillon de 5 L avec 45 L de ddH₂O.
3. Préparer 1x Bradford régent en diluant le régent 5x Bradford (100 mg de Coomassie bleu brillant G250, 47 ml de méthanol, 100 ml d’acide phosphorique de 85%, 53 ml de ddH₂O).
4. Ajouter 50 ll de chaque solution BSA gradient et 50 l d’extrait dilué de protéine à la 2,5 ml de régent de 1x Bradford.
5. Incubate à RT pour 10 min.
6. Ajoutez 200 L de solution de chaque échantillon à un puits d’une plaque ELISA (trois répliques techniques par échantillon).
7. Mesurer l’OD₅₉₅ à l’aide d’un lecteur de microplates.
8. Dessinez la courbe standard en fonction de la valeur de la solution BSA gradient et calculez la concentration des échantillons de protéines désaltées. Habituellement, la concentration totale de protéines obtenue à partir de 0,7 g de feuilles varie de 3 à 6 mg/mL.
9. Préparer 6 à 8 mg d’extrait de protéine desalted pour la purification ultérieure de l’affinité.

8. Enrichissement des protéines biotinées

1. Prendre 200 L de perles magnétiques conjuguées streptocovidn-C1 dans un tube de 2 mL.
2. Équilibrez les perles magnétiques sreptavidn-C1-conjuguées avec 1 mL de tampon de lyse RIPA pendant 1 min à RT.
3. Après chaque lavage, utilisez la grille magnétique pour adsorb les perles pendant 3 minutes et retirez doucement la solution par tuyauterie.
4. Répétez les étapes 8.2 et 8.3.
5. Transférer l’extrait de protéine desalted aux perles magnétiques sptotrées-C1 étlibérées.
6. Incuber le tube à 4 oC pendant 12 h (ou toute la nuit) sur un rotateur pour purifier les protéines biotinyées.
7. Capturez les perles sur une grille magnétique pendant 4 minutes à RT jusqu’à ce que les perles s’accumulent d’un côté du tube, puis retirez doucement le supernatant par pipette.
8. Ajouter 1,7 ml de tampon de lavage I (2% SDS dans l’eau) au tube et le garder sur le rotateur à RT pendant 8 min. Répéter l’étape 8.3.
9. Ajouter 1,7 mL de tampon de lavage II (50 mM HEPES: pH - 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% d’acide désoxycholic [w/v], 1% Triton X-100) au tube et le garder sur le rotateur à la RT pendant 8 min.
10. Ajouter 1,7 mL de tampon de lavage III (10 mM Tris-HCl: pH - 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% d’acide désoxycholic [w/v], 1% NP40 [v/v]) au tube et le garder sur le rotateur à RT pour 8 min.
11. Ajouter 1,7 mL de 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) pour enlever le détergent, puis répéter l’étape 8.3.
12. Transférer les perles dans un nouveau tube de 1,5 mL et répéter les étapes 8.11 et 8.3.
13. Laver les perles 6x pendant 5 min chacune avec 50 mm ammonium bicarbonate tampon à RT.
14. Ajouter 1 ml de tampon de bicarbonate d’ammonium de 50 mM aux perles magnétiques et bien mélanger.
15. Retirez 100 L de perles pour l’analyse de l’immunoblote afin de confirmer l’enrichissement des protéines biotinyées. Une tache occidentale typique est indiquée dans la figure 3.
16. Congelez flash le reste des échantillons de protéines et entreposez à -80 oC ou envoyez-les immédiatement pour l’analyse LC-MS/MS sur la glace sèche.
    REMARQUE : Les résultats typiques de la SP sont affichés dans une publication précédente (Zhang et coll. 2019; Figure 2, Données complémentaires 1 et Données complémentaires 2)¹¹. L’ensemble des jeux de données sont disponibles sur MassIVE (trouvé à lt;http://massive.ucsd.edu-gt;) en utilisant l’identifiant: MSV000083018 et MSV000083019.

Résultats

Les données représentatives, qui illustrent les résultats attendus basés sur le protocole décrit, sont adaptées de Zhang et^coll. La figure 1 résume les procédures d’exécution turboID-basé PL dans N. benthamiana. La figure 2 montre l’expression et la biotinylation des protéines dans les feuilles infiltrées de N. benthamiana. La figure 3 montre que les protéines biotinyées da...

Discussion

Le ligase biotin TurboID est généré par l’évolution dirigée basée sur l’affichage de levure du BioID¹⁰. Il a de nombreux avantages par rapport à d’autres enzymes PL. TurboID permet l’application de PL à d’autres systèmes modèles, y compris les mouches et les vers, dont la température de croissance optimale est d’environ 25 oC¹⁰. Bien que l’approche PL ait été largement utilisée dans les systèmes animaux, son application dans les plantes est limi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
721 Spectrophotometer	Metash, made in China	Q/SXFZ6	For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate	Sigma	A6141-500G
Biotin	Sigma	B4639-1G	50 mM Stock
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5702
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11697489001
Deoxycholic acid	Sigma	D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT)	VWR Life Science	0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65001	For affinity purification
EDTA	Sigma	E6758-500G
ELISA plate	Corning	Costar 3590
HEPES	Sigma	H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M	Sigma	L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge	Zonkia, made in China	KDC-2046	For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma	M9272-500G
Magnetic rack	Invitrogen	123.21D	For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer	Thermo Fisher Scientific	N07710	For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630)	Sigma	I8896-100ML
Rat anti-HA	Roche	11867423001
Rotational mixer	Kylin-Bell Lab Instrument	WH-986	For IP
Shock incubator	Labotery, made in China	ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3
Sodium deoxycholate	Sigma	D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS)	Sigma	L4390-1KG
Streptavidin-HRP	Abcam	ab7403
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
Vortex	Scientific Industries	G-560E
Water-jacket Incubator	Blue pard, made in China	GHP-9080	For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column	Thermo Fisher Scientific	89893	For removal of biotin