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要約

ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。

要約

哺乳類細胞におけるタンパク質相互作用(PPI)の同定に、設計されたアスコルビンペルオキシダーゼ(APEX)または大腸菌ビオチンリガーゼBirA(BioID)を用いた近接標識(PL)技術が用いられています。しかし、APEXベースPLにおける有毒過酸化水素2(H2O2)、ビオチンによるインキュベーション時間(16~24時間)、およびBioIDベースPLの高インキュベーション温度(37°C)の要件は、植物への適用を厳しく制限しています。2最近説明した TurboID ベースの PL は、BioID と APEX の多くの制限に対応しています。TurboIDは室温(RT)条件の下でわずか10分の蛋白質の急速な近接標識を可能にする。TurboIDの有用性は動物モデルで実証されていますが、最近では、TurboIDベースのPLが、関心のあるタンパク質に近いタンパク質の標識に対するBioIDと比較して、植物において優れたパフォーマンスを発揮することを示しました。ここで提供される、ヌクレオチド結合性ロイシンリッチリピート(NLR)タンパク質ファミリーのN末端トール/インターロイキン-1受容体(TIR)ドメインをモデルとして用いたタンパク質相互作用パートナーの同定のためのステップバイステッププロトコルが提供される。この方法は、ベクター構築、タンパク質発現構築物のアグロインフィルトレーション、ビオチン処理、タンパク質抽出および脱塩、定量、およびアフィニティー精製によるビオチン化タンパク質の濃縮について説明する。ここで説明するプロトコルは、ニコチアナおよび他の植物種に関心のある他のタンパク質を研究するために容易に適応することができる。

概要

PPI は、さまざまな細胞プロセスの基礎です。PPIを同定するための伝統的な方法は、質量分析(IP-MS)1と結合した酵母ツーハイブリッド(Y2H)スクリーニングおよび免疫沈降法を含む。しかし、両方ともいくつかの欠点に苦しんでいます。例えば、Y2Hスクリーニングは、対象の植物または動物種のY2Hライブラリーの利用可能性を必要とする。これらのライブラリの建設は、労働集約的で高価です。さらに、Y2Hアプローチは、酵母の異種単細胞真核生物において行われ、これはより高い真核細胞の細胞状態を表さない可能性がある。

これに対し、IP-MSは、一過性または弱いPPIの捕捉効率が低く、また、存在量が少ないか疎水性の高いタンパク質には適していません。受容体様キナーゼ(RLKs)やNLRファミリーの免疫受容体などの植物シグナル伝達経路に関与する多くの重要なタンパク質は、低レベルで発現し、しばしば他のタンパク質と一過性に相互作用する。したがって、これらのタンパク質の調節の根底にあるメカニズムの理解を大幅に制限します。

近年、工学的アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)と変異型エシェリヒア・コリビオチンリガーゼBirAR118G(BioIDとして知られる)に基づく近接標識(PL)法が開発され、PPI2,3,43,4の2研究に利用されている。PLの原理は、目的の標的タンパク質が酵素と融合し、不安定なビオチンAMP(バイオAMP)の形成を触媒することです。これらの遊離バイオAMPは、PL酵素によって放出され、標的タンパク質の近傍に拡散し、10nm5の推定半径内の一次アミンにおける近位タンパク質のビオチン化を可能にする5。

このアプローチは、一時的な PPI や弱い PPI をキャプチャする機能など、従来の Y2H および IP-MS アプローチに対して大きな利点があります。さらに、PLは、天然の細胞環境における標的タンパク質の近位タンパク質の標識を可能にする。PL酵素の違いは、異なるシステムに適用する場合に固有の欠点を持っています。例えば、APEX は BioID と比較して高いタグ付け動態を提供し、哺乳類のシステムで正常に適用されますが、このアプローチでは有毒過酸化水素 (H2O2)の要件は、植物の PL 研究には適していません。

一方、BioIDベースのPLは有毒なH2O2の使用2を回避しますが、標識速度が遅く(ビビチン化を完了するのに18〜24時間を要する)ため、一過性のPPIのキャプチャの効率が低下します。また、BioIDによる効率的なPLに必要な高インキュベーション温度(37°C)は、植物4などの一部の生物に外部ストレスを導入する。したがって、植物におけるBioIDベースのPLの限定的な展開(すなわち、米のプロトプラスト、シロイヌナズナ、およびN.ベンタミアナ)は6、7、8、97,8,と報告されている。6最近説明したTurboID酵素は、APEXおよびBioIDベースのPL.TurboIDの欠乏を克服し、RT10で10分以内にPLの達成を可能にする高い活性を示した。TurboIDベースのPLは、哺乳類の細胞、ハエ、およびワーム10に正常に適用されています。最近、我々と他の研究グループは独立して最適化し、独立してN.ベンタミアナ植物とシロイヌナズナ植物とトマト毛深い根11、12、13、1411,12,13を含む異なる植物システムでPPIを研究するためのターボIDベースのPLの使用を14拡張しました。比較分析は、BioID11,14,14と比較して、植物のPLに対してTurboIDの方が優れていることが示された。また、従来の方法を用いて相互作用パートナーを得ることが通常困難であるNLR免疫受容体11との多数の新しい相互作用を同定することによって、プランタにおけるTurboIDベースのPLの堅牢性を実証した。

本プロトコルは、N.ベンタミアナ植物におけるNLR免疫受容体のN末端TIRドメインの相互作用タンパク質の同定を記述することによって、プランタにおけるTurboIDベースのPLを示す。この方法は、N.ベンタミアナの関心のあるタンパク質に拡張することができます。さらに重要なことは、シロイヌナズナ、トマトなどの他の植物種のPPIを調査するための重要な参考文献です。

プロトコル

注 : この方法の概要を図 1に示します。

1. 植物材料の準備

  1. N.ベンタミアナ種子を高密度で湿った土壌で栽培し、16時間光(約75μmol/m2秒)と23〜25°Cの8時間の暗い光周期を有する気候室で維持します。
  2. 約1週間後、慎重に4'x 4'ポットに各若い苗を転送し、同じチャンバーに苗を保ちます。
  3. 彼らはその後のアグロインフィルトレーション15のために4-8の葉の段階に成長するまで、約4週間のチャンバー内の植物を維持します。

2. ターボID融合の構築

  1. 標準的な分子クローニング技術を使用して、標的タンパク質とTurboID(アドジーンプラスミド#107177からPCR TurboID)の融合を生成します。ここでは、対象となる標的タンパク質としてNLR免疫受容体のN末端TIRドメインを用い、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(p35S::TIR-TurboID)の制御下でTurboIDに融合したTIRを構築した。
    注:標的タンパク質のカルボキシル末流またはアミノ末語に対するTurboID酵素の融合は、目的のタンパク質に依存します。通常、細胞質タンパク質の場合、TurboID融合が標的タンパク質の機能に影響を与えない限り、両方の末端が許容されるはずです。しかし、膜に局在するタンパク質の場合、TurboID融合に最適な末語を決定する前に、タンパク質トポロジーを事前に特徴付ける必要があります。
  2. 同じプロモーターの下でTurboID融合シトリンを構築し、その後の定量プロテオミクス解析の制御として機能します。
    注:標的タンパク質に近いプロテオームを同定するためのTurboID制御を構築することが重要です。TurboID融合制御は、TurboID融合標的タンパク質と同様の発現レベルを示す必要があります。これは、アグインフィルの中でアグロバクテリウム濃度を調整することによって経験的に決定することができる。また、コントロールタンパク質が目的とする標的タンパク質と同様の細胞内局在パターンを有することが重要である。

3. アグロインフィルトレーション

  1. プラスミドのアグロバクテリウムへの変換
    1. アグロバクテリウム・トゥメファシエンス株GV3101株のステップ2.1および2.2から50μLから生成されたプラスミドの0.5μgを加え、前述のとおりに調製した16個の能力のある細胞をGV3101株に調製する。
      注:GV2260などの他のアグロバクテリウム株も使用できます。
    2. 氷の上で30分間インキュベートします。
    3. 水浴中の熱ショックは42°Cで60s。
    4. 400 μLのLB培地(10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母エキス、10 g/L NaCl;pH = 7.0)をアグロバクテリウムに加え、28°Cで90分間インキュベートします。
    5. LB寒天のチューブ全体の内容をプレートプラスミドを選択するために適切な抗生物質を添加し、ならびにアグロバクテリウム(GV3101の場合:50 mg/Lゲンタマイシンおよび50mg/ Lリバンピシン)。
    6. 個々のコロニーが見えるまで36-48時間28°Cでプレートをインキュベートする。
  2. 抗生物質(ステップ3.1.5を参照)で新鮮なLB寒天プレート上にいくつかの個々のコロニーを選び、ストリークし、一晩で28°Cで成長します。
    注: コロニー PCR を実行して、アグロバクテリウム内に特定のバイナリ構造が存在することを確認する方が最適です。私たちの経験では、コロニーの95%以上が導入されたバイナリ構造を含んでいます。
  3. 3 mLのLB培地に適切な抗生物質(ステップ3.1.4を参照)を有するアグロバクテリウムコロニーを有し、28°Cで一晩揺れ、アグロバクテリウム培養のOD600が2.0に達するまでインキュベートする。
  4. 細胞を3,000 x gで遠心分離し、アグロインフィルトレーションバッファー(10 mM MgCl2,10mM MES [pH = 5.6],250 μM アセトシリンゴン)でOD600 = 1.0に再懸濁します。
    注:浸潤前のRTで2時間の接種をインキュベートするのに最適ですが、GV3101株の経験では、インキュベーションなしで標的タンパク質発現との間に大きな違いはありませんでした。
  5. 完全に成熟したN.ベンタミナ葉の(腹部)表皮に接種物を浸透させるために1mLの針なし注射器を使用してください。
    注:3つの生物学的複製のために十分な量の葉材料を調製するために:葉全体が通常浸潤され、植物ごとに3つの葉が浸透し、各構成体に3〜4個の植物が使用される。各葉に対して、1.5~2.0 mLの再懸濁されたアグロバクテリアで十分です。
  6. 36時間のポスト浸潤(hpi)の後、TurboIDコンストラクトで事前に浸潤した葉に200 μMビオチン(10 mMMgCl2溶液)を浸潤させます。
  7. セクション4で説明したように葉のティッシュを収穫する前に、追加の3-12時間のために植物を維持する。
    注:ビオチン浸潤のために36 hpiを選択する理由は、以前の研究11によると、この時点で標的タンパク質発現がピークに達するからである。目的の標的タンパク質の最適な発現に要する時間を決定することをお勧めします。インキュベーション時間ポストビオチン浸潤は、試験中の実験計画および標的タンパク質に依存する。通常、ビオチン処理の3〜12時間は、TurboID融合によって標的タンパク質に近いほとんどのタンパク質の標識を可能にする。

4. リーフサンプルコレクション

注:リーフサンプルの後続の処理のために、サンプルのケラチン汚染を避けるために無菌手袋を着用してください。すべての試薬は、可能な限りケラチンフリーである必要があります。

  1. ペチオールの基部に浸潤した葉を切り、葉の静脈を取り除き、次に葉組織を液体窒素でフラッシュフリーズさせる。
  2. ペスルとモルタルを使用して葉の組織を粉砕し、その後使用するために-80°Cで15 mLまたは50mLのハヤブサチューブで葉の粉末を保管します。
    注:異なる植物からの3つの生物学的複製のそれぞれのために葉の3〜4個を取ります。プロトコルはここで一時停止することができます。その後のステップに先立ち、免疫ブロット分析による標的タンパク質のタンパク質発現とビオチン化を評価することが推奨されます。一般的な西部のブロットを図 2に示します。

5. 葉の総タンパク質の抽出

  1. 約0.35gの葉粉を2mLチューブに移します。各サンプルに2本のチューブを用意します。
    注意:液体窒素で冷却された物体に触れる際は手袋を着用してください。
  2. RIPA ライシスバッファー (50 mM トリス HCl [pH = 7.5]) を 700 μL 追加します。 500 mM NaCl、 1 mM EDTA、 1% NP40 [v/v] , 0.1% SDS [w/v], 0.5% デオキシコール酸ナトリウム [w/v] , 1 mM DTT, 1 錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル) 0.35 g の葉粉。
  3. 10分間チューブを渦に入ります。
  4. サンプルを氷の上に30分間放置します。
  5. チューブを数回逆さまにして、4~5分ごとに内容物を混ぜます。

6. 脱塩による遊離ビオチンの除去

注: このセクションは約 50 分かかります。

  1. 脱塩カラムを平衡化します。
    1. 脱塩カラムの底部にあるシーラーを取り外し、50 mLチューブに入れます。
    2. 1000 x gで遠心分離して保管液を取り出し、2 分間 4 °C でキャップを緩めます。
    3. 脱塩カラムを50 mLチューブに入れます。カラム3xを5mLのRIPAライシスバッファーと平衡化し、そのたびに1000 x gで遠心し、4°Cで2分間遠心し、フロースルーを廃棄する。
    4. 脱塩カラムを新しい50 mLチューブに移し、その後使用するために4°Cで一時的に保管してください。
  2. ステップ5.4のチューブを16,500 x gおよび4°Cで10分間回転させ、2本のチューブから新しい2 mLチューブに上清を移します。
  3. 平衡脱塩カラムの樹脂の上部に1,500μLのタンパク質抽出物を加えます(ステップ6.1.4から)。タンパク質抽出物が樹脂に入り込んだら、RIPA溶出バッファーの 100 μL を追加します。
    注:1,400 μLのRIPAライシスバッファーが葉からのタンパク質抽出に使用されましたが、タンパク質抽出および脱塩後の総量は、元の体積に比べてある程度増加していました。したがって、ステップ5.1および5.4で説明されているように各群のサンプルを組み合わせて、サンプルあたり少なくとも1,500 μLのタンパク質抽出物を得ることができます。
  4. 遠心分離機は1000xgで、4°Cで2分間、脱塩したサンプルを一時的に氷の上に残します。 g

7. ブラッドフォードアッセイを用いた脱塩タンパク質抽出物の定量化

  1. 各勾配BSA溶液の50 μLを調製:0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、および1 mg/mL。
  2. 5 μL サンプルを 45 μL の ddH2O と混合して、脱塩したタンパク質抽出物を希釈します。
  3. 5xブラッドフォード摂政(クーマシーブリリアントブルーG250の100mg、メタノールの47 mL、85%リン酸の100 mL、ddH2Oの53 mL)を希釈することによって1xブラッドフォード摂政を準備します。
  4. 1xブラッドフォード摂液の2.5 mLに、各勾配BSA溶液50μLと希釈タンパク質抽出物50μLを加えます。
  5. RTで10分間インキュベートします。
  6. ELISAプレートの1つのウェル(サンプルあたり3つの技術的な複製)に各サンプルの溶液の200 μLを加えます。
  7. マイクロプレートリーダーを使用してOD595を測定します。
  8. 勾配BSA溶液の値に基づいて標準曲線を描画し、脱塩タンパク質サンプルの濃度を計算します。通常、0.7 gの葉から得られる総タンパク質濃度は3〜6mg/mLの範囲です。
  9. 6~8mgの脱塩タンパク質抽出物を調製し、その後の親和性精製を行います。

8. ビオチン化タンパク質の濃縮

  1. 200 μL のストレプトアビドン-C1 結合型磁気ビーズを 2 mL チューブに取り込みます。
  2. RTで1 mLのRIPAライシスバッファーでストレプトタビドン-C1結合磁気ビーズを平衡化します。
  3. 各洗浄後、磁気ラックを使用してビーズを3分間吸い付け、ピペットで溶液を静かに取り除きます。
  4. 手順 8.2 と 8.3 を繰り返します。
  5. 脱塩したタンパク質抽出物を平衡化ストレプトアビドン-C1-コンジュゲートされた磁気ビーズに移します。
  6. ビオチン化タンパク質を親和性精製するために、回転器上で4°Cで12時間(または一晩)チューブをインキュベートします。
  7. チューブの片側にビーズが集まるまでRTで4分間磁気ラックにビーズを取り込み、ピペットで上清をそっと取り出します。
  8. 1.7 mLの洗浄バッファーI(水中の2%SDS)をチューブに加え、8分間RTのローテーターに置いておきます。
  9. 1.7 mLの洗浄バッファーII(50 mM HEPES:pH = 7.5、500 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1%デオキシコール酸[w/v]、1%トリトンX-100)をチューブに加え、RTで8分間回転器に置いておきます。
  10. 1.7 mLの洗浄バッファーIII(10 mM Tris-HCl:pH = 7.4、250 mM LiCl、1 mM EDTA、0.1%デオキシコール酸[w/v]、1%NP40[v/v])をチューブに加え、8分間RTでローテーターに置きます。
  11. 1.7 mLの50 mM Tris-HCl(pH = 7.5)を加え、洗剤を取り除き、ステップ8.3を繰り返します。
  12. ビーズを新しい1.5 mLチューブに移し、ステップ8.11と8.3を繰り返します。
  13. RTで50mMの炭酸水素塩アンモニウムバッファーでビーズを5分間洗浄します。
  14. 50 mM の炭酸水素アンモニウムバッファーを 1 mL の磁気ビーズに加え、よく混ぜます。
  15. バイオチン化タンパク質の濃縮を確認するために、免疫ブロット分析用に100 μLのビーズを除去します。典型的なウェスタンブロットを図3に示します。
  16. 残りのタンパク質サンプルをフラッシュフリーズし、-80°Cで保存するか、ドライアイス上のLC-MS/MS分析のためにすぐに送ります。
    注: 一般的な MS の結果は、前の文書 (Zhang ら 2019;図2、補足データ1、および補足データ2)11.データセット全体は、識別子 MSV000083018 および MSV000083019 を使用して、MassIVE ( にあります) で使用できます。

結果

代表データは、記載されたプロトコルに基づいて期待される結果を示し、Zhangら11から適応される。図 1は、N. ベンタミアナで TurboID ベースの PL を実行する手順をまとめます。図2は、浸潤したN.ベンタミアナ葉におけるタンパク質発現およびビオチン化を示す。図3は、浸潤した葉のビオチン化?...

ディスカッション

TurboIDビオチンリガーゼは、ビオイド10の酵母ディスプレイベースの指向進化によって生成される。それは他のPL酵素よりも多くの利点を有する。TurboIDは、最適な成長温度が約25°C10であるハエやワームを含む他のモデルシステムにPLを適用することができます。PLアプローチは動物システムで広く使用されてきましたが、植物への応用は限られています。こ?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、国立トランスジェニック科学技術プログラム(2019ZX08010-003からY.Z.)、中国国立自然科学財団(31872637からY.Z.)、中央大学基礎研究基金(2019TC028からY.Z.)、NSF-IOS-1354444444444444444444444 NSF-IOS-1339185、およびNIH-GM132582-01からS.P.D.K.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
721 SpectrophotometerMetash, made in ChinaQ/SXFZ6For OD600 measurement
Ammonium bicarbonateSigmaA6141-500G
BiotinSigmaB4639-1G50 mM Stock
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5702
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche11697489001
Deoxycholic acidSigmaD2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001For affinity purification
EDTASigmaE6758-500G
ELISA plateCorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P PVDF membraneMilliporeIPVH00010For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Low speed refrigerated centrifugeZonkia, made in ChinaKDC-2046For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O)SigmaM9272-500G
Magnetic rackInvitrogen123.21DFor bead adsorption
Multiskan FC Microplate PhotometerThermo Fisher ScientificN07710For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Rat anti-HARoche11867423001
Rotational mixerKylin-Bell Lab InstrumentWH-986For IP
Shock incubatorLabotery, made in ChinaZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Sodium deoxycholateSigmaD2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS)SigmaL4390-1KG
Streptavidin-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma baseSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Water-jacket IncubatorBlue pard, made in ChinaGHP-9080For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting ColumnThermo Fisher Scientific89893For removal of biotin

参考文献

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