使用光明场显微镜定量拉瓦尔斑马鱼的肝脏大小

摘要

在这里，我们演示了一种量化幼虫斑马鱼肝脏大小的方法，提供了一种评估遗传和药理操作对肝脏生长和发育的影响的方法。

摘要

在肝细胞癌（HCC）的几个转基因斑马鱼模型中，在早期幼虫阶段可以观察到肝球菌。在斑马鱼HCC模型中量化幼虫肝大小提供了一种快速评估药物和其他操作对与基因相关的表型的影响的方法。在这里，我们展示如何修复斑马鱼幼虫，解剖肝脏周围的组织，使用明亮的显微显微镜拍摄肝脏，测量肝脏面积，并分析结果。该协议能够快速、精确地定量肝脏大小。由于这种方法涉及测量肝脏面积，它可能会低估肝脏体积的差异，并且需要补充方法来区分细胞大小的变化和细胞数的变化。本文描述的解剖技术是一个很好的工具，用于可视化肝脏、肠道和胰腺的自然位置，用于各种下游应用，包括免疫荧光染色和原位杂交。所述的量化幼肝大小的策略适用于肝脏发育和再生的许多方面。

引言

肝细胞癌（HCC）是肝脏¹最常见的原发性恶性肿瘤，是导致癌症相关死亡的第三大原因^2。为了更好地了解肝癌的机理和识别潜在的HCC治疗，我们和其他人已经开发出转基因斑马鱼，其中肝细胞特异性表达的肿瘤基因，如β-卡泰宁^3，4，克拉斯（V12）5，6，Myc^7，或Yap1⁸导致成年动物的HCC。在这些斑马鱼中，肝增增早在受精后6天（dpf），为测试药物和基因改变对卵基因驱动肝过度生长的影响提供了一个方便的平台。准确和精确测量幼虫肝大小对于确定这些操作的影响至关重要。

肝脏大小和形状可以半定量评估在固定斑马鱼幼虫由CY3-SA标签⁹或活斑马鱼幼虫使用肝细胞特异性荧光报告机和荧光解剖显微镜^5，6。后一种方法比较快，使用图像处理软件^7、10拍摄和测量每个肝脏的面积，可以解决其精度不足的问题。然而，在实验中统一定位所有活幼虫，使二维肝区准确表示肝脏大小，在技术上可能具有挑战性。一种类似的量化肝脏大小的技术包括使用光片荧光显微镜来量化幼虫肝体积^8，当肝脏在不同维度上不均匀地扩张时，这可能更准确检测大小差异。荧光活化细胞分拣（FACS）可用于计算幼肝^8、11中荧光标记肝细胞和其他肝细胞类型的数量。在这种方法中，幼虫肝被集中和分离，因此有关单个肝脏大小和形状的信息丢失。结合另一种肝大小测定方法，FACS 能够区分增加的细胞数（增生）和增加的细胞大小（肥大）。所有这些方法都采用昂贵的荧光技术（显微镜或细胞分拣机），除 CY3-SA 标签外，还需要用荧光报告器标记肝细胞。

在这里，我们详细介绍了使用明场显微镜和图像处理软件^{3，12，13，14}量化斑马鱼幼肝区域的方法。该协议允许在原位对单个肝脏区域进行精确定量，而无需使用荧光显微镜。在分析肝脏大小时，我们盲注图像特征，以减少研究者的偏见，提高^{科学严谨性}。

研究方案

动物研究按照犹他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序进行。

1. 修复幼虫

1. 在受精后3~7天（dpf），用三联甲甲烷酸酯（0.03%）对幼虫实施安乐死使用玻璃移液器和移液器泵在 2 mL 管中收集多达 15 个幼虫。
2. 用1mL的冷（4°C）1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）在冰上洗涤幼虫两次。每次清洗时，用玻璃移液器和移液器泵从管中取出尽可能多的液体，然后将 1 mL 的冷 PBS 添加到管中。
3. 使用玻璃移液器和移液器泵尽可能多地去除 PBS，并在 PBS 中加入 1 mL 的冷 （4°C） 4% 甲醛 （PFA）。
   注意:PFA是一种刺激性和可疑的致癌物质。处理 PFA 时应佩戴手套，集中溶液应在化学烟气罩中处理。
4. 在4°C孵育至少一夜之间（但长达数月），轻轻摇动。

2. 解剖肝脏周围的组织

1. 用1 mL的冷（4°C）PBS冲洗3x，并在冲洗之间摇动5分钟，从PFA中去除幼虫。
   注意:在 4°C 下将冲洗过的幼虫在 PBS 中保存一两天是可以的。
2. 将几根幼虫在PBS中放入一个9井圆底玻璃盘的一口井中。
3. 去除肝脏周围的皮肤。
   1. 使用细钳将幼虫放在其背上（腹部向上），尽可能轻轻地抓住头部的两侧。然后用非常精细的钳子在你的另一只手抓住皮肤刚刚覆盖心脏。
   2. 将皮肤沿对角线向下拉向鱼的尾部，将鱼的左侧或右侧的盘子底部拉下。对其他侧（右侧或左侧）重复上述步骤。
   3. 继续抓住皮瓣，拉下/后退，直到所有皮肤上或肝脏附近的黑色素被移除。
4. 取出蛋黄（如果存在）。
   1. 对于 5-6 dpf 幼虫，将鱼的背上用细钳的鱼放在一块中提起蛋黄，并使用非常精细的钳子轻轻抬高蛋黄。
   2. 对于 3⁄4 dpf 幼虫，将蛋黄切成碎片。将鱼背上用细腻的钳子抓住，用非常细的钳子从腹侧开始抚摸蛋黄。
5. 使用玻璃移液器和移液器泵将解剖的幼虫放入新鲜冷的PBS中。

3. 成像

1. 要安装幼虫，将几 mL 的 3% 甲基纤维素倒在干净的塑料培养皿的盖子上。
2. 使用玻璃移液器和移液器泵向甲基纤维素中添加幼虫，尽可能少地加入带幼虫的PBS。
3. 在低放大倍率的解剖显微镜下，用细钳来定位鱼，使其位于右侧，朝左。
   注:确保鱼的侧向正确，或肝脏测量可能不准确。
4. 拍下每条鱼的照片。
   1. 确认要拍摄的鱼完全对齐，一只眼睛直接放在另一只眼睛的顶部。如有必要，使用细钳轻轻敲打鱼的头部或尾部以调整方向。如果鱼的尾巴弯曲，用钳子用力捏住鱼尾，使鱼平放。
   2. 放大到高放大倍率，并聚焦于肝脏，确保肝脏的轮廓清晰可见。
   3. 捕捉图片并保存文件。
   4. 对所有鱼重复上述步骤，确保每张图片的放大倍数相同。
   5. 使用相同的放大倍率拍摄微米的照片（参见图2H）。

4. 图像分析

1. 使用图像处理软件测量每条鱼的肝脏面积。
   1. 蒙住所有的肝脏图片，以避免潜在的调查人员偏见，促进科学的严谨^15。此步骤可以由其他实验室成员手动完成，也可以使用计算机程序 （补充材料）。随机重命名文件并创建一个"随机化文件"，其中包含原始文件名和相应的盲化文件名的列表。
   2. 按顺序打开随机文件，从文件 1 开始。
   3. 选择手绘工具并勾勒出每个肝脏。
   4. 按 Ctrl-M 测量每个肝脏的面积。
   5. 对于无法准确测量的任何肝脏，插入占位符测量值（非常小或非常大，因此以后可以轻松排除）。
   6. 将测量值保存在文本文件中（"测量文件"）。
2. 无盲分析数据
   1. 在电子表格程序中打开"测量文件"和"随机化文件"。
   2. 在"测量文件"中插入一个新列，并使用"随机化文件"添加盲注文件的原始文件名。将此文件另存为"无盲测量文件"。
   3. 按原始文件名对数据进行排序。
   4. 请务必排除任何肝脏测量图片不足（参见图 2A+G）。
   5. 如有必要，将测量值转换为所需的刻度（例如 mm^2）。
      1. 打开图像处理软件中的比例尺。
      2. 使用直线工具在刻度杆上测量 1 mm。图像处理软件将测量与肝脏（像素）相同的单位，给出一个转换因子。
      3. 使用转换系数转换"无盲测量文件"中的测量值。
   6. 使用电子表格程序或将数据粘贴到科学的图形和统计软件中，确定均值和标准偏差并计算p值。

结果

转基因斑马鱼表达肝细胞特异性活性β-卡特宁（Tg（fabp10a:pt-α-cat）^{斑马鱼3，}非转基因对照兄弟姐妹在6dpf和肝脏区域使用明场显微镜和图像处理软件进行定量。转基因斑马鱼与非转基因兄弟姐妹相比，肝脏尺寸显著增加（0.0006厘米2），（0.0004厘米2，p<0.0001; 图 1.

讨论

肝脏大小的定量对于旨在了解肝脏发育、再生和肿瘤发生的研究至关重要。这里描述的方案是一种相对快速、简单和廉价的幼虫斑马鱼肝脏大小定量技术。在执行协议的某些方面时，适当谨慎行事有助于提高结果的准确性并减少挫折感。

正确固定幼虫对于获得保存完好的生物样本和防止其解体至关重要。在将 PFA 添加到冲洗的幼虫之前未完全去除 PBS 时，可能会出现 4% PFA 溶?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera for dissecting microscope	Leica, for example
Dissecting microscope	Leica, for example
Fine (Dumont #5) forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass pipets	VWR	14672-608
Image analysis software	Image J/FIJI		ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome
Methyl cellulose	Sigma	M0387
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline	Various suppliers
Pipette pump	VWR	53502-233
Plastic Petri dishes	USA Scientific Inc	2906
Pyrex 9-well round-bottom glass dish	VWR	89090-482
Software for blinding files	R project		R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/
Scientific graphing and statistics software	GraphPad Prism
Spreadsheet program	Microsoft Excel
Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)	Western Chemical	200-226
Very fine (Dumont #55) forceps	Fine Science Tools	11255-20