Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield

Resumen

Aquí demostramos un método para cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval, proporcionando una manera de evaluar los efectos de las manipulaciones genéticas y farmacológicas en el crecimiento y desarrollo del hígado.

Resumen

En varios modelos transgénicos de peces cebra de carcinoma hepatocelular (HCC), se puede observar hepatomegalia durante las primeras etapas larvales. La cuantificación del tamaño del hígado larvario en los modelos de HCC de pez cebra proporciona un medio para evaluar rápidamente los efectos de los fármacos y otras manipulaciones en un fenotipo relacionado con oncogén. Aquí mostramos cómo reparar larvas de peces cebra, diseccionar los tejidos que rodean el hígado, fotografiar hígados usando microscopía de campo brillante, medir el área hepática y analizar los resultados. Este protocolo permite una cuantificación rápida y precisa del tamaño del hígado. Como este método implica medir el área hepática, puede subestimar las diferencias en el volumen hepático, y se requieren metodologías complementarias para diferenciar entre los cambios en el tamaño celular y los cambios en el número de células. La técnica de disección descrita en este documento es una excelente herramienta para visualizar el hígado, el intestino y el páncreas en sus posiciones naturales para innumerables aplicaciones aguas abajo, incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la hibridación in situ. La estrategia descrita para cuantificar el tamaño del hígado larvario es aplicable a muchos aspectos del desarrollo y la regeneración del hígado.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (HCC) es la neoplasia maligna primaria más común del hígado¹ y la tercera causa de mortalidad relacionada con el cáncer^2. Para comprender mejor los mecanismos de la hepatocarcinogénesis e identificar posibles terapias de HCC, nosotros y otros hemos desarrollado peces cebra transgénicos en los que la expresión específica de hepatocitos de oncogenes tales como la -catenina^3,4, Kras(V12)^5,6, Myc⁷, o Yap1⁸ conduce a HCC en animales adultos. En estos peces cebra, el agrandamiento del hígado se observa ya 6 días después de la fertilización (dpf), proporcionando una plataforma fácil para probar los efectos de los fármacos y alteraciones genéticas en el crecimiento excesivo del hígado impulsado por oncógeno. La medición precisa y precisa del tamaño del hígado larvaria es esencial para determinar los efectos de estas manipulaciones.

El tamaño y la forma del hígado pueden evaluarse semicuantitativamente en larvas fijas de peces cebra etiquetando CY3-SA⁹ o en larvas de peces cebra vivos utilizando reporteros fluorescentes específicos de hepatoparcitos y microscopía de disección de fluorescencia^5,6. Este último método es relativamente rápido, y su falta de precisión se puede abordar fotografiando y midiendo el área de cada hígado utilizando el software de procesamiento de imágenes^7,10. Sin embargo, puede ser técnicamente difícil posicionar uniformemente todas las larvas vivas en un experimento tal que el área hepática bidimensional es una representación precisa del tamaño del hígado. Una técnica similar para cuantificar el tamaño del hígado implica el uso de microscopía de fluorescencia de láminas de luz para cuantificar el volumen del hígado larvario⁸, que puede ser más precisa para detectar diferencias de tamaño cuando el hígado se expande de forma no uniforme en diferentes dimensiones. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se puede utilizar para contar el número de hepatocitos etiquetados fluorescentemente y otros tipos de células hepáticas en hígados larvarios^8,11. En este método, los hígados larvales se agrupan y se disocian, por lo que se pierde información sobre el tamaño y la forma del hígado individual. En combinación con otro método de determinación del tamaño del hígado, FACS permite la diferenciación entre el aumento del número de células (hiperplasia) y el aumento del tamaño celular (hipertrofia). Todos estos métodos emplean costosa tecnología de fluorescencia (microscopio o clasificador celular) y, a excepción del etiquetado CY3-SA, requieren el etiquetado de hepatocitos con un reportero fluorescente.

Aquí describimos en detalle un método para cuantificar el área del hígado larvario de peces cebra utilizando microscopía de campo brillante y software de procesamiento de imágenes^3,12,13,14. Este protocolo permite cuantificar con precisión el área de hígados individuales in situ sin el uso de microscopía de fluorescencia. Al analizar el tamaño del hígado, cegamos la identidad de la imagen para reducir el sesgo del investigador y mejorar el rigor científico^15.

Protocolo

Los estudios en animales se llevan a cabo siguiendo procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Utah.

1. Fijación de larvas

1. A los 3-7 días después de la fertilización (dpf), larvas de eutanasia con tricaína metanoesulfonato (0,03%) y recoger hasta 15 larvas en un tubo de 2 ml utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta.
2. Lave las larvas dos veces con 1 ml de frío (4 oC) 1 x solución salina con fosfato (PBS) sobre hielo. Para cada lavado, retire la mayor cantidad de líquido posible del tubo con una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta, y luego agregue 1 ml de PBS frío al tubo.
3. Retire tanto PBS como sea posible utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta, y agregue 1 ml de frío (4 oC) 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS.
   ADVERTENCIA: La PFA es un carcinógeno irritante y sospechoso. Los guantes deben usarse al manipular PFA, y las soluciones concentradas deben manipularse en una campana de humo químico.
4. Incubar a 4oC al menos durante la noche (pero hasta varios meses) con un suave balanceo.

2. Diseción de los tejidos que rodean el hígado

1. Retire las larvas de PFA enjuagando 3 veces con 1 ml de PBS frío (4 oC) y mecendo durante 5 minutos entre enjuagues.
   NOTA: Está bien mantener las larvas enjuagadas en PBS durante uno o dos días a 4oC.
2. Pipetear varias larvas en PBS en un pozo de un plato de vidrio de fondo redondo de 9 pozos.
3. Retire la piel que rodea el hígado.
   1. Utilice fórceps finos para sostener la larva en su espalda (vientre hacia arriba), aferrándose a cada lado de la cabeza tan suavemente como sea posible. Luego usa fórceps muy finos en la otra mano para agarrar la piel justo sobre el corazón.
   2. Tire de la piel hacia abajo diagonalmente hacia la cola del pez y la parte inferior del plato en el lado izquierdo o derecho del pez. Repita para el otro lado (lado derecho o izquierdo).
   3. Continúe agarrando colgajos de piel y tirando hacia abajo/hacia atrás hasta que se hayan extirpado toda la piel y los melanoforos que se encuentran sobre el hígado o cerca del hígado.
4. Retire la yema, si está presente.
   1. Para larvas de 5-6 dpf, levante la yema en una sola pieza sosteniendo el pez con fórceps finos en su espalda y usando los fórceps muy finos para empujar la yema suavemente.
   2. Para larvas de 3-4 dpf, raspe la yema en pedazos. Sostenga el pez con fórceps finos en su espalda y use los fórceps muy finos para acariciar la yema, comenzando desde el lado ventral.
5. Coloque las larvas diseccionadas en PBS frío fresco utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta.

3. Imágenes

1. Para montar larvas, vierta unos pocos ml de 3% de celulosa metilenenente en la tapa de un plato Petri de plástico limpio.
2. Utilice una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta para agregar larvas a la celulosa metil, añadiendo el menor PBS con las larvas como sea posible.
3. Bajo un microscopio de disección con bajo aumento, usa fórceps finos para orientar a los peces para que estén acostados en su lado derecho, mirando hacia la izquierda.
   NOTA: Asegúrese de que los peces estén orientados perfectamente de su lado o que las mediciones hepáticas no sean precisas.
4. Tome una foto de cada pez.
   1. Confirme que el pez a fotografiar está perfectamente alineado, con un ojo directamente en la parte superior del otro ojo. Si es necesario, utilice fórceps finos para tocar ligeramente la cabeza o la cola de los peces para ajustar la orientación. Si la cola del pez está doblada, retira la cola pellizcándola con fuerza con fórceps para eliminarla para que el pez quede plana.
   2. Acercar a un aumento alto y centrarse en el hígado, asegurándose de que el contorno del hígado es claramente visible.
   3. Toma una foto y guarda el archivo.
   4. Repita el proceso para todos los peces, asegurándose de que el aumento sea el mismo para cada imagen.
   5. Tome una foto de un micrómetro utilizando el mismo aumento (consulte la Figura 2H).

4. Análisis de imagen

1. Mida el área del hígado de cada pez utilizando un software de procesamiento de imágenes.
   1. Cegar todas las imágenes del hígado para evitar posibles sesgos de investigador y promover el rigor científico¹⁵. Este paso puede ser realizado manualmente por otro miembro del laboratorio o utilizando un programa de computadora (Material Suplementario). Cambie el nombre de los archivos aleatoriamente y cree un "archivo de aleatorización" que contenga una lista de los nombres de archivo originales y los nombres de archivo cegados correspondientes.
   2. Abra los archivos aleatorios en orden, empezando por el archivo 1.
   3. Elija la herramienta de selecciones a mano alzada y delinee cada hígado.
   4. Presione Ctrl-M para medir el área de cada hígado.
   5. Para cualquier hígado que no se pueda medir con precisión, inserte una medida de marcador de posición (muy pequeña o muy grande, para que pueda excluirse fácilmente más adelante).
   6. Guarde las medidas en un archivo de texto ("archivo de medidas").
2. No ciego y analizar datos
   1. Abra "archivo de medidas" y "archivo de aleatorización" en un programa de hoja de cálculo.
   2. Inserte una nueva columna en el "archivo de medidas" y agregue los nombres de archivo originales para los archivos cegados, utilizando el "archivo de aleatorización". Guarde este archivo como "archivo de medidas sin ciegas".
   3. Ordene los datos por nombre de archivo original.
   4. Asegúrese de excluir las mediciones hepáticas para las que las imágenes fueron inadecuadas (ver Figura 2A–G).
   5. Si es necesario, convierta los valores de medición en la escala deseada (mm², por ejemplo).
      1. Abra la barra de escala en el software de procesamiento de imágenes.
      2. Utilice la herramienta de línea recta para medir 1 mm en la barra de escala. El software de procesamiento de imágenes medirá en las mismas unidades que los hígados (píxeles), dando un factor de conversión.
      3. Utilice el factor de conversión para convertir las mediciones en el "archivo de medidas sin ciegas".
   6. Utilizando el programa de hoja de cálculo o pegando datos en un software científico de gráficos y estadísticas, determine la media y la desviación estándar y calcule los valores p.

Resultados

El pez cebra transgénico que expresa balasteo específico de hepatocitos activado (Tg(fabp10a:pt-a-cat) -cat) ³ y los hermanos de control no transgénicos fueron eutanasiados a 6 dpf y el área hepática se cuantificó utilizando microscopía de campo brillante y software de procesamiento de imágenes. El pez cebra transgénico ha aumentado significativamente el tamaño del hígado (0.0006 cm²) en comparación con sus hermanos no transgénicos (0.0004 cm², ...

Discusión

La cuantificación del tamaño del hígado es crucial en estudios dirigidos a comprender el desarrollo hepático, regeneración y oncogénesis. El protocolo descrito aquí es una técnica relativamente rápida, fácil y barata para la cuantificación del tamaño del hígado en peces cebra larvaria. Ejercer la precaución apropiada mientras se realizan ciertos aspectos del protocolo puede ayudar a aumentar la precisión de los resultados y disminuir la frustración.

La fijación adecuada de las...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera for dissecting microscope	Leica, for example
Dissecting microscope	Leica, for example
Fine (Dumont #5) forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass pipets	VWR	14672-608
Image analysis software	Image J/FIJI		ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome
Methyl cellulose	Sigma	M0387
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline	Various suppliers
Pipette pump	VWR	53502-233
Plastic Petri dishes	USA Scientific Inc	2906
Pyrex 9-well round-bottom glass dish	VWR	89090-482
Software for blinding files	R project		R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/
Scientific graphing and statistics software	GraphPad Prism
Spreadsheet program	Microsoft Excel
Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)	Western Chemical	200-226
Very fine (Dumont #55) forceps	Fine Science Tools	11255-20