JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yöntem göstermek, karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonetkilerini değerlendirmek için bir yol sağlar.

Özet

Hepatosellüler karsinom (HCC) çeşitli transgenik zebra balığı modellerinde erken larva evrelerinde hepatomegali görülebilir. Zebrabalığı HCC modellerinde larva karaciğer boyutunun ölçülmesi, ilaçların ve diğer manipülasyonların onkogene bağlı fenotip üzerindeki etkilerini hızla değerlendirmek için bir araç sağlar. Burada zebra balığı larvalarının nasıl düzeltilebildiğini, karaciğeri çevreleyen dokuları nasıl inceleyeceğimi, parlak alan mikroskobu kullanarak karaciğerleri nasıl fotoğraflayabildiğimizi, karaciğer bölgesini nasıl ölçtüğünü ve sonuçları analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Bu protokol karaciğer boyutunun hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu yöntem karaciğer alanının ölçülmesini içerdiğinden, karaciğer hacmindeki farklılıkları hafife alabilir ve hücre büyüklüğündeki değişimler ile hücre sayısındaki değişimleri ayırt etmek için tamamlayıcı metodolojiler gereklidir. Burada açıklanan diseksiyon tekniği, immünoresans boyama ve yerinde hibridizasyon dahil olmak üzere sayısız downstream uygulamaları için doğal konumlarında karaciğer, bağırsak ve pankreas görselleştirmek için mükemmel bir araçtır. Larva karaciğer boyutunu ölçmek için açıklanan strateji karaciğer gelişimi ve rejenerasyon birçok yönü için geçerlidir.

Giriş

Hepatosellüler karsinom (HCC) karaciğerin en sık görülen primer malignitesi1 ve kansere bağlı mortalitenin üçüncü önde gelennedenidir 2. Hepatokarsinogenezin mekanizmalarını daha iyi anlamak ve potansiyel HCC terapötiklerini belirlemek için, biz ve diğerleri β-catenin3,4,Kras(V12)5,6, Myc7, Yap18 gibi onkogenlerin hepatosite özgü ekspresyonu olan transgenik zebra balığı geliştirdik. Bu zebra balıklarında, karaciğer genişlemesi kadar erken olarak not edilir 6 gün sonrası döllenme (dpf), onkogen güdümlü karaciğer büyümesi üzerinde ilaçların ve genetik değişikliklerin etkilerini test etmek için kolay bir platform sağlayan. Larva karaciğer boyutunun doğru ve kesin ölçümü bu manipülasyonların etkilerini belirlemek için gereklidir.

Karaciğer büyüklüğü ve şekli, sabit zebrabalığı larvalarında 9 veya canlı zebrabalığı larvalarında hepatosite özgü floresan muhabirler ve floresan diseksiyon mikroskopisi kullanılarak yarı kantitatif olarak değerlendirilebilir5,6. İkinci yöntem nispeten hızlı, ve hassasiyet eksikliği fotoğraflama ve görüntü işlemeyazılımı7 kullanarak her karaciğer alanı ölçümü ile ele alınabilir 7,10. Ancak, teknik olarak iki boyutlu karaciğer alanı karaciğer boyutunun doğru bir temsili olduğunu bir deney de tüm canlı larvaları eşit konumlandırmak zor olabilir. Karaciğer boyutunu ölçmek için benzer bir teknik larva karaciğer hacmi ölçmek için hafif levha floresan mikroskopi kullanarak içerir8, karaciğer farklı boyutlarda düzgün olmayan genişletildiğinde boyut farklılıkları tespit etmek için daha doğru olabilir. Floresan aktive hücre sıralama (FACS) larva karaciğerlerinde floresan hepatosit ler ve diğer karaciğer hücre tipleri8,11etiketli sayısını saymak için kullanılabilir . Bu yöntemde, larva karaciğerleri havuza alınır ve ayrıştırılır, böylece bireysel karaciğer büyüklüğü ve şekli hakkında bilgi kaybolur. Başka bir karaciğer boyutu belirleme yöntemi ile birlikte, FACS artan hücre numarası (hiperplazi) ve artan hücre büyüklüğü (hipertrofi) arasında ayrım sağlar. Tüm bu yöntemler pahalı floresan teknolojisi (mikroskop veya hücre ayırıcı) kullanır ve CY3-SA etiketleme dışında, bir floresan muhabiri ile hepatosit etiketleme gerektirir.

Burada ayrıntılı olarak parlak alan mikroskobu ve görüntü işleme yazılımı3,12,13,14kullanarak zebra balığı larva karaciğer alanı ölçmek için bir yöntem açıklar. Bu protokol floresan mikroskopisi kullanılmadan bireysel karaciğerlerin yerinde tam olarak sayısallaştırılmasını sağlar. Karaciğer boyutunu analiz ederken, biz araştırmacı önyargı azaltmak ve bilimsel titizlik geliştirmek için görüntü kimliğini kör15.

Protokol

Hayvan çalışmaları Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürler aşağıdaki yürütülmektedir.

1. Larvaların Sabitlenmesi

  1. 3-7 gün sonra döllenme (dpf), triain metansülfonat (%0.03) ile ötanazi larvaları ve cam pipet ve pipet pompası kullanarak 2 mL'lik bir tüpte 15 larva toplayın.
  2. Larvaları 1 mL soğuk (4 °C) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez buz üzerinde yıkayın. Her yıkama için, cam pipet ve pipet pompası ile tüpten mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın ve sonra tüpe 1 mL soğuk PBS ekleyin.
  3. Cam pipet ve pipet pompası kullanarak mümkün olduğunca fazla PBS çıkarın ve PBS'e 1 mL soğuk (4 °C) 4% paraformaldehit (PFA) ekleyin.
    DİkKAT: PFA tahriş edici ve şüpheli bir karsinojendir. PfA'yı kullanırken eldivengiyilmeli ve konsantre çözeltiler kimyasal bir duman kaputunda kullanılmalıdır.
  4. En az bir gecede (ama birkaç aya kadar) hafif sallanan 4 °C'de kuluçkaya yatırın.

2. KaraciğerI Çevreleyen Dokuların Diseksiyonu

  1. Larvaları PFA'dan 1 mL soğuk (4 °C) PBS ile 3x durulayarak ve durulamalar arasında 5 dakika sallayarak pfa'dan çıkarın.
    NOT: Durulanmış larvaları PBS'de 4 °C'de bir veya iki gün tutmakta bir sakınca yoktur.
  2. Pipet 9-iyi yuvarlak alt cam çanak bir kuyu içine PBS birkaç larva.
  3. Karaciğeri çevreleyen deriyi çıkarın.
    1. Larvayı sırtında tutmak için ince büşralar kullanın (göbek yukarı), başın her iki tarafını mümkün olduğunca hafifçe tutarak. Sonra sadece kalp örten deri kapmak için diğer elinde çok ince forseps kullanın.
    2. Balığın kuyruğuna ve balığın sol veya sağ tarafındaki yemeğin dibine doğru çapraz olarak deri çekin. Diğer taraf için tekrarlayın (sağ veya sol taraf).
    3. Tüm cilt ve melanoforlar üstte veya karaciğer yakın kaldırıldı kadar deri flepleri kapma ve aşağı / geri çekerek devam edin.
  4. Varsa sarısını çıkarın.
    1. 5-6 dpf larvaları için, balığı sırtında ince forsepslerle tutarak ve sarısı hafifçe prod etmek için çok ince forsepskullanarak sarısını tek parça halinde kaldırın.
    2. 3-4 dpf larvaları için, sarısını parçalar halinde kazıyın. Sırtında ince forceps ile balık tutun ve ventral taraftan başlayarak, sarısı inme için çok ince forceps kullanın.
  5. Bir cam pipet ve pipet pompası kullanarak taze soğuk PBS içine diseksiyon larvayerleştirin.

3. Görüntüleme

  1. Larvaları monte etmek için, temiz bir plastik Petri kabının kapağına %3'lük metil selüloz birkaç mL dökün.
  2. Metil selüloza larva eklemek için cam pipet ve pipet pompası kullanın ve larvalarla mümkün olduğunca az PBS ekleyin.
  3. Düşük büyütme de bir diseksiyon mikroskop altında, onlar sağ tarafında yatıyordu, sola bakacak şekilde balık yönlendirmek için ince çömeçler kullanın.
    NOT: Balığın yan larına mükemmel bir şekilde yönlendirildiğinden veya karaciğer ölçümlerinin doğru olmadığından emin olun.
  4. Her balığın fotoğrafını çek.
    1. Fotoğraflanacak balığın mükemmel bir şekilde hizalandığından, bir gözünün diğer gözün üzerinde olduğunu doğrulayın. Gerekirse, yönünü ayarlamak için balığın başına veya kuyruğuna hafifçe dokunmak için ince çerkesler kullanın. Balığın kuyruğu bükülürse, balığın düz yatabilmesi için forceps ile zorla çimdikleyerek kuyruğu çıkarın.
    2. Yüksek büyütme ve karaciğer odaklanmak yakınlaştırma, karaciğer anahat açıkça görünür olduğundan emin olun.
    3. Bir resim çekin ve dosyayı kaydedin.
    4. Büyütme her resim için aynı olduğundan emin olmak, tüm balıklar için tekrarlayın.
    5. Aynı büyütmeyi kullanarak bir mikrometrenin resmini çekin (Bkz. Şekil 2H).

4. Görüntü Analizi

  1. Görüntü işleme yazılımı kullanarak her balığın karaciğer alanını ölçün.
    1. Potansiyel araştırmacı önyargı önlemek ve bilimsel titizlik teşvik etmek için tüm karaciğer resimleri Blind15. Bu adım başka bir laboratuvar üyesi tarafından el ile veya bir bilgisayar programı(Ek Malzeme)kullanılarak yapılabilir. Dosyaları rasgele yeniden adlandırın ve özgün dosya adlarının ve karşılık gelen kör dosya adlarının listesini içeren bir "rasgeleleştirme dosyası" oluşturun.
    2. Dosya 1'den başlayarak rasgele dosyaları sırayla açın.
    3. Freehand seçim aracını seçin ve her karaciğeri anahat.
    4. Her karaciğeralanını ölçmek için Ctrl-M tuşuna basın.
    5. Doğru ölçülemeyecek herhangi bir karaciğer için, bir yer tutucu ölçümü ekleyin (çok küçük veya çok büyük, böylece kolayca daha sonra hariç olabilir).
    6. Ölçümleri bir metin dosyasına kaydedin ("ölçümler dosyası").
  2. Görmeme ve verileri analiz
    1. Elektronik tablo programında "ölçümler dosyası" ve "randomizasyon dosyası"nı açın.
    2. "Ölçümler dosyası"na yeni bir sütun ekleyin ve "rasgeleleştirme dosyasını" kullanarak kör dosyaların özgün dosya adlarını ekleyin. Bu dosyayı "kör olmayan ölçümler dosyası" olarak kaydedin.
    3. Verileri özgün dosya adına göre sıralayın.
    4. Resimlerin yetersiz olduğu karaciğer ölçümlerini hariç tutabilmek için (Bkz. Şekil 2A-G).
    5. Gerekirse, ölçüm değerlerini istenilen ölçeğe dönüştürün (örneğin mm2).
      1. Görüntü işleme yazılımındaki ölçek çubuğunu açın.
      2. Ölçek çubuğunda 1 mm ölçmek için düz çizgi aracını kullanın. Görüntü işleme yazılımı karaciğerler (piksel) ile aynı birimlerde ölçülür ve bir dönüşüm faktörü verir.
      3. "Kör olmayan ölçümler dosyası"ndaki ölçümleri dönüştürmek için dönüştürme faktörlerini kullanın.
    6. Elektronik tablo lama programını kullanmak veya verileri bilimsel bir grafik ve istatistik yazılımına yapıştırmak, ortalama ve standart sapmayı belirleyin ve p değerini(ler) hesaplayın.

Sonuçlar

Hepatosite özgü aktif β-catenin(Tg(fabp10a:pt-β-cat) zebrabalığı)3 ve transgenik olmayan kontrol kardeşleri 6 dpf'de ötenazi yemi olan transgenik zebrabalıkları brightfield mikroskopi ve görüntü işleme yazılımı kullanılarak ölçüldü. Transgenik zebra balıkları karaciğer boyutunu (0.0006 cm2)transgenik olmayan kardeşlere göre önemli ölçüde artırmıştır (0.0004 cm2, p < 0.0001; Şekil 1)....

Tartışmalar

Karaciğer gelişimini, rejenerasyonu ve onkogenezini anlamaya yönelik çalışmalarda karaciğer büyüklüğünün sayısallaştırılması çok önemlidir. Burada açıklanan protokol larva zebra balığında karaciğer büyüklüğü niceliği için nispeten hızlı, kolay ve ucuz bir tekniktir. Protokolün belirli yönlerini uygularken uygun dikkatli olunması, sonuçların doğruluğunun artmasına ve hayal kırıklığının azalmasına yardımcı olabilir.

Larvaların doğru fiksasyon...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Biz Maurine Hobbs ve Merkezi Zebrafish Hayvan Kaynağı (CZAR) Utah Üniversitesi'nde zebrabalığı yetiştiriciliği, laboratuvar alanı ve ekipman bu araştırmanın bölümlerini yürütmek için sağlamak için kabul etmek istiyorum. CZAR genişlemesi kısmen NIH hibe # 1G20OD018369-01 tarafından desteklenir. Biz de Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum ve Huntsman Kanser Enstitüsü (HCI) Zebrabalığı Tesisi zebra balığı bakımı için teşekkür etmek istiyorum. Biz R programlama ile ilgili yardım için Kenneth Kompass teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Huntsman Kanser Vakfı'nın (P30 CA042014'ün Huntsman Kanser Enstitüsü'ne verilen hibe ile birlikte) ve NIH/NCI R01CA2222570 (KJE) hibeleri ile finanse edilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Camera for dissecting microscopeLeica, for example
Dissecting microscopeLeica, for example
Fine (Dumont #5) forcepsFine Science Tools11254-20
Glass pipetsVWR14672-608
Image analysis softwareImage J/FIJIImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome
Methyl celluloseSigmaM0387
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
Phosphate-buffered salineVarious suppliers
Pipette pumpVWR53502-233
Plastic Petri dishesUSA Scientific Inc2906
Pyrex 9-well round-bottom glass dishVWR89090-482
Software for blinding filesR projectR can be downloaded for free: https://www.r-project.org/
Scientific graphing and statistics softwareGraphPad Prism
Spreadsheet programMicrosoft Excel
Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)Western Chemical200-226
Very fine (Dumont #55) forcepsFine Science Tools11255-20

Referanslar

  1. Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
  2. Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
  3. Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
  4. Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
  5. Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
  6. Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
  7. Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
  8. Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
  9. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
  10. Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
  11. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
  15. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  16. Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
  17. Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
  18. Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
  19. Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
  20. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 156zebra ballarvadiseksiyonkaraci er b y kllarva analizig r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır