브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

요약

여기에서 우리는 애벌레 얼룩말어에 있는 간 크기를 정량화하는 방법을 보여줍니다, 간 성장 및 발달에 유전과 약리학 적인 조작의 효력을 평가하는 쪽을 제공하는.

초록

간세포 암종 (HCC)의 여러 형질 전환 제브라피시 모델에서, 간갈기는 초기 애벌레 단계 동안 관찰 될 수있다. zebrafish HCC 모델에서 애벌레 간 크기를 정량화하면 종양 유전자 관련 표현형에 대한 약물 및 기타 조작의 효과를 신속하게 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. 여기에서 우리는 제브라피시 유충을 고치고, 간을 둘러싼 조직을 해부하고, 밝은 필드 현미경을 사용하여 간을 촬영하고, 간 면적을 측정하고, 결과를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간 크기의 신속하고 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 이 방법은 간 면적을 측정하는 것을 관련시키기 때문에, 간 양에 있는 다름을 과소평가할 수 있고, 상호 보완적인 방법론은 세포 크기에 있는 변경 및 세포 수에 있는 변경을 구별하기 위하여 요구됩니다. 본 명세서에 기재된 해부 기술은 면역형광 염색 및 내부 혼성화를 포함한 무수한 하류 응용을 위한 그들의 자연적인 위치에서 간, 창자 및 췌장을 시각화하는 훌륭한 도구이다. 애벌레 간 크기를 정량화하기 위한 기술된 전략은 간 발달 및 재생의 많은 양상에 적용가능하다.

서문

간세포암(HCC)은^간1의 가장 흔한 1차 악성종양이며 암 관련^사망률의세 번째 주요 원인2. 간암발생의 메커니즘을 더 잘 이해하고 잠재적인 HCC 치료제를 식별하기 위해, 당사와 다른 사람들은 β-카테닌^3,4,Kras(V12)^5,6,Myc7,또는 Yap1^8과 같은 종양유전자의 간세포 특이적 발현이 성인 동물의 HCC로 이어지는 형질전환 제브라피시를 개발했습니다. 이 제브라피시에서, 간 확대는 일찍 부터 지적된다 6 일 후 수정 (dpf), 종양 유전자 구동 간 과성장에 약물과 유전 변경의 효과를 테스트하기위한 허실 플랫폼을 제공. 애벌레 간 크기의 정확 하 고 정확한 측정은 이러한 조작의 효과 결정 하기 위해 필수적 이다.

간 크기 및 형상은 CY3-SA^{라벨링 9} 또는 간세포 특이적 형광 리포터 및 형광 해부^{현미경5,6을}사용하여 살아있는 제브라피시 유충에 의해 고정된 제브라피시 유충에서 반정량적으로 평가될 수 있다. 후자의 방법은 비교적 빠르며, 그 정밀도의 부족은 이미지 처리 소프트웨어^7,10을사용하여 각 간 면적을 촬영하고 측정하여 해결할 수 있다. 그러나, 2차원 간 영역이 간 크기의 정확한 표현이 되도록 실험에서 모든 살아있는 애벌레를 균일하게 배치하는 것은 기술적으로 어려울 수 있다. 간 크기를 정량화하기위한 유사한 기술은 간이 다른 차원에서 비균일하게 확장 될 때 크기 차이를 검출하기 위해 더 정확 할 수있는 애벌레 간 볼륨^8을정량화하기 위해 가벼운 시트 형광 현미경 을 사용하는 것을 포함한다. 형광 활성화 세포 선별(FACS)은 애벌레^간에서형광표지된 간세포 및 기타 간 세포 유형의 수를 카운트하는데 사용할 수 있다^8,11. 이 방법에서는 애벌레 간이 풀화되고 해리되므로 개별 간 크기와 모양에 대한 정보가 손실됩니다. 다른 간 크기 측정 방법과 함께, FACS 증가 세포 수 사이 분화를 가능 (증식) 그리고 증가 세포 크기 (비 대). 이러한 모든 방법은 고가의 형광 기술 (현미경 또는 세포 선별기)을 사용하며 CY3-SA 라벨링을 제외하고 형광 리포터로 간세포를 라벨링해야합니다.

여기서 우리는 밝은 필드 현미경 및 화상 처리 소프트웨어^{3,12,13,14를}사용하여 제브라피시 애벌레 간 영역을 정량화하는 방법을 상세히 기술한다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법의 사용없이 그 안에 있는 개별 간 의 지역의 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 간 크기를 분석하는 동안, 우리는 조사자 편견을 줄이고 과학적 엄격을 개선하기 위해 이미지 정체성을 블라인드¹⁵.

프로토콜

동물 연구는 유타 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 다음 절차에 따라 수행됩니다.

1. 애벌레 고정

1. 3-7 일 후 수정 (dpf), 트리카인 메탄설포네이트 (0.03 %)와 애벌레를 안락사 유리 피펫 및 파이펫 펌프를 사용하여 2 mL 튜브에 최대 15 마리의 애벌레를 수집합니다.
2. 얼음에 1 mL의 차가운 (4 °C) 1 x 인산완식염수 (PBS)로 애벌레를 두 번 씻으하십시오. 각 세척에 대해 유리 파이펫과 파이펫 펌프로 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거한 다음 튜브에 1 mL의 차가운 PBS를 추가하십시오.
3. 유리 파이펫 및 파이펫 펌프를 사용하여 가능한 한 많은 PBS를 제거하고 PBS에 1 mL의 냉기 (4 °C) 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다.
   주의: PFA는 자극적이고 발암물질로 의심됩니다. PFA를 취급할 때 장갑을 착용해야 하며 농축 된 솔루션은 화학 연기 후드에서 처리해야합니다.
4. 부드러운 흔들림으로 적어도 하룻밤 (하지만 몇 개월까지) 4 °C에서 배양.

2. 간을 둘러싼 조직 해부

1. 1 mL의 차가운 (4 °C) PBS로 3x를 헹구고 헹구 사이에 5 분 동안 흔들어 서 PFA에서 유충을 제거하십시오.
   참고 : 4 °C에서 하루 이틀 동안 PBS에 헹구는 애벌레를 유지하는 것이 괜찮습니다.
2. PBS의 여러 유충을 9웰 바닥 유리 접시의 한 우물에 피펫.
3. 간 을 둘러싼 피부를 제거합니다.
   1. 미세 한 포셉을 사용 하 여 애벌레를 등 (배 위로) 잡고, 가능한 한 부드럽게 머리의 양쪽에 그립. 그런 다음 다른 손에 아주 미세한 집게를 사용하여 심장을 덮는 피부를 잡으십시오.
   2. 물고기를 꼬리쪽으로 대각선으로 내리고 물고기의 왼쪽 또는 오른쪽에있는 접시의 바닥을 당깁니다. 다른 쪽(오른쪽 또는 왼쪽)에서 반복합니다.
   3. 피부의 플랩을 잡고 아래로 당겨 계속 / 다시 모든 피부와 멜라 노 포어오버 또는 간 근처 제거 될 때까지.
4. 노른자를 제거하십시오( 있는 경우).
   1. 5-6 dpf 애벌레의 경우, 생선을 등에 미세한 포셉으로 잡고 아주 미세한 집게를 사용하여 노른자를 부드럽게 프로핑하여 한 조각으로 노른자를 들어 올립니다.
   2. 3-4 dpf 애벌레의 경우 노른자를 조각으로 긁어냅니다. 생선을 등에 미세한 집게로 잡고 아주 미세한 집게를 사용하여 복부 쪽에서 시작하여 노른자를 쓰다듬습니다.
5. 유리 피펫과 파이펫 펌프를 사용하여 해부 된 유충을 신선한 차가운 PBS에 넣습니다.

3. 이미징

1. 애벌레를 장착하려면 깨끗한 플라스틱 페트리 접시뚜껑에 3 % 메틸 셀룰로오스 몇 mL을 붓습니다.
2. 유리 피펫과 파이펫 펌프를 사용하여 메틸 셀룰로오스에 애벌레를 추가하고 가능한 한 애벌레로 적은 PBS를 추가하십시오.
3. 낮은 배율에서 해부 현미경에서, 그들은 왼쪽을 향하고, 자신의 오른쪽에 누워 있도록 물고기의 방향을 미세 한 집게를 사용합니다.
   참고: 물고기가 측면에 완벽하게 향하도록 하거나 간 측정이 정확하지 않을 수 있는지 확인하십시오.
4. 각 물고기의 사진을 찍는다.
   1. 촬영할 물고기가 한쪽 눈이 다른 눈 바로 위에 있는 것과 완벽하게 정렬되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우 미세 한 집게를 사용하여 물고기의 머리 또는 꼬리를 가볍게 두드려 방향을 조정하십시오. 물고기의 꼬리가 구부러진 경우, 물고기가 평평하게 누워 있도록 그것을 제거하기 위해 집게로 강제로 꼬집어 꼬리를 제거합니다.
   2. 높은 배율을 확대하고 간을 집중하여 간 윤곽이 선명하게 보이도록 합니다.
   3. 사진을 스냅하고 파일을 저장합니다.
   4. 모든 물고기에 대해 반복하여 각 그림에 대해 배율이 동일한지 확인합니다.
   5. 동일한 배율을 사용하여 마이크로미터의 사진을 찍습니다(그림 2H참조).

4. 이미지 분석

1. 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 각 물고기의 간 면적을 측정합니다.
   1. 잠재적 인 조사자 편견을 피하고 과학적 엄격을 촉진하기 위해 모든 간 사진을 블라인드¹⁵. 이 단계는 다른 랩 멤버가 수동으로 수행하거나 컴퓨터프로그램(보충 자료)을사용하여 수행할 수 있습니다. 파일의 이름을 임의로 변경하고 원본 파일 이름과 해당 블라인드 파일 이름 목록이 포함된 "무작위 파일"을 만듭니다.
   2. 파일 1부터 순서대로 임의파일을 엽니다.
   3. 자유형 선택 도구를 선택하고 각 간을 윤곽을 잡습니다.
   4. 각 간 면적을 측정하려면 Ctrl-M을 누릅니다.
   5. 정확하게 측정할 수 없는 간은 자리 표시자 측정값을 삽입합니다(매우 작거나 매우 크므로 나중에 쉽게 제외할 수 있음).
   6. 측정값을 텍스트 파일("측정 파일")에 저장합니다.
2. 블라인드 해제 및 데이터 분석
   1. 스프레드시트 프로그램에서 "측정 파일" 및 "무작위 파일"을 엽니다.
   2. "측정 파일"에 새 열을 삽입하고 "무작위 파일"을 사용하여 블라인드 파일의 원래 파일 이름을 추가합니다. 이 파일을 "눈이 멀지 않은 측정 파일"로 저장합니다.
   3. 원본 파일 이름으로 데이터를 정렬합니다.
   4. 사진이 부적절한 간 측정은 제외해야 합니다(그림 2A-G참조).
   5. 필요한 경우 측정 값을 원하는 축척(예: mm^2,예:)으로 변환합니다.
      1. 이미지 처리 소프트웨어에서 축척 막대를 엽니다.
      2. 직선 도구를 사용하여 축척 막대에서 1mm를 측정합니다. 이미지 처리 소프트웨어는 간(픽셀)과 동일한 단위로 측정하여 변환 계수를 제공합니다.
      3. 변환 계수를 사용하여 "눈이 멀지 않은 측정 파일"에서 측정을 변환합니다.
   6. 스프레드시트 프로그램을 사용하거나 데이터를 과학 그래프 및 통계 소프트웨어에 붙여넣음으로 평균 및 표준 편차를 결정하고 p 값을 계산합니다.

결과

간세포 특이적 활성화된 β-카테닌(Tg(fabp10a:pt-β-cat)을 발현하는 형질전환 제브라피시³ 및 비형질조절 형제는 6dpf에서 안락사되었고, 간부위는 브라이트필드 현미경 및 영상처리 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 형질전환 제브라피쉬는 비형질전환형제(0.0004^cm2,p< 0.0001)에 비해 간 크기(0.0006^cm2)가현저히 증가하였다. 그림 1)...

토론

간 크기의 정량화는 간 발달, 재생 및 종양 발생을 이해하는 것을 목표로 하는 연구에서 매우 중요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 라발 제브라피시의 간 크기 정량화를 위한 비교적 빠르고, 쉽고, 저렴한 기술입니다. 프로토콜의 특정 측면을 수행 하는 동안 적절 한 주의 행사 결과의 증가 정확도 및 감소 좌절에 도움이 될 수 있습니다.

유충의 적당한 고정은 잘 보존된 생?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera for dissecting microscope	Leica, for example
Dissecting microscope	Leica, for example
Fine (Dumont #5) forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass pipets	VWR	14672-608
Image analysis software	Image J/FIJI		ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome
Methyl cellulose	Sigma	M0387
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline	Various suppliers
Pipette pump	VWR	53502-233
Plastic Petri dishes	USA Scientific Inc	2906
Pyrex 9-well round-bottom glass dish	VWR	89090-482
Software for blinding files	R project		R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/
Scientific graphing and statistics software	GraphPad Prism
Spreadsheet program	Microsoft Excel
Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)	Western Chemical	200-226
Very fine (Dumont #55) forceps	Fine Science Tools	11255-20