功能化磁性纳米粒子的合成及其与侧双磷铁氧胺的结合及其细菌检测评价

摘要

本作品描述了磁性纳米粒子制备的协议，其涂层与SiO_2，其次是其胺功能与（3-氨基丙酮）三氧西烷（APTES）及其与递延莫沙胺的结合使用苏基尼莫西作为链接器。还详细介绍了对所有中间纳米粒子和最终偶联物使用Y.肠菌学的深层结构表征描述和捕获细菌测定。

摘要

在目前的工作中，用SiO₂合成磁性纳米粒子，其胺功能化（3-氨基丙酮）三氧西烷（APTES），并结合延高胺，这是Yersinia肠科利质识别的侧发，使用成功素菌作为链接器。

磁铁矿的磁性纳米粒子（Fe₃O_4）采用溶质法制备，并使用Stüre工艺涂覆SiO 2（MNP@SiO2），然后使用APTES（MNP@SiO2@NH2）进行功能化。_{22 22}然后，用卡博迪米德联轴器将费氧胺与_MNP@SiO2@NH2并联，使_{2MNP@SiO2@NH2@Fa。2}通过八种不同的方法，包括粉末X射线衍射（XRD）、傅立叶变换红外光谱（FT-IR）、拉曼光谱学、X射线光电子光谱（XPS）、传输电子显微镜（TEM）和能量分散X射线（EDX）映射等八种不同方法，对偶联和中间体的形态和特性进行了研究。这种详尽的描述证实了结合的形成。最后，为了评估纳米粒子的容量和特异性，他们使用耶尔西尼亚肠科利塔在捕获细菌测定中进行了测试。

引言

使用MNP的细菌检测方法基于致病菌¹结合MNP的抗体、分枝剂、生物蛋白、碳水化合物的分子识别。考虑到侧肢被细菌外膜上的特定受体识别，它们也可以与MNP相关，以增加它们的特异性^2。侧肢是小有机分子参与Fe^{3+ 被细菌3，44}的获取。副体和MNP之间的结合物的制备，以及它们对细菌捕获和分离的评估，尚未报告。

将磁性纳米粒子与小分子结合合成的关键步骤之一是选择它们之间的键或相互作用类型，以确保小分子附着在MNP表面。因此，在磁性纳米粒子和费洛沙胺（Yersinia肠原体识别的侧发）之间制备结合的过程集中在MNP可修改表面的生成上，以便通过carbodiimide化学将其与侧光体均匀地连接。为了获得均匀的磁铁矿纳米粒子（MNP），并改进核化和尺寸控制，用苯基醇进行溶酶反应，在不晃动⁵的情况下在热块中进行。然后，用Stüber方法生成了二氧化硅涂层，以提供保护，提高水介质⁶中纳米粒子悬浮液的稳定性。考虑到铁氧胺的结构，引入胺组是产生合适的纳米粒子_{（MNP@SiO2@NH2）}与侧磷结合所必需的。₂这是通过冷凝（3-氨基丙基）三氧西烷（APTES）与酒精组存在于硅改性纳米粒子的表面_{（MNP@SiO2）}使用sol-凝胶方法^7。

同时，铁氧西胺铁（III）复合物是通过在水溶液中用乙酰乙酰醋酸铁进行商业上可用的递延胺复式制备的。NN-succinylferoxamine，轴承的苏基尼组，将起到链接，是通过铁氧胺与琥珀性氢化物的反应获得的。

MNP@SiO₂@NH₂和N-succinylferoxamine的结合，使 MNP@SiO₂@NH_–Fa 通过作为耦合试剂苯甲酸酮-1-yl-oxy-tris-（di） 的 carbodiimide 化学进行 磷酸二氟磷酸（BOP）和1-羟基苯甲酸酯（HOBt）在软的基本介质中激活N-苏基苯甲胺⁸中的终端酸组。

一旦MNPs被定性，我们评估了裸露和功能化磁性纳米粒子捕获野生类型（WC-A）和缺乏铁氧西胺受体FoxA（FoxA WC-A 12-8）的突变体的能力。普通议员、功能化的MN和_2@NH和FaMNP@SiO允许与每个Y.肠胆菌菌株相互作用。细菌结合骨料通过磁场的应用从细菌悬浮液中分离出来。分离的骨料用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗两次，重新悬浮在PBS中准备连续稀释，然后镀上聚落计数。该协议演示了_{MNP@SiO2@NH@Fa}合成的每一个步骤，所有中间体和偶联物的结构特征，以及细菌捕获测定法，作为评估偶联物相对于中间体的特异性的简便方法。⁹

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研究方案

注:对于在惰性大气条件下进行的反应，所有玻璃器皿以前在烤箱中干燥65°C，用橡胶隔膜密封，用气处理三次清洗。

1. 与铁氧胺结合的磁性纳米粒子的合成

1. 铁₃O₄磁性纳米粒子（MNPs）的合成
   1. 在20 mL玻璃瓶中加入0.5克Fe（acac）3，然后与10 mL的苯基酒精混合。₃
   2. 将这种混合物声波2分钟，然后转移到加热块，并在180°C加热72小时。
   3. 反应完成后，让小瓶冷却，用96%乙醇冲洗纳米颗粒，在4000 x g下用离心机冲洗30分钟。重复离心至少两次。
   4. 使用钛（NdFeB）磁铁通过磁吸引将纳米粒子与上清器分离，并丢弃残留溶剂。
   5. 用 96% 乙醇重复步骤 1.1.4 冲洗。在 40 kHz 的浴缸中丢弃超清液与声波交替 1 分钟，直到溶剂看起来清晰。
2. 磁性纳米粒子 SiO₂涂层 （MNP@SiO₂）
   1. 在80 mL异丙醇中制备2克MNP的悬浮液，然后在带有磁性搅拌棒的圆形底部烧瓶中加入4 mL的21%氨、7.5mL蒸馏水和0.56 mL的四乙酰正交硅酸盐（按此顺序）。
   2. 在40°C下加热混合物2小时，连续搅拌，然后声波1小时。
   3. 用磁铁分离MNP，丢弃上清液，并将其分散在30 mL的异丙醇中。
   4. 重复步骤 1.2.1。和1.2.2。
   5. 用96%乙醇取出并清洗磁搅拌棒，以回收所有材料。
   6. 使用磁铁通过磁吸引将纳米粒子与上光体分离。
   7. 丢弃上清液，用96%乙醇冲洗纳米颗粒三次与声波交替。
   8. 在室温下真空下干燥纳米颗粒 12 小时。
3. MNP@SiO₂的功能化（3-氨基丙酮）三氧西烷 （APTES）
   1. 在惰性环境中用N，N-二甲基酰胺（DMF）冲洗500毫克的_MNP@SiO2，然后在40 kHz下声波1分钟。然后，丢弃上清液并重复此过程三次。
   2. 用磁性搅拌棒重新悬浮在圆形底部烧瓶中的颗粒，然后加入 9 mL 的 APTES。
   3. 在 60°C 下搅拌混合物 12 小时。
   4. 丢弃上清液，用96%乙醇冲洗纳米颗粒三次与声波交替。
4. 铁氧西胺的合成
   1. 溶解100毫克（0.15 mmol）的顺氧胺美化盐和53.0毫克（0.15mmol）的Fe（acac）3在₃5 mL蒸馏水中，并在室温下搅拌混合物过夜。
   2. 在分离漏斗中用 20 mL EtOAc 清洗结果产品三次，然后使用旋转蒸发器在真空下去除有机溶剂。
   3. 冷冻干燥水相，以承受铁氧胺作为红色固体。
5. N-苏基尼费洛沙胺的合成
   1. 在惰性气氛下50mL的圆形底瓶中，在50mL的血脂素中加入350毫克（3.50 mmol）的琥珀化氢化物溶液中，溶液中100毫克（0.17毫摩尔）的铁氧西胺。
   2. 在室温下搅拌产生的混合物 16 小时。之后，在旋转蒸发器中去除减压下多余的丙丁，以产生深红色固体。
   3. 将反应原油溶解在3 mL甲醇中。
   4. 将甲醇溶液转移到 Sephadex 柱中（20 厘米的 Sephadex，直径为 20 mm 柱），以 0.5 mL/min 的速度进行洗脱。
   5. 收集红色馏分，并使用旋转蒸发器在真空下去除甲醇。
6. 共聚物综合_{MNP@SiO2@NH@Fa}
   1. 用 DMF 冲洗 30 毫克干MNP@SiO₂@NH₂两次，并在 100 mL Erlenmeyer 烧瓶中声波纳米颗粒 30 分钟， 在惰性环境中。
   2. 制备N-苏基尼费洛沙胺（200毫克，0.30毫克），苯甲酸酮-1-yl-oxy-tris-（二甲基氨基）-磷六氟磷酸磷（BOP， 173毫克，0.45毫摩尔），1-羟基苯甲酸酯醇（HOBt，46毫克，0.39毫摩尔）和N，N-二糖丙胺（DIPEA，128.8毫克，1.21毫摩尔）在10 mL的DMF（Mix A）在50mL圆形底部瓶下惰性气氛。 N
   3. 使用气态气体大气 （Mix B） 在无氧条件下干燥下，暂停先前冲洗MNP@SiO₂@NH₂在 3 mL DMF 的蒸馏下。
   4. 添加混合 A 以按滴下混合 B。
   5. 在室温下，使用轨道振动器摇动最终混合物过夜。
   6. 使用磁铁将产生的偶联（MNP@SiO₂@NH@Fa）与悬架分开。
   7. 冲洗所得固体，然后用10mL乙醇将其声波5次。
   8. 在真空下干燥固体 24 小时。

2. 用Y.肠杆菌菌株进行细菌测定，以量化用纳米颗粒捕获致病菌

1. 在无菌2 mL管中，以1mg/mL的速度制备所有中间纳米颗粒的悬浮液和PBS中最后的结合物。
2. 在Luria Bertani （LB） 肉汤的 5 mL 中制备Y. 肠科利质培养，在 37 °C 下通宵孵育。
3. 通过加入50 μL的10 mM 2，2°-双皮质，制备5 mL缺铁锥性大豆汤（TSB）。
4. 用50μL的Y.肠科利质通宵培养剂对5 mL缺铁TSB进行接种，然后用搅拌在37°C孵育，直到达到OD₆₀₀ = 0.5\u20120.8。
5. 取100 μL的培养在步骤2.4中获得，并稀释在含有900μLPBS的2.0 mL管中，以获得第一次1/10稀释。然后，使用相同的程序从第一次稀释中制备1/100稀释，使细菌细胞浓度在1 x 10⁶殖民地形成单位（CFU）/mL左右。
6. 在2.0 mL管中加入100 μL的纳米颗粒悬浮液，在1mg/mL至1/100稀释细菌悬浮液的1/100mL中加入，并与涡旋均匀化。
7. 在20°C下孵育培养1小时。
8. 使用磁铁分离 MNP/细菌聚合，并小心地丢弃上清液。
9. 使用旋涡使用 1 mL PBS 冲洗分离的纳米粒子两次。
10. 将纳米粒子悬浮在 1 mL PBS 中，以计数 CFU/mL 中的细菌捕获量。
11. 准备四个连续的1/10稀释从以前的暂停，直到1 x 10^-4稀释达到。
12. 板 10 μL 的每个稀释剂到 TS agar 板上，并在 37 °C 下孵育过夜。
13. 在分白模式下用凝胶数字化器拍摄板。使用适当的软件处理图像以放大点以计数单个殖民地的数量。
    注:每个MNP中间体的特点是跟踪合成的进度。首先，XRD研究了裸奔，以检查晶体结构。然后，运行每个中间体的FT-IR频谱，以检查相应反应中发生的变化。还对每种中间体进行了拉曼光谱分析，以确认从FT-IR光谱中推断出的结论。TGA分析使我们能够估计其结构中带有有机材料的中间体的损耗重量。TEM研究了每种中间体的形态和大小。最后，XPS分析对于确定每个MNP中间表面的原子氧化状态和确认偶聚_{MNP@SiO2@NH@Fa}中的共价键形成至关重要。

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结果

进行了详尽的结构表征，以确定每个中间体和最终共聚体的形态和性质。为此，使用XRD、FT-IR、拉曼光谱、TGA、TEM、EDX映射和XPS技术来演示结合的形成。X射线光电子光谱（XPS）获得的纳米粒子表面原子的氧化状态是确认纳米粒子与侧视之间共价键形成的最相关数据。与这些结果一致，此协议是可重现的。

裸MNP、功能化的MN和结合体与PBS溶液中每个Y.肠科利质菌株混合。?...

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讨论

该协议描述了通过共价粘合合成磁性纳米粒子和侧磷铁氧胺的偶联。磁石的合成是使用Pinna等人⁵号报告的协议，然后是二氧化硅涂层，以保护水系统中腐蚀的磁芯，尽量减少聚集，并为功能化提供合适的表面^。对二氧化硅涂层工艺进行了修改。而不是执行三个涂层，如李等人⁶报告，MNPs在这种方法中涂有两层二氧化硅层（图2D）...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578