Sintesi di nanoparticelle magnetiche funzionalizzate, la loro coniugazione con la feroxamina Sideroforo e la sua valutazione per il rilevamento dei batteri

Riepilogo

Questo lavoro descrive i protocolli per la preparazione delle nanoparticelle magnetiche, il suo rivestimento con SiO₂, seguito dalla sua funzionalizzazione dell'amine con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e la sua coniugazione con deferoxamina utilizzando una moiety succinyl come linker. Una descrizione della caratterizzazione strutturale profonda e un assaggio di batteri di cattura utilizzando Y. enterocolitica per tutte le nanoparticelle intermedie e il coniugato finale sono anche descritti in dettaglio.

Abstract

Nel lavoro attuale, la sintesi delle nanoparticelle magnetiche, il suo rivestimento con SiO₂, seguita dalla sua funzionalizzazione dell'ammine con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e la sua coniugazione con deferoxamina, un siderophore riconosciuto da Yersinia enterocolitica,utilizzando una moiety succinyl come linker sono descritti.

Le nanoparticelle magnetiche (MNP) della magnetite (Fe₃O₄) sono state preparate con metodo solvothermal e rivestite con SiO₂ (MNP@SiO₂₎utilizzando il processo di Stober seguito dalla funzionalizzazione con APTES (MNP@SiO₂@NH₂). Poi, la feroxamina è stata coniugata con il MNP@SiO₂@NH₂ da accoppiamento carbodimide per dare MNP@SiO₂@NH₂@Fa. La morfologia e le proprietà del coniugato e degli intermedi sono state esaminate con otto diversi metodi, tra cui la diffrazione in polvere X-Ray (XRD), la spettroscopia a infrarossi trasformata di Fourier (FT-IR), la spettroscopia Raman, la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS), la microscopia elettronica di trasmissione (TEM) e la mappatura di dispersione energetica x-Ray (EDX). Questa caratterizzazione esaustiva confermò la formazione del coniugato. Infine, al fine di valutare la capacità e la specificità delle nanoparticelle, sono state testate in un test di cattura batteri utilizzando Yersinia enterocolitica.

Introduzione

I metodi di rilevamento dei batteri utilizzando MNP si basano sul riconoscimento molecolare di anticorpi, aptamers, bioproteine, carboidrati coniugati a MNP dai batteri patogeni¹. Tenendo conto che i siderofori sono riconosciuti da recettori specifici sulla membrana esterna dei batteri, potrebbero anche essere collegati a MNP per aumentare la loro specificità². I siderofori sono piccole molecole organiche coinvolte nell'assorbimento di Fe³ dai batteri^3,,4. La preparazione di coniugati tra siderophores e MNP insieme alla loro valutazione per la cattura e l'isolamento dei batteri non è ancora stata segnalata.

Uno dei passaggi cruciali nella sintesi di coniugati di nanoparticelle magnetiche con piccole molecole è la selezione del tipo di legame o di interazione tra di loro per garantire che la piccola molecola sia attaccata alla superficie del MNP. Per questo motivo, la procedura per preparare il coniugato tra nanoparticelle magnetiche e feroxamina - il sideroforo riconosciuto da Yersinia enterocolitica- si è concentrata sulla generazione di una superficie modificabile dell'MNP per consentire il collegamento covalente al sideroforo dalla chimica del carbodicolo. Al fine di ottenere una nanoparticelle magnetite uniformi (MNP) e per migliorare la nucleazione e il controllo delle dimensioni, una reazione di solvosi con alcool benzileè è stata trasportata in un blocco termico senza agitare⁵. Poi, un rivestimento di silice è stato generato dal metodo St'ber per conferire protezione e migliorare la stabilità delle sospensioni nanoparticelle in un supporto acquoso⁶. Tenendo conto della struttura della ferosamina, l'introduzione di gruppi di ammina è necessaria per produrre nanoparticelle adatte (MNP@SiO₂@NH₂) da coniugare con il siderophore. Ciò è stato ottenuto condensando (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) con i gruppi alcolici presenti sulla superficie delle nanoparticelle modificate di silice (MNP@SiO₂₎utilizzando un metodo sol-gel⁷.

Parallelamente, il complesso di ferro di ferosamina(III) è stato preparato con la complessità della deferoxamina disponibile in commercio con acetonato di acetil di ferro in soluzione aques. N-succinylferoxamina, recante gruppi di succinyl che fungeranno da linker, è stata ottenuta dalla reazione della feroxamina con anidride succinica.

La coniugazione tra MNP@SiO₂@NH₂ e N-succinylferoxamine per dare MNP@SiO₂@NH_-Fa è stata effettuata attraverso la chimica del carbodiimide utilizzando come reagenti di accoppiamento benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosofanio esafluorofosfato (BOP) e 1-idrossibenzotriazolo (HOBt) in un supporto di base morbido per attivare il gruppo di acido terminale in N-succinylferoxamine⁸.

Una volta che gli MNP sono stati caratterizzati, abbiamo valutato le capacità delle nanoparticelle magnetiche nude e funzionaliste per catturare il tipo selvaggio (WC-A) e un mutante di Y. enterocolitica privo del recettore della feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). Gli MNP semplici, gli MNP funzionalizzati e i coniugati MNP@SiO₂@NH_-Fa sono stati autorizzati a interagire con ogni ceppo Y. enterocolitica. Gli aggregati battericoconiugi sono stati separati dalla sospensione dei batteri dall'applicazione di un campo magnetico. Gli aggregati separati sono stati sciacquati due volte con la salina tampina tamponata di fosfato (PBS), ri-sospesi in PBS per preparare le diluizioni seriali e poi, sono stati placcati per il conteggio delle coccie. Questo protocollo dimostra ogni fase della sintesi di MNP@SiO₂@NH@Fa, la caratterizzazione strutturale di tutti gli intermedi e il coniugato, e un analisi di cattura del batterio come un modo semplice per valutare la specificità del coniugato in relazione agli intermedi. 9 (in ^vie

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Protocollo

NOTA: Per le reazioni eseguite in condizioni di atmosfera inerte, tutte le vetrerie sono state precedentemente essiccate in forno a 65 gradi centigradi, sigillate con un setto di gomma e eliminate con argon tre volte.

1. Sintesi di nanoparticelle magnetiche coniugate con feroxamina

1. Sintesi di Fe₃O₄ nanoparticelle magnetiche (MNP)
   1. Aggiungere 0,5 g di Fe (acac)₃ in una fiala di vetro da 20 mL e quindi mescolare con 10 mL di alcool benzile.
   2. Sonicare questa miscela per 2 min, quindi trasferire in un blocco di riscaldamento e riscaldare a 180 gradi centigradi per 72 h.
   3. Una volta completata la reazione, lasciare raffreddare le fiale, sciacquare le nanoparticelle con 96% etanolo e centrifugare a 4000 x g per 30 min. Ripetere la centrifuga almeno due volte.
   4. Separare le nanoparticelle dal supernatante per attrazione magnetica utilizzando un magnete neodimium (NdFeB) e scartare il solvente residuo.
   5. Risciacquare con 96% etanolo ripetendo il passo 1.1.4. e scartare il supernatante alternando alla sonicazione in un bagno per 1 min a 40 kHz fino a quando il solvente sembra chiaro.
2. Nanoparticelle magnetiche Rivestimento SiO₂ (MNP@SiO₂)
   1. Preparare una sospensione di 2 g di MNP in 80 mL di isopropanolo e quindi aggiungere 4 mL di 21% ammoniaca, 7,5 mL di acqua distillata e 0,56 mL di orthosilicate tetraetil (TEOS) (in questo ordine) in un fiascheggio inferiore rotondo con una barra di agitazione magnetica.
   2. Riscaldare il composto a 40 gradi centigradi per 2 h con agitazione continua e poi sonicare per 1 ora.
   3. Separare l'MNP con un magnete, scartare il supernatante e disperderlo in 30 mL di isopropanolo.
   4. Ripetere i passaggi 1.2.1. e 1.2.2.
   5. Rimuovere e lavare la barra magnetica di agitazione con 96% di etanolo per recuperare tutto il materiale.
   6. Separare le nanoparticelle dal supernatante per attrazione magnetica utilizzando un magnete.
   7. Scartare il supernatante e sciacquare le nanoparticelle con il 96% di etanolo tre volte alternandosi alla sonicazione.
   8. Asciugare le nanoparticelle sotto vuoto a temperatura ambiente per 12 ore.
3. Funzionalizzazione del MNP@SiO₂ con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
   1. Risciacquare 500 mg del MNP@SiO₂ ottenuto dal passaggio precedente con N,N-dimethylformamide (DMF) sotto atmosfera inerte e poi sonicare per 1 min a 40 kHz. Quindi, scartare il supernatante e ripetere questo processo tre volte.
   2. Sospendere nuovamente le particelle in un flacone inferiore rotondo, sotto agitazione con una barra di stirazione magnetica e aggiungere 9 mL di APTES.
   3. Mescolare il composto a 60 gradi centigradi per 12 h.
   4. Scartare il supernatante e sciacquare le nanoparticelle con il 96% di etanolo tre volte alternandosi alla sonicazione.
4. Sintesi di feroxamina
   1. Sciogliere 100 mg (0,15 mmol) di sale di deferoxamina mesylate e 53,0 mg (0,15 mmol) di Fe(acac)₃ in 5 mL di acqua distillata e mescolare la miscela durante la notte a temperatura ambiente.
   2. Lavare il prodotto risultante tre volte con 20 mL di EtOAc in un imbuto di separazione e quindi rimuovere il solvente organico sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotatorio.
   3. Asciugare a secco la fase acquosa per permettersi la feroxamina come solido rosso.
5. Sintesi di N-succinylferoxamine
   1. Aggiungere 350 mg (3,50 mmol) di anidride succinica a una soluzione di 100 mg (0,17 mmol) di feroxamina in 5 mL di pilride in una fiaschetta rotonda da 50 mL sotto atmosfera inerte.
   2. Mescolare la miscela risultante a temperatura ambiente per 16 h. Dopo quel tempo, rimuovere l'eccesso di piridina sotto pressione ridotta in un evaporatore rotatorio per dare un solido rosso scuro.
   3. Sciogliere il greggio di reazione in 3 mL di metanolo.
   4. Trasferire la soluzione metanolica in una colonna di Sephadex (20 cm di Sephadex in una colonna di diametro di 20 mm) ed elutare a 0,5 mL/min.
   5. Raccogliere la frazione rossa e rimuovere il metanolo sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotatoria.
6. Sintesi del coniugato MNP@SiO₂@NH@Fa
   1. Risciacquare 30 mg di MNP@SiO secco₂@NH₂ due volte con DMF e sonicare le nanoparticelle in una fiaschetta Erlenmeyer da 100 ml per 30 min sotto atmosfera inerte.
   2. Preparare una soluzione di N-succinylferoxamine (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosofanio hexafluorophofosfato (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-idrossibenzotriazole (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) e N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21mmol) in 10 mL di DMF (Mix A) in un'atmosfera di flistre a fondo rotondo da 50 mL.
   3. Sospendere il MNP@SiO_{precedentemente}sciacquato 2 @NH₂ in 3 mL di DMF sotto la sonicazione a secco in condizioni di assenza di ossigeno utilizzando un'atmosfera di gas argon (Mix B).
   4. Aggiungere il mix A per mescolare B dropwise.
   5. Agitare la miscela finale utilizzando uno shaker orbitale a temperatura ambiente durante la notte.
   6. Separare il coniugato risultante (MNP@SiO₂@NH@Fa) dalla sospensione utilizzando un magnete.
   7. Sciacquare il solido risultante e poi, sonicare cinque volte con 10 mL di etanolo.
   8. Asciugare il solido sotto vuoto per 24 ore.

2. L'assaggio batterico con ceppi di Y. enterocolitica per quantificare la cattura di batteri patogeni con nanoparticelle

1. Preparare una sospensione di tutte le nanoparticelle intermedie e il coniugato finale in PBS a 1 mg/mL in sterili tubi da 2 mL.
2. Preparare una cultura di Y. enterocolitica in 5 mL di luria Bertani (LB) inincubazione durante la notte a 37 gradi centigradi.
3. Preparare un 5 mL di brodo di soia triplicato (TSB) di 5 mL aggiungendo 50 -L di 10 mMM 2,2'-bipyridyl.
4. Inoculare i 5 mL di TSB carente di ferro con 50 -L della cultura notturna di Y. enterocolitica e poi, incubare a 37 s con agitazione fino a quando non viene raggiunto un OD₆₀₀ - 0.5-u20120.8.
5. Prendere 100 l della coltura ottenuta al passo 2.4 e diluire in un tubo da 2,0 mL contenente 900 -L di PBS per ottenere una prima diluizione di 1/10. Quindi, preparare una diluizione di 1/100 dalla prima diluizione utilizzando la stessa procedura per ottenere una concentrazione di cellule batteriche a 1 x 10⁶ unità formanti colonia (CFU)/mL circa.
6. Aggiungete 100 l di sospensione nanoparticelle a 1 mg/mL a 1 mL della diluizione di 1/100 della sospensione batterica in un tubo da 2,0 mL e omogeneizzare con il vortice.
7. Incubare la coltura a 20 gradi centigradi per 1 ora.
8. Separare gli aggregati MNP/batteri utilizzando un magnete e scartare attentamente il supernatale.
9. Sciacquare le nanoparticelle separate due volte con 1 mL PBS utilizzando un vortice.
10. Sospendere le nanoparticelle in 1 mL di PBS per contare la quantità di cattura batterica in CFU/mL.
11. Preparare quattro diluizioni successive 1/10 dalla precedente sospensione fino a raggiungere una diluizione 1 x 10^-4.
12. Piastra 10 -L di ciascuna piastre di agar TS e incubarle a 37 gradi durante la notte.
13. Fotografare la piastra con un digitaliizzatore gel in modalità epi bianco. Elaborare l'immagine con un software appropriato per amplificare un punto per contare il numero di singole colonie.
    NOTA: Ogni intermedio MNP è stato caratterizzato per seguire l'avanzamento della sintesi. In primo luogo, gli MP nudi sono stati studiati da XRD per controllare la struttura cristallina. Quindi, è stato eseguito lo spettro FT-IR di ogni intermedio per verificare i cambiamenti che si sono verificati nella reazione corrispondente. È stata inoltre effettuata un'analisi spettroscopia Raman di ogni intermedio al fine di confermare le conclusioni dedotte dagli spettri FT-IR. L'analisi TGA ci ha permesso di stimare il peso di perdita degli intermedi recanti materiale organico nella sua struttura. La morfologia e le dimensioni di ogni intermedio sono state studiate da TEM. Infine, l'analisi XPS è stata fondamentale per determinare gli stati di ossidazione dell'atomo su ciascuna superficie intermedia MNP e per confermare la formazione di legami covalenti nel coniugato MNP@SiO₂@NH@Fa.

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Risultati

Viene effettuata una caratterizzazione strutturale esaustiva al fine di determinare la morfologia e le proprietà di ogni intermedio e il coniugato finale. A tale scopo, le tecniche XRD, FT-IR, Raman spettroscopy, TGA, TEM, mappatura EDX e XPS sono utilizzati al fine di dimostrare la formazione del coniugato. Gli stati di ossidazione degli atomi sulla superficie delle nanoparticelle acquisite dalla spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) sono i dati più rilevanti per confermare la formazione di legami covalenti tr...

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Discussione

Questo protocollo descrive la sintesi di un coniugato tra nanoparticelle magnetiche e la ferosamina sideroforo mediante incollaggio covalente. La sintesi della magnetite è stata effettuata utilizzando il protocollo riportato da Pinna et al.⁵ seguito dal rivestimento in silice per proteggere il nucleo magnetico della corrosione nei sistemi acquosi, per ridurre al minimo l'aggregazione e per fornire una superficie adatta per la funzionalizzazione⁶. Il processo di rivestiment...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578