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要約

この研究は、磁気ナノ粒子の調製のためのプロトコル、SiO2でのコーティング、続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、コクニル部分をリンカーとして使用したデフェキサミンとの結合を説明する。すべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートに対してY.エンゴコリティカを用いた深い構造特性評価の説明および捕獲細菌アッセイも詳細に説明する。

要約

本研究では、磁気ナノ粒子の合成、SiO2によるそのコーティング、2続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、エルシニアエンゴコリチカによって認識される副腎泳動であるデフェオキシアミンとの共役が、コルチニル部分をリンカーとして用いた。

マグネタイト(Fe3O4)の磁性ナノ3粒子(MNP)をソルボ熱法で調製し、ステーバー法を用いてSiO2(MNP@SiO2)で被覆し、続いてAPTESとの官能化を行い、その後にAPTES(MNP@SiO2@NH2)を用いた。2 222次いで、フェロキサミンをカルボジイミドカップリングによりMNP@SiO2@NH2と共役し、MNP@SiO2@NH2@Faを与えた。222コンジュゲートおよび中間体の形態と特性は、粉末X線回折(XRD)、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)、ラマン分光法、X線光電子分光(XPS)、透過電子顕微鏡(TEM)、エネルギー分散X線(EDX)マッピングを含む8つの異なる方法で調べた。この徹底的な特徴付けにより、コンジュゲートの形成が確認された。最後に、ナノ粒子の容量と特異性を評価するために、それらは、エルシニアエンテオコリチカを用いた捕獲細菌アッセイで試験した。

概要

MNPを用いた細菌検出方法は、抗体の分子認識に基づく、アプタマー、バイオプロテイン、病原性細菌1によってMNPに結合した炭水化物。シレブロフォアは細菌の外膜上の特定の受容体によって認識されることを考慮に入れて、彼らはまた、それらの特異性を増加させるためにMNPにリンクすることができます2.シドロフォアは、細菌3、44によるFe3+取り込み3に関与する小さな有機分子である。サイドロフォアとMNPの間のコンジュゲートの調製と、細菌の捕獲および単離に対する評価はまだ報告されていない。

小分子を用いた磁性ナノ粒子のコンジュゲート合成における重要なステップの1つは、MNPの表面に小分子が結合していることを確認するために結合の種類または相互作用の選択である。このため、磁気ナノ粒子とフェロキサミン(エルシニア・エンゴコリチカが認識するシドロフォア)とのコンジュゲートを調製する手順は、MNPの変更可能な表面の生成に焦点を当て、カルボジイミド化学によってシデロフォアに共有結合することを可能にした。均一なマグネタイトナノ粒子(MNP)を得るために、核形成及びサイズ制御を改善するために、ベンジルアルコールとのソルボ分解反応を、振盪せずに熱ブロック中に運んだ。次いで、水性媒体6におけるナノ粒子懸濁液の保護と安定性を向上させるステーバー法によりシリカコーティングを生成した。フェロキサミンの構造を考慮して、シデロフォアと共役する適切なナノ粒子(MNP@SiO2@NH2)2を生成するためにアミン基の導入が必要である。2これは、ソルゲル法7を用いてシリカ改変ナノ粒子(MNP@SiO2)の表面に存在するアルコール基を用いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(apTES)の凝縮によって達成された。

並行して、フェロキサミン鉄(III)錯体は、水溶液中のアセチルアセトネートの鉄と市販のデフェオキサミンを複合化することによって調製した。N-スクシニルフェロキサミンは、リンカーとして作用するスクシニル基を持ち、コハク酸無水とフェロキサミンの反応により得られた。

MNP@SiO2@NH22とN-succinylferoxamineの間の結合は、MNP@SiO2@NH@Fa@を与えるために、カップリング試薬ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-()を使用してカルボジイミド化学を介して行った( ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸(BOP)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を軟質塩基性培地中でN-スクシニルフェロキサミン8中の末端酸基を活性化する。 N2

MPが特徴付けられると、野生型(WC-A)およびフェロキサミン受容体FoxAを欠くY.エンテオコリチカ(FoxA WC-A 12-8)の変異体を捕捉する、裸で機能的な磁気ナノ粒子の能力を評価した。プレーンMP、機能化されたMPおよび共役MNP@SiO2@NH@Faは、各@Y.エンゴコリチカ株と相互作用することを許可した。バクテリア共役凝集体を、磁場の印加により細菌懸濁液から分離した。分離した凝集体をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で2回リンスし、PBSで再懸濁して連続希釈を調製し、次いでコロニー計数用にメッキした。このプロトコルは、MNP@SiO2@NH@Faの合成の各ステップ、全ての中間体および共役体の構造的特徴付け、および中間体に関するコンジュゲートの特異性を評価する容易な方法として細菌捕獲アッセイを示す。9

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プロトコル

注:不活性雰囲気条件下で行われた反応については、すべてのガラス製品は、以前に65°Cでオーブンで乾燥し、ゴム中隔で密封し、アルゴンで3回パージしました。

1. フェロキサミンと共役した磁性ナノ粒子の合成

  1. Fe3O4磁性ナノ粒子(MP)の合成
    1. 20 mLガラスバイアルに0.5gのFe(acac)3を加え、10mLのベンジルアルコールと混ぜます。3
    2. この混合物を2分間超音波処理し、加熱ブロックに移し、180°Cで72時間加熱します。
    3. 反応が完了したら、バイアルを冷却し、ナノ粒子を4000 x gで4000 x gで30分間リンスし、遠心分離を少なくとも2回繰り返します。
    4. ネオジム(NdFeB)磁石を用いて磁力引力により上清からナノ粒子を分離し、残留溶媒を廃棄する。
    5. 96%エタノール繰り返し工程1.1.4でリンスする。そして溶媒が透明に見えるまで40 kHzで1分間の浴中で超音波処理と交互に上清を捨てます。
  2. 磁気ナノ粒子 SiO2コーティング(MNP@SiO2)
    1. 80 mLのイソプロパノールでMNPの2gの懸濁液を調製し、4 mLの21%アンモニア、7.5mLの蒸留水、0.56 mLのテトラエチルオルソケイ酸(TEOS)を磁気攪拌棒で丸底フラスコに加えます。
    2. 連続撹拌で40°Cで2時間加熱し、1時間超音波処理します。
    3. MNPを磁石で分離し、上清を捨て、イソプロパノールの30mLに分散させる。
    4. 手順 1.2.1 を繰り返します。および 1.2.2.
    5. 96%エタノールで磁気攪拌棒を取り出して洗浄し、すべての材料を回収します。
    6. 磁石を用いて磁力で上清からナノ粒子を分離する。
    7. 上清を捨て、超音波処理と交互に96%エタノールでナノ粒子をすすいだ。
    8. 室温でナノ粒子を真空下で12時間乾燥させます。
  3. トリエトキシシラン(3-アミノプロピル)を用いたMNP@SiO2の機能化
    1. 前工程から得られたMNP@SiO2の500mgを不活性雰囲気下でN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)でリンスし、40kHzで1分間超音波処理する。その後、上清を捨てて、この処理を3回繰り返します。
    2. 丸い底フラスコで粒子を再懸濁し、磁気攪拌棒で攪拌し、9 mLのAPTESを加えます。
    3. 混合物を60°Cで12時間かき混ぜます。
    4. 上清を捨て、超音波処理と交互に96%エタノールでナノ粒子をすすいだ。
  4. フェロキサミンの合成
    1. 100mg(0.15ミリモル)のデフェキサミンメシル酸塩と53.0mg(0.15 mmol)のFe(acac)33を蒸留水5mLに5mLで溶解し、室温で一晩攪拌します。
    2. 得られた生成物を分離漏斗で20mLのEtOAcで3回洗浄し、次いで、回転エバポレーターを使用して真空下で有機溶媒を除去する。
    3. 水相を凍結乾燥させて、フェロキサミンを赤い固体として手に入れる。
  5. N-スクシニルフェロキサミンの合成
    1. 350mg(3.50 mmol)のコハク酸無水物を、不活性雰囲気下の50mLの丸底フラスコで5mLのピリジン中のフェロキサミン100mg(0.17ミリモル)の溶液に加えます。
    2. 得られた混合物を室温で16時間かき混ぜます。その後、回転エバポレーターで減圧下でピリジンの過剰を除去し、濃い赤色の固形物を得た。
    3. 反応粗物を3mLのメタノールに溶解する。
    4. メタノール溶液をセファデックスカラム(直径20mmの列に20cmのセファデックス)に移し、0.5 mL/minで溶出します。
    5. 赤い分画を収集し、回転エバポレーターを使用して真空下でメタノールを除去します。
  6. コンジュゲートMNP@SiO2@NH@Faの合成
    1. 乾燥MNP@SiO2の30mgをDMFで2回@NHし、ナノ粒子を100 mLのエルレンマイヤーフラスコで30分間不活性雰囲気下で30分間超音波処理します。
    2. N-スクシニルフェロキサミン(200mg、0.30ミリモル)、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-(ジメチルアミノ)-六フッ化ホスホウ酸ホスホニウム(BOP、 173 mg, 0.45 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt, 46 mg, 0.39 mmol) およびN,N-ジイソプロピレチルアミン (DIPEA, 128.8 mg, 1.21 mmol) DMF (混合 A) の 10 mL で DMF (混合 A) 下で 50 mL のラウンド底フラスコス.
    3. アルゴンガス雰囲気(Mix B)を2使用して、乾燥した無酸素条件下での超音波処理の下でDMFの3mLで2@NH2をすすったMNP@SiOを中断します。
    4. ミックスAを加える B ドロップワイズをミックスします。
    5. 室温でオービタルシェーカーを使用して最終混合物を一晩振ります。
    6. 得られたコンジュゲート(MNP@SiO2@NH@Fa)を磁石を用いて懸濁液から分離する。
    7. 得られた固体をリンスし、エタノールの10 mLでそれを5回超音波処理します。
    8. 真空下で固体を24時間乾燥させます。

2. ナノ粒子を用いた病原性細菌の捕獲を定量化するY.エンテゴコリチ株による細菌アッセイ

  1. 滅菌2 mLチューブで1mg/mLでPBS内のすべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートの懸濁液を調製します。
  2. ルリア・ベルタニ(LB)の5mLでY.エンゴコリティカの培養を37°Cで一晩インキュベートして準備します。
  3. 鉄欠損トリプティック大豆ブロス(TSB)の50 μLを10 mM 2,2′ビピリジルを加えて調製します。
  4. 5 mLの鉄欠乏性TSBをY.エンゴコリチの一晩培養物の50 μLで接種し、OD600 = 0.5\u20120.8に達するまで撹拌して37°Cでインキュベートする。
  5. ステップ2.4で得られた培養液の100μLを取り、900μLのPBSを含む2.0 mLチューブで希釈し、最初の1/10希釈を得た。次に、同じ手順を使用して最初の希釈から1/100希釈液を調製し、1 x 106コロニー形成ユニット(CFU)/mLで細菌細胞の濃度をほぼ得る。
  6. 2.0 mLチューブの細菌懸濁液1/100希釈液の1mg/mLで1mg/mLのナノ粒子懸濁液を100μL加え、渦で均質化します。
  7. 培養液を20°Cで1時間培養する。
  8. 磁石を用いてMNP/バクテリアの凝集体を分離し、上清を慎重に捨てます。
  9. ボルテックスを使用して1 mL PBSで分離したナノ粒子を2回リンスする。
  10. ナノ粒子をPBSの1 mLで懸濁し、CFU/mLでの細菌捕獲量をカウントします。
  11. 前の懸濁液から1 x10-4希釈に達するまで4回連続して1/10希釈液を調製する。
  12. 各希釈液を10μLずつTS寒天プレートにプレートし、一晩で37°Cでインキュベートします。
  13. エピホワイトモードでゲルデジタイザーでプレートを撮影します。個々のコロニーの数を数えるためにスポットを増幅するために適切なソフトウェアで画像を処理します。
    注:各MNP中間体は、合成の進捗状況をフォローアップすることを特徴としました。まず、結晶構造を確認するためにXRDによって裸のMPを研究した。次いで、各中間体のFT-IRスペクトルを実行し、対応する反応で生じた変化をチェックした。また、各中間体のラマン分光分析もFT-IRスペクトルから推測された結論を確認するために行った。TGA分析により、有機材料を持つ中間体の重量の損失を推定することができました。各中間体の形態および大きさをTEMによって研究した。最後に、XPS分析は、各MNP中間表面における原子酸化状態を決定し、コンジュゲートMNP@SiO2@NH@Faにおける共有結合形成を確認するために重要であった。

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結果

各中間体と最終コンジュゲートの形態と特性を決定するために、徹底的な構造特性化が行われます。この目的のために、技術XRD、FT-IR、ラマン分光法、TGA、TEM、EDXマッピングおよびXPSは、共役体の形成を実証するために使用される。X線光電子分光法(XPS)によって獲得されたナノ粒子の表面における原子の酸化状態は、ナノ粒子とシドロフォアとの間の共有結合の形成を確認するための最も関?...

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ディスカッション

このプロトコルは、共有結合による磁性ナノ粒子とシドロフォアフェロキサミンとのコンジュゲートの合成を記述する。マグネタイトの合成は、水系における腐食の磁気コアを保護するためにシリカコーティングを続けて、ピナら5によって報告されたプロトコルを用いて行い、凝集を最小限にし、機能化に適した表面を提供する6。シリカコーティング工?...

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

著者らは、クラウス・ハントケ教授(ドイツ・テュービンゲン大学)が、この研究で使用されたエルシニア・エンテオコリティカ株を親切に供給してくれたことを感謝する。この研究は、欧州連合(EU)のFEDERプログラムが共同出資するスペインの国家研究機関(AEI/FEDER)からのAGL2015-63740-C2-1/2-RおよびRTI2018-093634-B-C22(AEI/FEDER、EU)からの助成金によって支えられました。サンティアゴ・デ・コンポステーラ大学とア・コルーニャ大学での研究も、GC2018/018、GRC2018/039、およびED431E 2018/03(CICA-INIBIC戦略グループ)の助成金によって支えられ、Xunta de Galiciaから。最後に、このビデオプロトコルのボイスオフを行う彼女の素晴らしいコラボレーションのためにヌリアカルボに感謝したいと思います。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT		Acros300561000
2,2′-BipyridylSigma AldrichD216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%Acros151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3Sigma Aldrich338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP ReagentAcros209800050
Benzyl alcoholSigma Aldrich822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)Sigma AldrichD9533
Ethanol, anhydrous, 96%Panreac131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%Sigma AldrichF300
LB Broth (Lennox)Sigma AldrichL3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSealAcros459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSealAcros326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSealAcros339421000
Sephadex LH-20Sigma AldrichLH20100
Succinic anhydride >99%Sigma Aldrich239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%Sigma Aldrich86578

参考文献

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