סינתזה של חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הקוניוגציה שלהם עם הסידרפפור פראאוקמין והערכתה לאיתור חיידקים

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקולים להכנת חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הציפוי שלה עם SiO₂, ואחריו פונקציונליזציה האמין שלה עם (3-aminopropyl) triethoxysilane (aptes) ואת הקוניוגציה שלה עם דפרוקסמין באמצעות moiety מקשר. תיאור מבני עמוק באפיון וחיידק לכידת שיטת Y. enterocolitica עבור כל חלקיקי ביניים המשלים הסופי מתוארים גם בפרוטרוט.

Abstract

בעבודה הנוכחית, סינתזה של חלקיקים מגנטיים, הציפוי שלה עם SiO₂, ואחריו הפונקציונליזציה של האמין שלה עם (3-aminopropyl) triethoxysilane (aptes) ואת הקונאוציה שלה עם deferoxamine, siderophore המזוהה על ידי yersinia enterocolitica, באמצעות moiety סוקסיל כמקשר מ

חלקיקים מגנטיים (MNP) של מגנטיט (Fe₃O₄) הוכנו על ידי שיטת solvothermal מצופה עם SiO₂ (MNP@SiO₂) באמצעות תהליך STÖBER ואחריו פונקציונליזציה עם aptes (MNP@SiO₂@NH₂). לאחר מכן, פראוקאמין היה מצועם עם MNP@SiO₂@NH₂ על ידי צימוד קרבודיאימיד לתת MNP@SiO₂@NH₂@Fa. המבנה והמאפיינים של המשלים והintermediates נבדקו על-ידי שמונה שיטות שונות, כולל עקיפה לקרני רנטגן (XRD), ספקטרוסקופיית פורייה (FT-IR), ספקטרוסקופיית, מיקרוסקופית רנטגן, ספקטרוסקופיית פוטואלקטרון (XPS), מיקרוסקופ אלקטרוני של שידור (TEM) ואנרגיה מפזרים מיפוי רנטגן. אפיון ממצה זה אישר את היווצרות המשלים. לבסוף, על מנת להעריך את היכולת ואת הספציפיות של חלקיקי חלקיקים, הם נבדקו בחיידק לכידת שיטת הלכידה באמצעות Yersinia בידור.

Introduction

שיטות גילוי חיידקים באמצעות MNP מבוססים על הכרה מולקולרית של נוגדנים, aptamers, ביופרוטאין, פחמימות מצופני MNP על ידי חיידקים פתוגניים¹. נטילת בחשבון כי siderophores מזוהים על ידי קולטנים ספציפיים על הקרום החיצוני של חיידקים, הם יכולים גם לקשר MNP כדי להגדיל את הספציפיות שלהם². Siderophores הם מולקולות אורגניות קטנות מעורב Fe^{3 +} ספיגה על ידי חיידקים^3,4. הכנת שערי מעלה בין siderophores ו MNP יחד עם ההערכה שלהם ללכוד ובידוד של חיידקים עדיין לא דיווחו.

אחד השלבים הקריטיים בסינתזה של שערי מעלה של חלקיקים מגנטיים עם מולקולות קטנות היא הבחירה של סוג של קשר או אינטראקציה ביניהם כדי להבטיח כי המולקולה הקטנה מחוברת למשטח של MNP. מסיבה זו, ההליך להכין את המשלים בין חלקיקים מגנטיים ופראוקמין-הסידרפור המזוהה על ידי Yersinia בידור-היה ממוקד בדור של משטח מאפשר של mnp כדי לאפשר קישור זה מתוך הסידרפור על ידי כימיה קרבודיאימיד. על מנת לקבל חלקיקים מגנטיט אחיד (MNP) ולשפר את הנוקלאוציה ובקרת גודל, תגובה solvolysis עם אלכוהול בנזיל נישא בלוק תרמי מבלי לרעוד⁵. לאחר מכן, ציפוי סיליקה נוצר על ידי שיטת Stöber כדי להעניק הגנה ולשפר את היציבות של השעיית חלקיקים במדיה מימית⁶. נטילת בחשבון את המבנה של feroxamine, המבוא של קבוצות אמין הוא הכרחי כדי לייצר חלקיקים מתאימים (MNP@SiO₂@NH₂) כדי להיות מצופף עם siderophore. זה הושג על ידי עיבוי (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) עם קבוצות אלכוהול להציג על פני השטח של חלקיקי סיליקה שונה (MNP@SiO₂) באמצעות שיטת sol-ג'ל⁷.

במקביל, הקומפלקס feroxamine ברזל (III) הוכנו על ידי הcomplexation של מסחרית דפרוקסמין עם ברזל מרחלי באמצעות מימית הפתרון. N-סוסוסוקסימין, הנושאת קבוצות סוקסיניות שיפעלו כלינטים, הושגה על ידי תגובת פראוקמין עם אנהידריד סוקסילי.

הקוניוגציה בין MNP@SiO₂@NH₂ ו- N-סוקסיאמין לתת MNP@SiO₂@NH_-Fa בוצעה באמצעות כימיה קרבודיאימיד באמצעות הצימוד ריאגנטים benzotriazole-1-yl-אוקסי-טריס-(dimethylamino)-פוספוניום hexafluorophosphate (בופ) ו-1-hydroxybenzotriazole (הובט) במדיה בסיסית רכה כדי להפעיל את הקבוצה חומצה מסוף ב N-סולילפראמין⁸.

לאחר MNPs היו מאופיינים, הערכנו את היכולות של חלקיקים מגנטיים חשופים ופונקציונליזציה כדי ללכוד פראי סוג (WC-A) ומוטציה של Y. enterocolitica חסר קולטן פראוקאמין FoxA (FOXA WC-A 12-8). מאוד מסוג MNPs, הפונקציונליות של MNPs והמשלים MNP@SiO₂@NH_@הפא הורשו לקיים אינטראקציה עם זן Y. enterocolitica . החיידקים המשלים האגרגטים הופרדו החיידקים ההשעיה על ידי יישום של שדה מגנטי. האגרגטים המופרדים שטפו פעמיים בתמיסת מלח (PBS), מושעה מחדש ב-PBS כדי להכין מדלל סדרתי ולאחר מכן הם היו מצופים לספירת המושבה. פרוטוקול זה ממחיש כל שלב של הסינתזה של MNP@SiO₂@NH @Fa, האפיון המבני של כל הintermediates והמשלים, ושיטת לכידת החיידק כדרך קלה להעריך את הספציפיות של המשלים ביחס לintermediates. מיכל בן ¹⁰

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: לתגובות שבוצעו תחת תנאי אטמוספירה אינרטי, כל כלי הזכוכית התייבשו בעבר בתנור ב-65 ° c, אטום במחיצת גומי ומטוהר בארגון שלוש פעמים.

1. סינתזה של חלקיקים מגנטיים מצועם עם פראוקמין

1. סינתזה של Fe₃O₄ חלקיקים מגנטיים (mnps)
   1. הוסף 0.5 g של Fe (acac)₃ בבקבוקון זכוכית 20 מ ל ולאחר מכן לערבב עם 10 מ ל של אלכוהול בנזיל.
   2. Sonicate תערובת זו עבור 2 דקות, ואז להעביר בלוק חימום חום ב 180 ° c עבור 72 h.
   3. לאחר התגובה הושלמה, לאפשר את הבקבוקונים להתקרר, לשטוף את חלקיקי חלקיקים עם 96% אתנול ו צנטריפוגה ב 4000 x g עבור 30 דקות. לחזור על צנטריפוגה לפחות פעמיים.
   4. הפרד חלקיקים מן supernatant על ידי אטרקציה מגנטית באמצעות המגנט ניאודימיום (NdFeB) ולהיפטר שיורית ממיס.
   5. לשטוף עם 96% האתנול צעד חוזר שלב 1.1.4. ולהיפטר supernatant לסירוגין עם sonication באמבטיה עבור 1 דקות ב 40 kHz עד הממס נראה ברור.
2. מגנטית חלקיקים SiO₂ ציפוי (MNP@SiO₂)
   1. הכינו השעיה של 2 גרם MNP ב 80 mL של איזופנול ולאחר מכן להוסיף 4 מ ל של 21% אמוניה, 7.5 מ ל של מים מזוקקים ו 0.56 mL של הטטראתיל אורתוסטיסיליקט (TEOS) (בסדר זה) בבקבוקון התחתון עגול עם בר מגנטי המהומה.
   2. לחמם את התערובת ב 40 ° c עבור 2 h עם ערבוב רציפה ולאחר מכן sonicate עבור 1 h.
   3. הפרד את ה-MNP עם מגנט, מחק את הסופרנטנט ופזר אותו ב -30 מ ל של איזופנול.
   4. חזור על שלבים 1.2.1. ו1.2.2.
   5. להסיר ולשטוף את בר המהומה המגנטי עם 96% אתנול כדי לשחזר את כל החומר.
   6. להפריד את חלקיקי חלקיקים מן supernatant על ידי אטרקציה מגנטית באמצעות מגנט.
   7. להיפטר supernatant ולשטוף את חלקיקי חלקיקים עם 96% אתנול שלוש פעמים לסירוגין עם sonication.
   8. לייבש את חלקיקי חלקיקים תחת ואקום בטמפרטורת החדר עבור 12 h.
3. הפונקציונליזציה של MNP@SiO₂ עם (3-aminopropyl) triethoקסיסטן (aptes)
   1. לשטוף 500 מ"ג של MNP@SiO₂ שהתקבלו מן השלב הקודם עם N, n-diמתילמיד (dmf) תחת האווירה האינרטי ולאחר מכן sonicate עבור 1 דקות ב 40 kHz. לאחר מכן, בטל את הסופרנטנט וחזור על תהליך זה שלוש פעמים.
   2. מחדש להשעות את החלקיקים בבקבוקון התחתון עגול, תחת ערבוב עם בר מגנטי לערבב ולהוסיף 9 מ ל של APTES.
   3. מערבבים את התערובת ב-60 ° c עבור 12 שעות.
   4. להיפטר supernatant ולשטוף את חלקיקי חלקיקים עם 96% אתנול שלוש פעמים לסירוגין עם sonication.
4. סינתזה של פראוקמין
   1. לפזר 100 mg (0.15 mmol) של מלח דפרוקסמין ו 53.0 mg (0.15 mmol) של Fe (acac)₃ ב 5 מ ל של מים מזוקקים ומערבבים את התערובת לילה בטמפרטורת החדר.
   2. שטוף את המוצר כתוצאה שלוש פעמים עם 20 מ ל של אטואק במשפך הפרדה ולאחר מכן, הסר את הממס האורגני תחת ואקום באמצעות מאייד.
   3. להקפיא את השלב המים כדי לממן פראוקאמין כמו אדום מוצק.
5. סינתזה של N-סוסוקסימין
   1. הוסף 350 mg (3.50 mmol) של האנהידריד סוהיד לפתרון של 100 mg (0.17 mmol) של פראוקאמין ב 5 מ ל של פירידין ב 50 mL בתוך התחתית בקבוקון בתוך האווירה האדיש.
   2. מערבבים את התערובת הנוצרת בטמפרטורת החדר במשך 16 שעות. לאחר זמן זה, להסיר את העודף של פירידין תחת לחץ מופחת במאייד ה, כדי לתת מוצק כהה אדום.
   3. מפזר את התגובה גולמי 3 מ ל של מתנול.
   4. העבר את הפתרון המיאנופילית לעמוד Sephadex (20 ס מ של Sephadex בטור בקוטר 20 מ"מ) ואליוט ב 0.5 mL/min.
   5. לאסוף את השבר האדום ולהסיר את המתנול תחת ואקום באמצעות מאייד.
6. סינתזה של המשלים MNP@SiO₂@NH @Fa
   1. לשטוף 30 מ ג יבש MNP@SiO₂@NH₂ פעמיים עם dmf ו Sonicate חלקיקי חלקיקים 100 mL erlenmeyer בקבוקון עבור 30 דקות תחת אווירה אינרטי.
   2. להכין פתרון של N-סווליפראמין (200 mg, 0.30 mmol), benzotriazole-1-yl-אוקסי-tris-(dimethylamino)-פוספוניום HEXAFLUOROPHOSPHATE (בופ, 173 מ ג, 0.45 ממול), 1-hydroxybenzotriazole (הובט, 46 mg, 0.39 mmol) ו- n,n-DI לאמילין (diאפונה, 128.8 mg, 1.21 ממול) ב 10 מ ל של dmf (לערבב a) ב-50 mL בתוך תחתית בקבוקון תחת האטמוספירה אינרטי.
   3. להשעות את ששטף בעבר MNP@SiO₂@NH₂ ב 3 מ ל dmf תחת sonication יבש תחת תנאי חמצן ללא תשלום באמצעות אווירת גז ארגון (Mix B).
   4. הוסף ערבוב A כדי לערבב B הdropwise.
   5. מטלטל את התערובת הסופית באמצעות שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר לילה.
   6. הפרד את המשלים המתקבל (MNP@SiO₂@NH @Fa) מההשעיה באמצעות מגנט.
   7. לשטוף את מוצק כתוצאה מכך ולאחר מכן, sonicate זה חמש פעמים עם 10 מ ל אתנול.
   8. יבש את המוצק תחת ואקום עבור 24 שעות.

2. בקטריות שיטת עם Y. enterocolitica זנים לכמת את לכידת חיידקים פתוגניים עם חלקיקי חלקיקים

1. הכינו השעיה של כל חלקיקי הביניים ואת המשלים הסופי ב-PBS ב 1 מ"ג/mL בצינורות 2 מ ל סטרילי.
2. הכינו תרבות של י. בידור בתוך 5 מ ל של לוריא ברגאני (LB) מרק לילה המבקע ב 37 ° c.
3. להכין 5 מ ל של מרק סויה טריפטי ברזל לקוי (TSB) על ידי הוספת 50 μL של 10 מ"מ 2, 2 ′-bipyridyl.
4. החזר 5 מ ל של ברזל לקוי TSB עם 50 μL של תרבות הלילה של Y. enterocolitica ולאחר מכן, דגירה ב 37 ° צ' עם עצבנות עד OD₆₀₀ = 0.5 \ u 20120.8 מגיע.
5. קח 100 μL של התרבות שהושגו בשלב 2.4 ולדלל ב שפופרת 2.0 mL המכילה 900 μL של PBS כדי לקבל ה1/10 ראשון בשנת דילול. אז, להכין דילול 1/100 מן הדילול הראשון באמצעות אותו הליך כדי לקבל ריכוז של תאים חיידקיים ב 1 x 10⁶ המושבה היוצרים יחידות (cfu)/ml בקירוב.
6. הוסף 100 μL של חלקיקי חלקיקים ב 1 מ"ג/mL ל 1 מ ל של 1/100 דילול של ההשעיה בקטריאלי בתוך שפופרת של 2.0 mL, ו הומוגון עם מערבולת.
7. מודג את התרבות ב 20 ° צלזיוס עבור 1 h.
8. הפרד את אגרגטים MNP/חיידקים באמצעות מגנט ולהשליך בזהירות את הסופרנטאנט.
9. לשטוף את חלקיקי חלקיקים מופרדים פעמיים עם 1 mL PBS באמצעות מערבולת.
10. להשעות את חלקיקי חלקיקים ב 1 מ ל של PBS לספור את כמות הלכידה בקטריאלי CFU/mL.
11. הכינו ארבעה 1/10 רצופים של השעיה לשעבר עד שיגיע לדילול של 1 x 10^-4 .
12. צלחת 10 μL של כל דילול על לוחות TS אגר ו משחיז אותם ב 37 ° c בלילה.
13. לצלם את הצלחת עם מכשיר ג'ל במצב לבנים אפינפרין. עבד את התמונה עם תוכנה מתאימה כדי להגביר נקודה כדי לספור את מספר המושבות הבודדות.
    הערה: כל מתווך MNP התאפיין לעקוב אחר התקדמות הסינתזה. ראשית, MNPs החשופים נחקרו על ידי XRD לבדוק את המבנה הגבישי. לאחר מכן, הספקטרום של FT-IR של כל ביניים הופעל כדי לבדוק את השינויים שהתרחשו בתגובה המתאימה. ניתוח ספקטרוסקופיית ראמאן של כל ביניים בוצע גם כדי לאשר את המסקנות להסיק מ-FT-IR ספקטרום. ניתוח TGA איפשר לנו להעריך את משקל הפסד של intermediates נושאת חומר אורגני במבנה שלה. המבנה והגודל של כל ביניים נחקרו על ידי TEM. לבסוף, ניתוח XPS היה קריטי כדי לקבוע את מצבי החמצון של האטום בכל משטח ביניים של MNP ולאשר את היווצרות הקשר הקוולנטי בתוך המשלים MNP@SiO₂@NH @Fa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אפיון מבני ממצה מבוצע על מנת לקבוע את המבנה ואת המאפיינים של כל ביניים ואת המשלים הסופי. למטרה זו, טכניקות XRD, FT-IR, ראמאן ספקטרוסקופית, TGA, TEM, מיפוי EDX ו-XPS משמשים כדי להדגים את היווצרות המשלים. מצבי החמצון של האטומים במשטח של חלקיקים שנרכשו על ידי X-ray ספקטרוסקופיית פוטואלקטרון (XPS) הם הנתונים הר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של מקשר בין חלקיקי חלקיקים מגנטיים לבין הסימאואופור פראוקאמין באמצעות חיבור קוולנטי. סינתזה של מגנטיט בוצעה בפרוטוקול שדווח על-ידי פינה ואח '⁵ ולאחריה ציפוי סיליקה כדי להגן על הגרעין המגנטי של קורוזיה במערכות מימית, כדי למזער את הצבירה ולספק משטח מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578