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摘要

在此协议中，我们描述了一种稳定、高效的分化策略，用于从人类多能干细胞生成后强感致感神经元。此模型将使神经元可用于多个自主障碍的研究。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）已成为疾病建模和体外人类胚胎发育研究的有力工具。我们之前提出了一种分化协议，用于具有交感特性的自主神经元的衍生，该特性已应用于自主神经病变患者。然而，该协议建立在敲出血清替代（KSR）和基于饲料的培养条件之上，为了确保高分化效率，细胞分拣是必要的。这些因素导致高可变性、高成本和低可重复性。此外，成熟的寄感特性，包括电活动，尚未得到证实。在这里，我们提出了一个优化的协议，其中PSC培养和分化是在无馈料和化学定义的培养条件下进行的。识别躯干神经峰的基因标记被识别。在20天后实现进一步分化成后刚体交感神经元，无需细胞分拣。电生理记录进一步显示功能神经元身份。从我们分化的神经元检测到的激发可以通过尼古丁增强，并抑制由肾上腺素受体拮抗剂蛋白醇。该协议中的中间交感神经祖生可以作为神经球体维持长达2周，这允许培养物的扩展。总之，与以前的版本相比，我们更新的交感神经元分化协议表现出高分化效率、更好的可重复性、更大的灵活性和更好的神经成熟度。该协议将为研究人员提供研究影响自主神经系统的人类疾病所需的细胞。

引言

后刚体交感神经元（symNs）属于自主神经系统（ANS），在独立于意识的个体的反应和调节平衡方面具有多重重要作用。例如，压力刺激symN，并唤起战斗或逃跑的反应，导致心率，血压和出汗的增加。SymNs 因遗传、毒性/伤害或其他疾病的同伴而在多种人类疾病中受到影响。遗传神经病变的一个例子是儿童疾病家庭性肌瘤（FD），其中，严重的调节调节的共生导致反乌托邦危机，明显的出汗，皮肤斑点，呕吐发作，高血压和焦虑1。毒性的一个例子是化疗治疗，据报道，它对自主神经元有毒副作用2。众所周知，自主变性和超内侧病既可导致或伴随，如帕金森病或高血压肾病33，4。4因此，能够进行研究，了解symN生物学的机制和疾病背景下的缺陷，有利于寻找新颖有效的治疗方法。

解剖
外围神经系统分支成感官和自主的分裂。感觉神经系统的发泡神经负责疼痛和触觉的感觉，而ANS负责将信息从所有器官中继到大脑。ANS分为肠神经系统，内化胃肠道，寄生神经系统，这是放松的重要，和寄分神经系统（SNS），这是重要的激活/调节器官。SNS 调整双神经元系统5。前刚利感神经斧头在脊髓第一个项目到交感性神经神经神经斧子，其中后刚体symN细胞体的位置。然后，这些神经元发送长投影，以内化身体中每个器官的目标组织。由前江柱神经元传输的信号是胆碱化的，而后江脂符号是可德雷纳的，因此表达去甲肾上腺素（NE）作为其主要神经递质。很少有明显的例外，后血管，同情神经元是胆碱化，包括那些内化血管。腺素后神经神经元表达酶酪氨酸羟基酶（TH），芳香L-氨基酸脱氧血脂酶（AAAD），多巴胺β-羟基酶（DBH），和单胺氧化酶（MAO-A），所有负责产生和代谢NE。此外，它们还表达NE回收运输机和/或受体β-肾上腺素受体（ADRA2）、β-肾上腺素受体（ADR2B）、去甲肾上腺素输送器（NET1）和光体单胺输送器（VMAT1/2）。

发展
在胚胎发育过程中，符号来自神经峰（NC），神经管和覆盖的ectoderm6之间出现，可以分化成多个细胞谱系，包括黑色素细胞、骨细胞、副细胞、胶质、肠神经元、感觉神经元和自主神经元7。神经峰细胞（NCCs）是高度迁移的细胞，通过胚胎走几条途径。在NC发育的早期阶段，细胞表示标记SNAIL1/2、FOXD3和SOX1088、9、10、11。9,10,11迁移路线以及它们采用的轴向位置决定了它们将发展到的 NC 子类型。这些NC亚型可以通过其特定的HOX基因表达来区分:颅内NCC不表达HOX基因，vagal NCC表达HOX1+5，中继NCCs表达HOX6+9，以及食质NCC表达HOX10~1112。其中，中继NcC被公认为是符号的主要来源。SymN 前体表示转录因子 MASH1/ASCL113，它促进 PHOX2B14和 INSM115的表达。《国家与加体刑部》的转录因子家族在晚期同情发展期间表达。GATA2 和 GATA3 表示在符号中，然后激活 DBH16。转录因子HAND2对DBH和TH17的表达和维护也很重要。

HPSC（例如胚胎和诱导多能干细胞）是一个强大的工具18，用于概括发展范式并生成符号，然后可用于各种人类疾病的疾病建模。因此，在从 hPSC 生成符号的同时，必须遵循发展准则，并评估在差别化过程中表达适当的标记。

以前的 symN 协议
很少有研究小组以前曾报告过hPSC19、20、21,20,21的共生生成。最近22年，我们审查了这些协议与彼此的直接比较。2016年23月，我们发布了一种分化协议，用于生成具有symN字符的自主神经元（图1A）。该协议使用基于KSR的介质，用于维持无差别的hPSCs和细胞分化。此外，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF馈送细胞）上维持hPSCs。我们使用这个协议和PSC从FD患者建模紊乱23。在2019年，我们描述了这个旧协议24的更详细的版本。综上所述，神经命运是由双SMAD抑制25在前2天阻止TGF-β和BMP信号诱导的。使用CHIR99021进行WNT激活促进神经祖细胞成为NC细胞。第11天，通过FACS对CD49D+或+SOX10=种群26，23,23的细胞进行排序，产生了约40%的NC生成效率。+因此，需要分拣以确保下一步差异化的效率和纯度。通过FGF2和CHIR的组合处理，将NCC作为球体进行维护和放大。4天后，对维护的NC球体进行镀层，并给予BDNF、GDNF和NGF，以完成symN成熟。虽然这些符号表示强烈的symN标记，如ASCL1，TH，DBH和PHOX2A，更成熟的符号，包括尼古丁乙酰胆碱受体（CHRNA3/CHRNB4）和囊泡运输器（VMAT1/2）的表达，即使在70天的分化后，也很低。该协议中的HOX基因没有经过正式测试，成熟的神经特性，包括细胞的电生理活性，未经验证。

在这里，我们提出了一个优化的协议来生成符号（图1B）。HPSC 在无馈送条件下保持，在体外内他丁 （VTN） 涂层的菜肴上，使用基本 8 （E8） 介质27。分化介质的公式在每个阶段都进行了修改，从而增加了NC人口28的百分比。symN 成熟可以在 CD49D+/SOX10=排序或未排序的散装 NCC 种群上完成。两者都显示第 30 天的高级别 symN 标记表达式。此外，使用该协议生成的符号对电生理记录和使用symN活化剂和抑制剂化合物的处理有反应。

研究方案

注:H9 PHOX2B:GFP记者专线由Oh等人提供。本文中使用的一些qPCR引物来自OriGene技术公司，而一些序列则从Frith等人20、30.,30

1. 设置用于盘涂、介质制备和 hPSC 维护

  1. 碟涂层
    1. 体外内他 （VTN） 涂层
      1. 将 VTN 小瓶放入 37 °C 水浴中，直到完全解冻，然后彻底混合。
      2. 对于 100 mm 的 Petri 盘，将 7 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 与 0.5 mg/mL VTN 混合，在盘中加入 VTN 溶液，并在室温 （RT） 下孵育 1 小时。
    2. 地下室膜基质涂层
      1. 在4°C的冰上解冻基底膜基质的瓶（见材料表）。
      2. 对于 6 口板的一口井，将 2 mL 的 DMEM/F12 与 20 μL 的 100x 基底膜基质混合，在盘中加入基底膜基质溶液，用石蜡薄膜包裹盘子，并在 4°C 过夜时存放在干净的容器中。尽快工作。涂层菜肴可在4°C下储存长达2周。
    3. 聚苯乙烯 （PO）/拉米宁 （LM）/纤维素 （FN） 涂层
      1. 第一天，对于24孔板的一口井，将15μg/mL的PO与1 mL的1xPBS混合，在37°C孵育，5%CO2过夜。在 -20°C 下解冻 LM 和 FN 过夜，储存在 4 °C，直到完全解冻。
      2. 第二天，吸气PO溶液，用1xPBS清洗2倍，加入1 mL的1xPBS，含有2μg/mL的LM和2μg/mL的FN，并在5%CO2过夜以37°C孵育。此时，带有 LM/FN 溶液的菜肴可以保存在培养箱中数月，只要它不干燥。添加更多 1x PBS，防止盘子干燥。
  2. 媒体准备
    1. 在4°C过夜时解冻一瓶E8补充剂，准备基本8介质（E8）。如果需要，将补充剂与 500 mL E8 介质和抗生素混合。
      注:工作 E8 解决方案应在 2 周内使用。
    2. 通过将 90 mL 的完整 E8 介质与 10 mL 的 DMSO 混合，总体积为 100 mL，从而制备 hPSC 冷冻介质。过滤器消毒。
    3. 通过将 100 mL 的基本 6 （E6） 介质与 10 μM SB431542、1 ng/mL BMP4、300 nM CHIR99021 和 10 μM Y27632 混合，制备 0 至第 1 天分化介质，总体积为 100 mL。
    4. 通过将 100 mL E6 介质与 10 μM SB 和 0.75 μM CHIR99021 混合，总体积为 100 mL，准备第 2 天至第 10 天的分化介质。
    5. 通过混合具有 2 mL B27 （50x）、1 mL N2 （100x）、2 mM L-谷氨酸、3 μM CHIR99021 和 10 ng/mL FGF2 的神经底质介质，准备第10 天至第 14 天球体介质，总体积为 100 mL。
    6. 通过每次喂食将 0.5 μM 的新鲜 RA 添加到第 10 天至第 14 天球形介质，为球形长期维护准备第 14 天至 28天。
      注: 始终将 RA 保持在 -80 °C。
    7. 通过将神经底介质与 2 mL B27 （50x）、1 mL N2 （100x）、2 mM L-谷氨酸、25 ng/mL GDNF、25 ng/mL BDNF、25 ng/mL NGF、200 μM 抗坏血酸和 0.2 mm dbcAMP 混合，总体积为 100 mL，从而制备 SymN 成熟介质。该解决方案应在 2 周内使用。每次进料前，加入0.125μM新鲜RA。此解决方案从第 14 天（选项 1）或第 28 天（选项 2）开始使用。
    8. 准备FACS缓冲，混合DMEM与2%FBS，2 mM L-谷氨酸和抗生素，如果需要总体积100 mL。
  3. hPSC 维护
    1. 解冻并保留 hPSC
      1. 准备一个 VTN 涂层 100 毫米的盘子。
      2. 要直接从液氮中解冻一小瓶hPSC，将小瓶放入37°C的水浴中，小心地将管子在水中摆动，直到解冻。将解冻的 hPSC 转移到包含 10 mL 1x PBS 的 15 mL 管的 15 mL 管中，并在 200 x g 下以 200 x g的离心机进行 4 分钟。
      3. 丢弃上清液，向管中加入 1 mL E8 介质。移液几次完全重新悬浮颗粒，然后再加入9 mL的E8介质，达到10 mL总。
      4. 从 100 mm 盘中吸气 VTN 溶液。
      5. 将 hPSC 转移到 100 mm 的盘，轻轻摇动（上下和向左，而不是圆圈），以确保细胞均匀地分布在盘中
      6. 在37°C孵育，在5%的CO2中孵育。
      7. 第二天，吸进所有介质，用10 mL E8进气。
      8. 在接下来的3⁄4天里，每天以这种方式喂食，然后准备拆分。
    2. 拆分 hPsC
      注:分裂处的hPSC应为80%~90%的汇。应观察边缘光滑明亮的大菌落。但是，应避免每个殖民地之间的接触（图 2B、第 0 天和图 6B）。
      1. 根据需要准备 VTN 涂层 100 mm 的菜肴。
      2. 吸气 E8 并洗须用 1x PBS 拆分 1 倍的菜肴。
      3. 吸气 1x PBS 并添加 4 mL 0.25 M EDTA。在37°C孵育2分钟，CO25% 。
        注:hPSCs 应拆分/重新镀为小菌落。不要使用 EDTA 治疗超过 2 分钟，以防止分离到单个细胞中。2分钟治疗后，细胞仍应附着在盘面上。
      4. 吸气EDTA，通过将10 mL的E8介质强力移液分离到盘面，并将所有介质和细胞收集在15 mL管中。
      5. hPSCs 在 80%~90% 的汇合度下，按 1:15-1:20 分割菌落。例如，将 hPSC 的 1:20 拆分为一个 100 mm 盘中，采用 500 μL 的 E8/hPSC 溶液，并与 9.5 mL 的新鲜 E8 介质混合。
      6. VTN 涂层 100 mm 菜肴中的板 hPSC。
        注:建议分别为每个研究人员和细胞系建立理想的分割比。
    3. 冷冻 hPSC
      1. 对于准备分裂的 100 mm hPSC，准备三个冷冻剂和 3.5 mL 冷冻介质。
        注:介质和小瓶应保存在 4 °C 或冰上，直到使用为止。
      2. 吸气 E8，用 1x PBS 洗 2 倍的菜肴。
      3. 吸气1x PBS，加入4 mL 0.25 M EDTA，在37°C孵育2分钟，在5%CO2中孵育。
        注:hPSCs应该被冷冻为小菌落时，他们将被分割。不要将EDTA超过2分钟的细胞治疗，以防止分离成单细胞。2分钟治疗后，细胞仍应附着在菜的表面上。
      4. 吸气EDTA，通过在盘子表面通过强移液10 mL的1x PBS分离菌落，并在50 mL管中收集所有介质和细胞。
      5. 在 200 x g下加入 20 mL 的 1x PBS 和离心机 4 分钟，以洗掉剩余的 EDTA。
      6. 丢弃上清液，在 3 mL 的冷冻介质中重新悬浮颗粒。
      7. 均匀地将 hPSC 均匀地分布到三个低温中，每个 1 mL。
      8. 在 -80°C 下储存在受控冷冻盒或发泡胶三明治中过夜，以确保缓慢下降的温度，然后转移到液氮罐进行长期储存。

2. 播种 hPSC 以开始分化（第 0 天）

注:hPSC在稳定后应做好分化的准备（即解冻后分裂2~3倍）。确保菌落是健康的，光滑，有光泽的边缘，最小的分化（图2B）。

  1. 根据需要，在0天前一天准备地下室膜基质涂层菜肴（24个井或6个井菜）。在区分开始时将菜肴带到 RT。
  2. 根据需要使一天 0+1 分化介质。
  3. 从汇物中吸出 E8，准备分块 hPCS，用 1x PBS 洗 2 倍的菜肴。
  4. 每100毫米菜加入7 mL 0.25 M EDTA，在37°C孵育，5%CO2孵化15分钟。
    注:此时，EDTA治疗被延长以分散到单个细胞中。
  5. 从所有 hPSC（它们应浮动）上移出，并转移到 50 mL 管。加入与 EDTA 溶液相同或更多的 1 倍 PBS 以稀释 EDTA。
  6. 在 200 x g下离心 4 分钟。
  7. 丢弃上清液，加入1 mL的第0~1天分化介质，并移液液化细胞。接着加入更多的介质，然后混合，将细胞溶液稀释到理想的浓度中，以计数细胞。
    注:请勿过度稀释细胞溶液。一个完整的100毫米菜的细胞应稀释在5 mL的中等开始。
  8. 使用自动细胞计数器或血细胞计计数细胞编号。
  9. 稀释细胞溶液，根据需要达到125，000细胞/cm2的低最终体积（例如，6口井菜每口2 mL或24口井每口500μL）。
    注: 低音量有助于细胞连接更快。
  10. 将所有基底膜基质溶液从涂层的盘子中吸进，将细胞溶液板入井中。
  11. 在37°C孵育，在5%的CO2中孵育。

3. 神经峰细胞诱导（第1天至第10天，图2A）

  1. 在第1天，用第0⁄1天分化介质（6口菜每口3 mL，24个井菜每口1mL）喂细胞。
  2. 在第2天，用第2天10分分化介质（6口菜每口3米L，24口井菜每口1mL）喂细胞。
  3. 从现在起，细胞应每隔一天喂食一次，直到第10天（即下一个喂食日是第4天）。
    注:从第6天开始，应检测NC脊（图2B）。为了检查是否发生分化，建议在较小的井（即24口井）中携带平行分化培养，这种培养可以染色用于SOX10/AP2a，并沿分化时间用于标记基因表达（图2B，C）。C
  4. 如果对单元格进行排序，请继续执行第 4 节。否则，请继续执行第 5 节。

4. 用于神经峰标记CD49D的荧光激活细胞分选（FACS）和球状物中的NC细胞聚合

注:对于FACS分拣，样品应保存在冰上，在染色后不要暴露在光线下，直到分拣。

  1. 如果对单元格进行排序，请准备 FACS 缓冲区。
  2. 准备第10~14天球形介质。
  3. 第 10 天，取出介质，用 1x PBS 洗 1x。
  4. 将分离溶液（参见材料表）以每口2米L为6口井菜或每口1米L，用于24口井，并在37°C孵育，5%CO2孵育20分钟。
  5. 从所有 hPSC 上移出并转移到 50 mL 管。
  6. 在 200 x g下将管的其余部分加注 FACS 缓冲液和离心机 4 分钟。
    注:每个 50 mL 管可以容纳高达 20 mL 或更少的电池溶液。FACS 缓冲液的体积应足够高，以中和分离溶液。
  7. 丢弃上清液，用适当数量的FACS缓冲液重新悬浮细胞（6孔板每孔±2 mL），然后计数以确定细胞数。
  8. 准备以下示例。
    1. 样品 1（未染色控制）:1 x 106细胞，位于 FACS 缓冲液的 400 μL 中。通过 20 μm 滤网盖过滤细胞，并将管留在冰上。
    2. 样品2（仅限DAPI控制）:1 x 106细胞在400μL的FACS缓冲液中含有0.5微克/mL DAPI。用滤网盖通过 FACS 管过滤细胞，并将管子保持在冰上。
    3. 样品3（CD49d标签）:将含有PE/Cy7偶联CD49D抗体的FACS缓冲液的其余部分悬浮在15 mL管中，并在冰上孵育20分钟。6
  9. 在 200 x g时将管子加注 FACS 缓冲液和离心机 4 分钟。
  10. 根据制造商的说明，在含有 0.5 微克/mL DAPI 的 1 mL FACS 缓冲液中丢弃上清液并每 5×10 x 106个单元重新悬浮。
  11. 用滤网盖过滤通过 FACS 管的细胞，并将管子保持在冰上。
  12. 准备收集FACS管，含有2 mL的FACS缓冲液。
  13. 使用激光对 FACS 机器进行排序，这些激光可以检测 DAPI 和 PE-Cy7，以隔离 CD49D+填充。
  14. 排序后，对已排序的单元格进行计数。
  15. 离心所有分类的细胞，并在第10-14天球形介质中重新悬浮，最终浓度为每500 μL的介质0.5 x 106细胞。
  16. 板 0.5 x 106细胞每孔进入超低附件 24 孔板。
  17. 在37°C下孵育细胞，在5%的CO2中孵育。

5. 在球形中聚合NC细胞

  1. 如果不使用 FACS 分离 NC 细胞，而是直接将它们聚合到球体中，请首先准备步骤 4.2–4.5 中所述的细胞。
  2. 用 1x PBS 填充管的其余部分，在 200 x g下将离心机装满 4 分钟。
  3. 丢弃上清液，用适量的第10-14天球体介质重新悬浮细胞（例如，6孔板每孔2 mL的介质），并计数以确定细胞数。
  4. 在第10-14天球形介质中稀释细胞，每500 μL的介质0.5 x106细胞。
  5. 在超低附件 24 孔板中，每个孔的细胞悬浮液板 500 μL。
  6. 在37°C下孵育细胞，在5%的CO2中孵育。

6. NC球菌维护和交感后代诱导（第10天至第14天，图4A）

  1. 选项 1:最小球形培养
    1. 在第 11 天，将第 10~14 天球体介质的 500 μL 添加到 NC 球形中，而不从第 10 天开始吸气现有介质。在37°C孵育，在5%的CO2中孵育。
    2. 第12天，倾斜板以积累井一侧的NC球体。小心吸气并丢弃尽可能多的介质，并喂食1 mL第10~14天球形介质。
    3. 每天继续喂食细胞，直到第14天。
    4. 可选:如果球形聚合并产生大团块，请使用移液器将球形团分解。这也确保单个球形不会变得太大。
      注:理想的球体尺寸范围应约为 100~500 μm。在这一范围内，单个球体的大小并不重要。但是，形态学（如平滑和清晰的边（图 3和图 6）对于进一步的成功非常重要。在第 14 天，每个 24 个孔板理想地包含上述尺寸范围内约 50-60 个不同尺寸的球类。
  2. 选项 2:扩展的球体培养
    1. 第15天，为了保持NC球体，饲料与1.5mL的第10~14天球体介质含有0.5μM RA。在37°C孵育，5%CO2。
      注:每次进料应加新鲜RA，并始终储存在-80°C。
    2. 从现在开始，每隔一天喂一次，第28天，然后继续电镀球体（第7.1节）。
      注:生长的球体每周分裂约1倍，用1 mL移液器移液以将其分解。它们以 1:2-1:4 的近似比率进行拆分。在2周的膨胀期内，细胞的数量应该大约翻两番。

7. SymN 分化和成熟（备选方案1:第14天之后;选项 2:第 28 天后）

  1. 在常规菜肴中镀出球体
    1. 准备 PO/LM/FM 涂层 24 个孔板。
    2. 制备含有 0.125 μM RA 的 symN 介质（每进给添加新鲜和 10 μM Y27632（仅限第 14 天）。
    3. 第14天，倾斜板以积累孔的一侧NC球体。小心吸气并丢弃尽可能多的介质，并随 1 mL 的 symN 介质进给。
    4. 从涂层板上拆下 LM/FN。
    5. 将每个井从24个井板分割成4口新井，涂布24孔板。每个原始井将有1 mL，包含+50~60球形。这会产生250μL，新板上每口孔含有约10~15个球类。
    6. 每口井加250μL的附加介质。
      注:这是 1:4 的拆分;这是 1:4 的拆分。确保球形在溶液中正确分布，以便分裂相对均匀。球形数不计算，因为最终数量不会影响生成符号的成功。
    7. 在37°C孵育，5%CO2。
    8. 第 15 天（或选项 2 的第 29 天），通过更换所有介质，将含有 0.125 μM RA 的 1 mL symN 介质替换进给。从现在开始，神经元应每2天喂食一次，直到第20天（或选项2的第35天）。
    9. 第20天（或选项2的第35天）后，神经元应谨慎更换现有介质的一半（500 μL）。从现在开始，每周喂食，除非介质迅速变成黄色。
    10. 保持每周喂食，直到所需的时间点。
      注:符号倾向于聚合在类似帮派的结构中，并且容易从培养皿中分离出来。为了防止这种情况，建议进行半进料和最少的处理。
  2. 电生理记录的电镀细胞
    1. 准备PO/LM/FM涂层96井电生理板。
    2. 制备含有 0.125 μM RA 的 symN 介质（每进给添加新鲜和 10 μM Y27632（仅限第 14 天）。
    3. 第14天，收集所有球体，然后以200 x g离心4分钟。
    4. 丢弃上清液，加入2 mL分离溶液，并将混合物传回超低附着板的孔中。在37°C孵育，在5%的CO2中孵育20~45分钟。
      注:根据球体的大小，分离期可以超过20分钟。每10分钟检查一次细胞分离，长达45分钟。这是此协议中的可选方案，因为球形在完全分离后不会聚合。
    5. 管道完全分离球体，然后在200 x g下离心4分钟。
    6. 丢弃上清液，重新挂起具有适当数量的symN介质的细胞，并计算细胞数。
    7. 以100，000/cm2在PO/LM/FN涂层电生理学井中，以每口井总体积200μL的体积对细胞进行板。
    8. 在第 15 天（或选项 2 的第 29 天），遵循与第 7.1 节中相同的进料过程。第 15 天后的总交易量（或选项 2 的第 29 天）每口井应为 300 μL。
    9. 在第 20 天（或选项 2 的第 35 天）后使用多电极阵列机器测量电信号。
      注:在选项 2 中，球形可在第 14 天-第 28 天之间随时镀。第一次电信号测量可以在电镀球体后1周进行。

结果

在此协议中，我们将给出有关如何从 hPSC 生成符号的说明。这里演示的培养条件从先前公布的协议23、24（图1A）到无馈送和化学定义的条件（图1B）都得到了改善。23,提供了两个选项，一个在 20 天内生成符号，另一个选项可以扩展 NcC 2 周以生成更多的单元格，然后可以分化为符号（图 1B、

讨论

我们最近发表了两篇评论，一篇讨论使用hPSC衍生的symN进行疾病建模31，以及深入比较现有的分化协议22。因此，在这里，我们重点对当前协议进行故障排除，以帮助感兴趣的研究人员成功创建 symN。在整个分化过程中，为了获得一致的数据以及健康的分化细胞，应仔细控制各个阶段的污染。在常规 hPSC 维护中，支原体测试应每两周或每月执行一次。如果在第10天...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们要感谢海蒂·乌尔里希斯对手稿的批判性阅读和编辑。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishesFalcon353003
15 mL conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-664
24-well tissue culture platesFalcon353047
24-well ultra-low-attachment platesCorning07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubatorThermo Fisher/Life TechnologiesHeracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-656
6-well tissue culture platesCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibodyAbcamab108311Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibodyBD Pharmingen556604Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibodyBioLegend304313Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype)BioLegend400125Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dyeSigmaD95421:1000 dilution
Anti-DBH antibodyImmunostar22806Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibodyAbcamab13970Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibodyAbcamab50839Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibodyMabNET17-1Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibodySanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-365692Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibodyPel-FreezP40101- 150Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acidSigmaA8960-5GStock concentration: 100 mM
B27 supplementThermo Fisher/Life Technologies12587-010Stock concentration: 50x
BDNFR&D Systems248-BDStock concentration: 10 μg/mL
BMP4R&D Systems314-BPStock concentration: 6 mM
Cell counterThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Cell counting chamber slidesInvitrogenC10312
CentrifugeEppendorf57021&5424R
CHIR99021R&D Systems4423Stock concentration: 6 mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Stock concentration: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Stock concentration: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Stock concentration: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 mediumgibcoA15165-01
E8 mediumgibcoA15169-01Stock concentration: 1x
E8 supplementgibcoA15171-01Stock concentration: 50x
EDTASigmaED2SSStock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS machineBeckman CoulterCytoFLEX (for FACS)
FACS machineBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap)Falcon352235
FACS tubes (white cap)Falcon352063
Fetal bovine serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Stock concentration: 10 μg/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN)VWR/Corning47743-654Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamineThermo Fisher/Gibco25030-081Stock concentration: 200 mM
LN tankCustom Biogenic SystemsV-1500AB
MEA readerAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse laminin I (LM)R&D Systems3400-010-01Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplementThermo Fisher/Life Technologies17502-048Stock concentration: 100x
Neurobasal mediumgibco21103-049Stock concentration: 1x
NGFPeproTech450-01Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-136Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)SigmaP3655Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics)InvivoGenANTPM1Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machineBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR platesBio-Rad LaboratoriesHSP9601
recombinant FGF2R&D Systems233-FB/CFStock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acidSigmaR2625Stock concentration: 1 mM
SB431542Tocris/R&D Systems1614Stock concentration: 10 mM
Trypan blueCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bathVWR/Corning706308
Y27632R&D Systems1254Stock concentration: 10 mM

参考文献

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