JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de différenciation stable et très efficace pour la génération de neurones sympathiques postganglioniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce modèle rendra les neurones disponibles pour l’utilisation d’études sur de multiples troubles autonomes.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes humaines (HPSCs) sont devenues un outil puissant pour la modélisation des maladies et l’étude du développement embryonnaire humain in vitro. Nous avons précédemment présenté un protocole de différenciation pour la dérivation des neurones autonomes avec le caractère sympathique qui a été appliqué aux patients présentant la neuropathie autonome. Cependant, le protocole a été construit sur knock Out Serum Replacement (KSR) et les conditions de culture à base d’alimentation, et pour assurer une efficacité de différenciation élevée, le tri cellulaire était nécessaire. Ces facteurs causent une grande variabilité, un coût élevé et une faible reproductibilité. En outre, les propriétés sympathiques matures, y compris l’activité électrique, n’ont pas été vérifiées. Ici, nous présentons un protocole optimisé où la culture et la différenciation de la CFP sont exécutées dans des conditions de culture sans conducteur et définies chimiquement. Des marqueurs génétiques identifiant la crête neurale de tronc sont identifiés. Une autre différenciation dans les neurones sympathiques postganglioniques est réalisée après 20 jours sans avoir besoin de tri cellulaire. L’enregistrement électrophysiologique montre davantage l’identité fonctionnelle des neurones. La cuisson détectée de nos neurones différenciés peut être améliorée par la nicotine et supprimée par le propranolol antagoniste de récepteur adrénergique. Les progéniteurs neuronaux sympathiques intermédiaires dans ce protocole peuvent être maintenus comme sphéroïdes neuraux pendant jusqu’à 2 semaines, ce qui permet l’expansion des cultures. En somme, notre protocole de différenciation des neurones sympathique mis à jour montre une grande efficacité de différenciation, une meilleure reproductibilité, plus de flexibilité et une meilleure maturation neuronale par rapport à la version précédente. Ce protocole fournira aux chercheurs les cellules nécessaires à l’étude des troubles humains qui affectent le système nerveux autonome.

Introduction

Les neurones sympathiques postganglioniques (symNs) appartiennent au système nerveux autonome (ANS) et ont des rôles importants multiples dans la réponse et la régulation de l’homéostasie du corps indépendant de la conscience. Par exemple, le stress stimule les symNs et évoque la réponse de combat ou de fuite qui conduit à une augmentation de la fréquence cardiaque, de la pression artérielle et de la transpiration. Les SymNs sont affectés dans de multiples troubles humains dus à la génétique, à la toxicité/blessure, ou comme compagnons d’autres maladies. Un exemple d’une neuropathie génétique est le trouble de l’enfance Dysautonomia familiale (FD), où une dysrégulation sévère de symNs provoque une crise dysautonomique, évident par la transpiration, l’taches de la peau, les crises de vomissements, l’hypertension, et l’anxiété1. Un exemple de toxicité est le traitement de chimiothérapie, qui a été rapporté pour avoir des effets secondaires toxiques sur les neurones autonomes2. On sait que la dénervation autonome et l’hyper-innervation peuvent à la fois conduire à, ou accompagner, des maladies telles que la maladie de Parkinson ou la maladie rénale hypertendue3,4. Ainsi, être capable de mener des recherches et de comprendre les mécanismes de la biologie symN et des défauts dans le contexte de la maladie est bénéfique pour la recherche de traitements nouveaux et efficaces.

Anatomie
Le système nerveux périphérique se ramifie en divisions sensorielles et autonomes. Les nerfs afférents du système nerveux sensoriel sont responsables de la sensation de douleur et de toucher, tandis que l’ANS est responsable du relais des informations de tous les organes au cerveau. L’ANS est divisé en système nerveux entérique, innervant le tractus gastro-intestinal, le système nerveux parasympathique, qui est important pour la relaxation, et le système nerveux sympathique (SNS), qui est important pour l’activation /régulation des organes. Le SNS adapte un système bi-neurones5. Axones neuronaux sympathiques preganglionic dans la moelle épinière premier projet aux ganglions sympathiques, où les corps postganglioniques de cellules symN sont situés. Ces neurones envoient ensuite de longues projections pour innervate les tissus cibles de chaque organe dans le corps. Les signaux transmis par les neurones préganglioniques sont cholinergiques, tandis que les symns postganglioniques sont adrénergiques et expriment ainsi la noradrénaline (NE) comme leur neurotransmetteur principal. Il y a peu d’exceptions notables des neurones postganglioniques et sympathiques qui sont cholinergiques, y compris ceux qui innervent les vaisseaux sanguins. Les neurones postganglioniques adrénergiques expriment les enzymes tyrosine hydroxylase (TH), l’acide l-amino aromatique decarboxylase (AAAD), la dopamine -hydroxylase (DBH), et l’oxidase monoamine (MAO-A), tous responsables de la production et de la métabolisation de l’ONE. En outre, ils expriment les transporteurs de recyclage NE et/ou les récepteurs des récepteurs adrénergiques (ADRA2), des récepteurs adrénergiques (ADR2B), du transporteur de noradrénaline (NET1) et du transporteur de monoamines vésiculaires (VMAT1/2).

Développement
Pendant le développement embryonnaire, les symNs sont dérivés de la crête neurale (NC), qui émerge entre le tube neural et l’ectoderme6,et peut se différencier en lignées cellulaires multiples, y compris les mélanocytes, les ostéoblastes, les adipocytes, les glia, les neurones entériques, les neurones sensoriels et les neurones autonomes7. Les cellules de crête neurale (CNC) sont des cellules très migratrices qui empruntent plusieurs voies à travers l’embryon. À ce stade précoce du développement NC, les cellules expriment les marqueurs SNAIL1/2, FOXD3, et SOX108,9,10,11. La route de migration ainsi que l’emplacement axial qu’ils adoptent détermine le sous-type NC dans lequel ils se développeront. Ces sous-types NC peuvent être distingués par leur expression génétique HOX spécifique : Les CCN cranial n’expriment pas les gènes HOX, les CCN vagals expriment HOX 1-5, les CCN du tronc expriment HOX 6-9, et les CCN sacraux expriment HOX 10-1112. Parmi eux, les CCN sont reconnus comme la principale source de symNs. Les précurseurs SymN expriment le facteur de transcription MASH1/ASCL113, qui favorise l’expression de PHOX2B14 et INSM115. La famille GATA des facteurs de transcription s’exprime au cours du développement compréhensif tardif. GATA2 et GATA3 sont exprimés dans les symNs, qui active à leur tour DBH16. Le facteur de transcription HAND2 est également important pour l’expression et l’entretien de DBH et TH17.

Les CHSC (p. ex., cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites) sont un outil puissant18 pour récapituler les paradigmes du développement et générer des symNs qui peuvent ensuite être utilisés pour la modélisation des maladies de divers troubles humains. Ainsi, tout en générant des symns à partir de HPSCs, il est crucial de suivre les lignes directrices sur le développement et d’évaluer l’expression de marqueurs appropriés le long du processus de différenciation.

Protocole symN précédent
Peu de groupes de recherche ont déjà signalé la génération de symNs à partir de hPSCs19,20,21. La comparaison directe de ces protocoles les uns aux autres et les nôtres a été revue récemment22. En 201623, nous avons publié un protocole de différenciation pour la génération de neurones autonomes au caractère symN (figure 1A). Ce protocole a utilisé le milieu à base de KSR, qui a été utilisé à la fois dans le maintien des HPSCs indifférents et la différenciation cellulaire. En outre, les HPSCs ont été maintenus sur les fibroblastes embryonnaires de souris (cellules d’alimentation de MEF). Nous avons employé ce protocole et les CFP de patients présentant FD pour modéliser le désordre23. En 2019, nous avons décrit une version plus détaillée de cet ancien protocole24. En résumé, le destin neuronal a été induit par l’inhibition double de SMAD25 pour bloquer la signalisation TGF-MD et BMP dans les 2 premiers jours. L’activation WNT utilisant CHIR99021 a encouragé les progéniteurs neuraux à devenir des cellules NC. Le jour 11, les cellules ont été triées par FACS pour les populations CD49D+ ou SOX10, 26,23, qui ont donné environ 40% d’efficacité de génération NC. Ainsi, le tri était nécessaire pour assurer l’efficacité et la pureté pour les prochaines étapes de la différenciation. Les CCN ont été maintenus et amplifiés comme sphéroïdes avec le traitement combiné de FGF2 et de CHIR. Après 4 jours, les sphéroïdes NC de l’entretien ont été plaqués et donnés BDNF, GDNF, et NGF pour terminer la maturation symN. Bien que ces symN aient exprimé de forts marqueurs symN tels que ASCL1, TH, DBH et PHOX2A, les marqueurs pour des symns plus matures, y compris l’expression du récepteur nicotinique d’acétylcholine (CHRNA3/CHRNB4) et du transporteur de vésicule (VMAT1/2), étaient bas même après 70 jours de différenciation. Les gènes HOX dans ce protocole n’ont pas été formellement testés, et les propriétés neurales matures, y compris l’activité électrophysiologique des cellules, n’ont pas été vérifiées.

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour générer des symNs (figure 1B). Les SHC sont maintenus dans des conditions sans conducteur, sur des plats enrobés de vitronectine (VTN), à l’aide du média Essential 8 (E8)27. La formule des supports de différenciation a été modifiée à chaque étape, augmentant ainsi le pourcentage de la populationNC 28. La maturation symN peut être effectuée sur CD49Det/SOX10, en vrac triés ou non triés.+ Les deux montrent des niveaux élevés d’expression de marqueur symN par jour 30. En outre, les symNs générés avec ce protocole sont sensibles à l’enregistrement électrophysiologique et aux traitements avec des composés d’activateur et d’inhibiteur symN.

Protocole

REMARQUE : La ligne de journaliste H9 PHOX2B:GFP a été fournie par Oh et coll.19. Certaines amorces qPCR utilisées dans ce document ont été obtenues auprès d’OriGene Technologies, tandis que quelques séquences sont obtenues de Frith et al.20,30.

1. Mise en place pour le revêtement de vaisselle, la préparation des médias et l’entretien hPSC

  1. Revêtement de plat
    1. Manteau vitronectin (VTN)
      1. Placer les flacons de VTN dans un bain d’eau de 37 oC jusqu’à ce qu’ils soient entièrement décongelés, puis bien mélanger.
      2. Pour un plat Petri de 100 mm, mélanger 7 ml de saline tamponnée de phosphate de 1x (PBS) avec 0,5 mg/mL VTN, ajouter la solution VTN au plat et incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h.
    2. Revêtement de matrice de membrane de sous-sol
      1. Décongeler les flacons de matrice de membrane du sous-sol (voir tableau des matériaux) sur la glace à 4 oC pendant la nuit.
      2. Pour un puits d’une plaque de 6 puits, mélanger 2 ml de DMEM/F12 avec 20 L de matrice de membrane de sous-sol 100x, ajouter la solution de matrice de membrane de sous-sol au plat, envelopper le plat avec le film de paraffine, et entreposer dans un récipient propre à 4 oC pendant la nuit. Travaillez le plus rapidement possible. Les plats enrobés peuvent être conservés en 4 oC jusqu’à 2 semaines.
    3. Revêtement polyornithine (PO)/laminine (LM)/fibronectine (FN)
      1. Le premier jour, pour un puits d’une plaque de puits de 24, mélanger 15 g/mL de PO avec 1 ml de PBS 1x, incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant la nuit. Décongeler à la fois LM et FN à -20 oC pendant la nuit et conserver à 4 oC jusqu’à ce qu’il soit entièrement décongelé.
      2. Le deuxième jour, aspirate PO solution, laver les puits 2x avec 1x PBS, ajouter 1 mL de 1x PBS contenant 2 g/mL de LM et 2 g/mL de FN et incuber à 37 'C en 5% de CO2 pendant la nuit. À ce stade, le plat avec la solution LM/FN peut être conservé dans l’incubateur pendant des mois tant qu’il ne se dessèche pas. Ajouter plus de 1x PBS pour empêcher le plat de sécher.
  2. Préparation des médias
    1. Préparer le milieu Essential 8 (E8) en décongelant une bouteille de supplément E8 à 4 oC pendant la nuit. Mélanger le supplément avec 500 ml de mi-moyen E8 et d’antibiotiques si nécessaire.
      REMARQUE : La solution E8 de travail doit être utilisée dans les 2 semaines.
    2. Préparer le milieu de congélation hPSC en mélangeant 90 ml de moyen E8 complet avec 10 ml de DMSO pour un volume total de 100 ml. Filtrer stériliser.
    3. Préparer le milieu de différenciation du jour 0 au jour 1 en mélangeant 100 ml de milieu essentiel 6 (E6) avec 10 M SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 et 10 M Y27632 pour un volume total de 100 mL.
    4. Préparer le milieu de différenciation de jour 2 à jour 10 en mélangeant 100 ml de milieu E6 avec 10 M SB et 0,75 M CHIR99021 pour un volume total de 100 ml.
    5. Préparer le jour 10 à jour 14 sphéroïdes milieu en mélangeant milieu neurobasal avec 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM L-Glutamate, 3 M CHIR99021, et 10 ng/mLGF F2 pour un volume total de 100 mL.
    6. Préparer le jour 14 au jour 28 moyen pour l’entretien à long terme sphéroïde en ajoutant 0,5 m de PR frais au jour 10 au jour 14 sphéroïde moyen pour chaque alimentation.
      REMARQUE : Gardez toujours la RA à -80 oC.
    7. Préparer le milieu de maturation SymN en mélangeant le milieu neurobasal avec 2 ml de B27 (50x), 1 ml de N2 (100x), 2 mM L-glutamate, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 M acide ascorbique et 0,2 mM dbcAMP pour un volume total de 100 ml. La solution doit être utilisée dans les 2 semaines. Avant chaque alimentation, ajouter 0,125 M de PR frais. Cette solution est utilisée dès le jour 14 (option 1) ou le jour 28 (option 2).
    8. Préparer le tampon FACS en mélangeant DMEM avec 2% FBS, 2 mM L-glutamate et antibiotiques si nécessaire pour un volume total de 100 ml.
  3. entretien hPSC
    1. Dégel et maintien des HPSC
      1. Préparer un plat enrobé de 100 mm VTN.
      2. Pour décongeler une fiole de HPSCs directement à partir d’azote liquide, placez la fiole dans un bain d’eau de 37 oC, balançant soigneusement le tube dans l’eau jusqu’à ce qu’il dégèle. Transférer les HPSC décongelés dans un tube de 15 ml contenant 10 ml de PBS 1x et centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
      3. Jeter le supernatant et ajouter 1 ml de milieu E8 au tube. Pipette à quelques reprises pour réanimer complètement la pastille, puis ajouter un autre 9 ml de milieu E8 pour atteindre 10 ml au total.
      4. Aspirez la solution VTN à partir du plat de 100 mm.
      5. Transférer les HPSC dans un plat de 100 mm, secouer doucement (vers le bas et gauche-droite, pas en cercles) pour s’assurer que les cellules sont réparties uniformément dans le plat
      6. Incubate à 37 oC, en2CO 2 à 5 %.
      7. Le lendemain, aspirez tout le milieu et alimentez-le avec 10 ml d’E8.
      8. Nourrissez de cette façon tous les jours pendant les 3 à 4 prochains jours, puis préparez-vous à se diviser.
    2. Fractionnement des HPSCs
      REMARQUE : Les HPSC au point de division devraient être confluents de 80 % à 90 %. Il faut observer de grandes colonies aux bords lisses et lumineux. Toutefois, les contacts entre chaque colonie doivent être évités(figure 2B, jour 0 et figure 6B).
      1. Préparez des plats de 100 mm recouverts de VTN au besoin.
      2. Aspirer l’E8 et laver le plat qui doit être divisé 1x avec 1x PBS.
      3. Aspirez le 1x PBS et ajoutez 4 ml de 0,25 M EDTA. Incuber pendant 2 min à 37 oC, 5% de CO2.
        REMARQUE : Les HPSCs doivent être divisés/replégés en petites colonies. Ne traitez pas avec EDTA plus de 2 minutes pour empêcher la séparation en cellules individuelles. Les cellules doivent être encore attachées à la surface du plat après le traitement de 2 minutes.
      4. Aspirer l’EDTA, détacher les colonies en parcheminant fortement 10 ml de milieu E8 sur la surface du plat, et recueillir tous les milieu et les cellules dans un tube de 15 mL.
      5. Avec des HPSC à 80 % à 90 %, les colonies divisées de 1:15-1:20. Par exemple, diviser les HPSC de 1:20 en un plat de 100 mm, prendre 500 L de solution E8/hPSCs et mélanger avec 9,5 ml de moyen E8 frais.
      6. Assiette hPSCs dans les plats de 100 mm recouverts de VTN.
        REMARQUE : Il est conseillé d’établir le rapport de fractionnement idéal pour chaque chercheur et ligne cellulaire indépendamment.
    3. Congélation des HPSC
      1. Pour un plat de 100 mm de HPSCs qui est prêt à être fendu, préparer trois cryoviaux et 3,5 ml de milieu de congélation.
        REMARQUE : Les médias et les flacons doivent être conservés à 4 oC ou sur la glace jusqu’à l’utilisation.
      2. Aspirez E8 et lavez le plat 2x avec 1x PBS.
      3. Aspirer 1x PBS et ajouter 4 mL de 0,25 M EDTA, incuber pendant 2 min à 37 oC, en 5% de CO2.
        REMARQUE : Les HPSC devraient être congelés comme de petites colonies au moment où elles seraient divisées. Ne traitez pas les cellules avec EDTA plus de 2 minutes pour empêcher la séparation en cellules individuelles. Les cellules doivent être encore attachées sur la surface du plat après le traitement de 2 minutes.
      4. Aspirer l’EDTA, détacher les colonies en parcheminant fortement 10 ml de PBS 1x à la surface du plat, et recueillir toutes les cellules moyennes et cellules dans un tube de 50 mL.
      5. Ajouter 20 ml de PBS 1x et centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min pour laver le reste de l’EDTA.
      6. Jeter le supernatant et réutiliser la pastille dans 3 ml de milieu de congélation.
      7. Distribuez les HPSC uniformément dans les trois cryoviaux, 1 ml chacun.
      8. Conserver à -80 oC pendant la nuit dans une boîte de congélation contrôlée ou un sandwich en polystyrène pour assurer une baisse de température lente, puis transférer à un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme.

2. Ensemencement des HPSCs pour commencer la différenciation (jour 0)

REMARQUE : Les HPSC devraient être prêts à être différenciés après avoir été stabilisés (c.-à-d. être divisés 2 à 3x après le dégel). Assurez-vous que les colonies sont saines, avec des bords lisses et brillants, et une différenciation minimale(figure 2B).

  1. Préparer des plats recouverts de matrice de membrane de sous-sol (24 plats bien ou 6 plats bien) un jour avant le jour 0 au besoin. Apportez les plats à RT au début de la différenciation.
  2. Rendre la différenciation de jour 0-1 moyenne au besoin.
  3. Aspirer l’E8 du confluent, prêt à fendre les HPCS et laver le plat 2x avec 1x PBS.
  4. Ajouter 7 ml de 0,25 M EDTA par plat de 100 mm, incuber à 37 oC, 5 % de CO2,pendant 15 min.
    REMARQUE : À ce stade, le traitement EDTA est prolongé pour se disperser en cellules simples.
  5. Pipet hors de tous les HPSCs (ils doivent flotter) et le transfert à un tube de 50 mL. Ajoutez la même quantité ou plus de 1x PBS que la solution EDTA pour diluer l’EDTA.
  6. Centrifugeuse à 200 x g pour 4 min.
  7. Jetez le supernatant, ajoutez 1 ml de milieu de différenciation du jour 0-1 et pipet pour homogénéiser les cellules. Suivez en ajoutant plus de médium, puis mélanger pour diluer la solution cellulaire à une concentration idéale pour compter les cellules.
    REMARQUE : Ne pas trop surdéglementer la solution cellulaire. Les cellules d’un plat complet de 100 mm doivent être diluées dans 5 ml de milieu pour commencer.
  8. Comptez le numéro de cellule à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre.
  9. Diluer la solution cellulaire au besoin pour atteindre 125 000 cellules/cm2 dans un faible volume final (p. ex., 2 ml par puits pour un plat de 6 puits ou 500 ll par puits pour un plat de 24 puits).
    REMARQUE : Un faible volume aide les cellules à se fixer plus rapidement.
  10. Aspirez toute la solution de matrice de membrane de sous-sol à partir des plats enduits et plaquez la solution cellulaire dans les puits.
  11. Incubate à 37 oC, en2CO 2 à 5 %.

3. Induction de cellules de crête neurale (jour 1 au jour 10, figure 2A)

  1. Le jour 1, nourrir les cellules avec un milieu de différenciation de jour 0 à 1 (3 ml par puits pour 6 plats de puits et 1 ml par puits pour 24 plats de puits).
  2. Le jour 2 nourrir les cellules avec le jour 2 jours 10 milieu de différenciation (3 ml par puits pour 6 plats de puits et 1 ml par puits pour 24 plats de puits).
  3. Dorénavant, les cellules doivent être nourries tous les deux jours jusqu’au jour 10 (c’est-à-dire que le jour suivant d’alimentation sera le jour 4).
    REMARQUE : Dès le jour 6, des crêtes NC doivent être détectées(figure 2B). Pour vérifier si la différenciation a lieu, il est conseillé de porter une culture de différenciation parallèle dans les petits puits (c.-à-d., 24 puits), qui peut être taché pour SOX10/AP2a et utilisé pour l’expression des gènes marqueurs le temps de la différenciation(figure 2B,C).
  4. Si vous triez les cellules, passez à l’article 4. Dans le cas contraire, passez à l’article 5.

4. Fluorescence activée tri cellulaire (FACS) pour le marqueur de crête neurale CD49D et l’agrégation des cellules NC dans les sphéroïdes

REMARQUE : Pour le tri du FACS, les échantillons doivent être conservés sur la glace et ne pas être exposés à la lumière après la coloration jusqu’au tri.

  1. Préparer le tampon FACS si les cellules sont triées.
  2. Préparer le milieu sphéroïde du jour 10-14.
  3. Le jour 10, retirer le milieu, et laver 1x avec 1x PBS.
  4. Ajoutez une solution de dissociation (voir Tableau des matériaux)à 2 ml par puits pour un plat de 6 puits ou 1 ml par puits pour un plat de 24 puits, et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 20 min.
  5. Pipet hors de tous les HPSCs et transférer à un tube de 50 mL.
  6. Remplissez le reste du tube avec un tampon FACS et une centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
    REMARQUE : Chaque tube de 50 ml peut accueillir jusqu’à 20 ml ou moins de solution cellulaire. Le volume du tampon FACS devrait être suffisamment élevé pour neutraliser la solution de dissociation.
  7. Jetez le supernatant, réutilisez les cellules avec la quantité appropriée de tampon FACS (2 ml par puits d’une plaque de puits de 6), et comptez pour déterminer le nombre de cellules.
  8. Préparer les échantillons suivants.
    1. Échantillon 1 (contrôle non souillé) : 1 x 106 cellules dans 400 l 'L de tampon FACS. Filtrer les cellules à l’eau à l’eau d’une calotte de paseur de 20 m et garder le tube sur la glace.
    2. Échantillon 2 (DAPI seulement contrôle) : 1 x 106 cellules dans 400 L de tampon FACS contenant 0,5 ug/mL DAPI. Filtrer les cellules à travers un tube FACS avec un bouchon de pasoire et garder le tube sur la glace.
    3. Exemple 3 (étiquette CD49d) : Suspendre le reste des cellules avec un tampon FACS contenant un anticorps CD49D conjugué PE/Cy7 (5 ll pour 1 x 106 cellules par 100 ll de tampon FACS) dans un tube de 15 ml et incuber sur la glace pendant 20 min.
  9. Remplissez les tubes avec un tampon FACS et une centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
  10. Jetez le supernatant et réutilisez-le toutes lescellules 5-10 x 6 dans 1 ml de tampon FACS contenant 0,5 ug/mL DAPI selon les instructions du fabricant.
  11. Filtrer les cellules à travers le tube FACS avec le bouchon de pasoire et garder le tube sur la glace.
  12. Préparer la collecte des tubes FACS contenant 2 ml de tampon FACS.
  13. Trier la machine FACS avec des lasers qui peuvent détecter DAPI et PE-Cy7 pour isoler lapopulation CD49D.
  14. Après le tri, comptez les cellules triées.
  15. Centrifugeuse toutes les cellules triées et la résuspendance dans le milieu sphéroïde de jour 10-14 à une concentration finale de 0,5 x 106 cellules par 500 'L de milieu.
  16. Plaque 0.5 x 106 cellules par puits dans l’attachement ultra-faible 24 plaques de puits.
  17. Incuber les cellules à 37 oC, en 5% de CO2.

5. Agréger les cellules NC dans les sphéroïdes

  1. Si ce n’est pas utiliser FACS pour isoler les cellules NC et plutôt les agréger en sphéroïdes directement, préparez d’abord les cellules telles que décrites dans les étapes 4.2-4.5.
  2. Remplissez le reste du tube avec 1x PBS, et centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
  3. Jetez le supernatant, réutilisez les cellules avec une quantité appropriée de milieu sphéroïde de jour 10-14 (p. ex. 2 ml de milieu par puits pour une plaque de puits de 6), et comptez pour déterminer le nombre de cellules.
  4. Diluer les cellules dans le jour 10-14 sphéroïde moyen à 0,5 x 106 cellules par 500 'L de milieu.
  5. Plaque 500 L de la suspension cellulaire par puits dans l’attachement ultra-faible 24 plaques de puits.
  6. Incuber les cellules à 37 oC, en 5% de CO2.

6. Entretien sphéroïde NC et induction sympathique progéniteur (jour 10 au jour 14, Figure 4A)

  1. Option 1 : Culture sphéroïde minimale
    1. Le jour 11, ajouter 500 L du milieu sphéroïde du jour 10-14 aux sphéroïdes NC sans aspirer le milieu existant à partir du jour 10. Incubate à 37 oC, en2CO 2 à 5 %.
    2. Le jour 12, inclinez la plaque pour accumuler les sphéroïdes NC d’un côté des puits. Aspirer soigneusement et jeter autant de milieu que possible, et nourrir avec 1 ml de milieu sphéroïde de jour 10-14.
    3. Continuez à nourrir les cellules tous les jours jusqu’au 14e jour.
    4. Facultatif : Si les sphéroïdes s’agrégent et génèrent un gros bouquet, utilisez une pipette pour briser les amas de sphéroïdes. Cela garantit également que les sphéroïdes individuels ne deviennent pas trop grands.
      REMARQUE : La plage idéale de taille de sphéroïde devrait être d’environ 100 à 500 m. Dans cette fourchette, la taille des sphéroïdes individuels n’est pas critique. Cependant, la morphologie, comme un bord lisse et clair(figure 3 et figure 6) est importante pour un succès plus poussé. Au jour 14, chaque plaque de puits de 24 contient idéalement environ 50 à 60 sphéroïdes de différentes tailles dans la plage de taille ci-dessus.
  2. Option 2 : Culture sphéroïde élargie
    1. Le jour 15, pour garder les sphéroïdes NC, nourrissez-le avec 1,5 ml de milieu sphéroïde du jour 10-14 contenant 0,5 M RA. Incubation à 37 oC, 5% de CO2.
      REMARQUE : La RA doit être ajoutée fraîche pour chaque alimentation et toujours être stockée à -80 oC.
    2. Dorénavant, nourrissez tous les deux jours jusqu’au jour 28, puis continuez avec le placage des sphéroïdes (section 7.1).
      REMARQUE : Les sphéroïdes croissants sont divisés environ 1x par semaine en les canalisation avec une pipette de 1 mL pour les briser. Ils sont divisés à un ratio approximatif de 1:2-1:4. Au cours de la période d’expansion de 2 semaines, les cellules devraient à peu près quadrupler en nombre.

7. Différenciation et maturation SymN (Option 1 : après le 14e jour; Option 2 : après le 28e jour)

  1. Placage des sphéroïdes dans des plats réguliers
    1. Préparer des assiettes de puits 24 po/LM/FM.
    2. Préparer le support symN contenant 0,125 M RA (ajouter de l’huile fraîche à chaque aliment) et 10 M Y27632 (jour 14 seulement).
    3. Le jour 14, inclinez la plaque pour accumuler des sphéroïdes NC d’un côté des puits. Aspirez soigneusement et jetez autant de support que possible, et nourrissez avec 1 ml de symN moyen.
    4. Retirez LM/FN des plaques enduites.
    5. Diviser et plaquer chacun des 24 puits en 4 puits séparés de la nouvelle plaque de puits 24 enduite. Chaque puits d’origine aura 1 ml, contenant des sphéroïdes de 50 à 60. Cela donne 250 ll, contenant environ 10-15 sphéroïdes pour chaque puits sur la nouvelle plaque.
    6. Ajouter 250 L de milieu supplémentaire par puits.
      REMARQUE: Il s’agit d’une scission de 1:4; assurez-vous que les sphéroïdes sont distribués correctement dans la solution de sorte que la scission est relativement égale. Le nombre de sphéroïdes n’est pas compté parce que le nombre final n’affecte pas le succès de la génération de symNs.
    7. Incubation à 37 oC, 5% de CO2.
    8. Le jour 15 (ou le jour 29 pour l’option 2), nourrir en remplaçant tout le milieu par 1 ml de milieu symN contenant 0,125 M RA. A partir de maintenant, les neurones doivent être nourris tous les 2 jours jusqu’au jour 20 (ou jour 35 pour l’option 2).
    9. Après le jour 20 (ou le jour 35 pour l’option 2), les neurones doivent être alimentés en remplaçant soigneusement seulement la moitié du milieu existant (500 ll). A partir de maintenant, nourrir chaque semaine à moins que le milieu devient rapidement jaune.
    10. Continuez à vous nourrir chaque semaine jusqu’au point de temps désiré.
      REMARQUE : Les symNs ont tendance à s’agréger dans des structures ressemblant à des ganglions et sont enclins à se détacher des plats de culture. Pour éviter cela, des demi-alimentations et une manipulation minimale sont recommandées.
  2. Cellules de placage pour l’enregistrement électrophysiologique
    1. Préparer des plaques d’électrophysiologie de puits PO/LM/FM 96.
    2. Préparer le support symN contenant 0,125 M RA (ajouter de l’huile fraîche à chaque aliment) et 10 M Y27632 (jour 14 seulement).
    3. Le jour 14, recueillir tous les sphéroïdes, puis les centrifuger à 200 x g pour 4 min.
    4. Jetez le supernatant, ajoutez 2 ml de solution de dissociation et transférez le mélange vers l’un des puits de la plaque d’attache ultra-faible. Incuber à 37 oC, en 5% de CO2 pour 20-45 min.
      REMARQUE : Selon la taille des sphéroïdes, la période de dissociation peut être plus longue que 20 min. Vérifiez la dissociation de la cellule tous les 10 minutes jusqu’à 45 min. Optionnellement, 0,1 mg/mL de DNase peut être ajouté avec la solution de dissociation pour empêcher l’ADN libre des cellules mortes rendant la solution collante. Ceci est facultatif dans ce protocole parce que les sphéroïdes ne s’agrégent pas une fois qu’ils sont entièrement dissociés.
    5. Pipet pour dissocier complètement les sphéroïdes, puis centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
    6. Jetez le supernatant, réutilisez les cellules avec une quantité appropriée de milieu symN, et comptez le nombre de cellules.
    7. Plaquez les cellules à 100 000/cm2 dans les puits d’électrophysiologie po/LM/FN en volume total par puits.
    8. Le jour 15 (ou le jour 29 pour l’option 2), suivez les mêmes processus d’alimentation que dans la section 7.1. Le volume total après jour 15 (ou jour 29 pour l’option 2) devrait être de 300 l par puits.
    9. Mesurez les signaux électriques à l’aide d’une machine multiélecttrode après le 20e jour (ou jour 35 pour l’option 2).
      REMARQUE : Dans l’option 2, les sphéroïdes peuvent être plaqués à tout moment entre le jour 14-jour 28. Les premières mesures des signaux électriques peuvent être effectuées 1 semaine après avoir placage des sphéroïdes.

Résultats

Dans ce protocole, nous donnons des instructions sur la façon de générer des symNs à partir de hPSCs. Les conditions de culture démontrées ici ont été améliorées d’un protocole publié plus tôt23,24 ( figure1A) à des conditions sans conducteur et chimiquement définies (figure 1B). Deux options sont offertes, l’une où les symNs sont réalisés dans les 20 jours, et l’autre où les CCN ...

Discussion

Nous avons récemment publié deux examens, l’un traitant de l’utilisation de symNs dérivés du HPSC pour la modélisation des maladies31 ainsi qu’une comparaison approfondie des protocoles de différenciation disponibles22. Ainsi, nous nous concentrons ici sur le dépannage du protocole actuel pour aider le chercheur intéressé à réussir à faire des symN. Pendant tout le processus de différenciation, afin d’obtenir des données cohérentes ainsi que des cellu...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Heidi Ulrichs pour la lecture critique et l’édition du manuscrit.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishesFalcon353003
15 mL conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-664
24-well tissue culture platesFalcon353047
24-well ultra-low-attachment platesCorning07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubatorThermo Fisher/Life TechnologiesHeracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-656
6-well tissue culture platesCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibodyAbcamab108311Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibodyBD Pharmingen556604Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibodyBioLegend304313Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype)BioLegend400125Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dyeSigmaD95421:1000 dilution
Anti-DBH antibodyImmunostar22806Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibodyAbcamab13970Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibodyAbcamab50839Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibodyMabNET17-1Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibodySanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-365692Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibodyPel-FreezP40101- 150Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acidSigmaA8960-5GStock concentration: 100 mM
B27 supplementThermo Fisher/Life Technologies12587-010Stock concentration: 50x
BDNFR&D Systems248-BDStock concentration: 10 μg/mL
BMP4R&D Systems314-BPStock concentration: 6 mM
Cell counterThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Cell counting chamber slidesInvitrogenC10312
CentrifugeEppendorf57021&5424R
CHIR99021R&D Systems4423Stock concentration: 6 mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Stock concentration: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Stock concentration: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Stock concentration: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 mediumgibcoA15165-01
E8 mediumgibcoA15169-01Stock concentration: 1x
E8 supplementgibcoA15171-01Stock concentration: 50x
EDTASigmaED2SSStock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS machineBeckman CoulterCytoFLEX (for FACS)
FACS machineBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap)Falcon352235
FACS tubes (white cap)Falcon352063
Fetal bovine serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Stock concentration: 10 μg/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN)VWR/Corning47743-654Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamineThermo Fisher/Gibco25030-081Stock concentration: 200 mM
LN tankCustom Biogenic SystemsV-1500AB
MEA readerAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse laminin I (LM)R&D Systems3400-010-01Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplementThermo Fisher/Life Technologies17502-048Stock concentration: 100x
Neurobasal mediumgibco21103-049Stock concentration: 1x
NGFPeproTech450-01Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-136Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)SigmaP3655Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics)InvivoGenANTPM1Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machineBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR platesBio-Rad LaboratoriesHSP9601
recombinant FGF2R&D Systems233-FB/CFStock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acidSigmaR2625Stock concentration: 1 mM
SB431542Tocris/R&D Systems1614Stock concentration: 10 mM
Trypan blueCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bathVWR/Corning706308
Y27632R&D Systems1254Stock concentration: 10 mM

Références

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Biologie du d veloppementnum ro 159cellules souches pluripotentes humainescr te neuronaleneurones sympathiquessyst me nerveux autonomesyst me nerveux sympathiqueculture des cellules souches sans mangeoires et d finie chimiquement

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.