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Resumen

En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.

Resumen

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) se han convertido en una poderosa herramienta para el modelado de enfermedades y el estudio del desarrollo embrionario humano in vitro. Anteriormente presentamos un protocolo de diferenciación para la derivación de neuronas autonómicas con carácter simpático que se ha aplicado a pacientes con neuropatía autonómica. Sin embargo, el protocolo se construyó sobre el reemplazo de suero Knock Out (KSR) y las condiciones de cultivo basadas en el alimentador, y para garantizar una alta eficiencia de diferenciación, la clasificación celular era necesaria. Estos factores causan alta variabilidad, alto costo y baja reproducibilidad. Además, no se han verificado las propiedades simpáticas maduras, incluida la actividad eléctrica. Aquí, presentamos un protocolo optimizado donde el cultivo y la diferenciación de PSC se realizan en condiciones de cultivo libres de alimentación y definidas químicamente. Se identifican marcadores genéticos que identifican la cresta neural del tronco. Una mayor diferenciación en las neuronas simpáticas postgangliónicas se logra después de 20 días sin la necesidad de clasificación celular. El registro electrofisiológico muestra aún más la identidad funcional de la neurona. El disparo detectado por nuestras neuronas diferenciadas puede ser mejorado por la nicotina y suprimido por el antagonista del receptor adrenérgico propranolol. Los progenitores neuronales simpáticos intermedios en este protocolo se pueden mantener como esferoides neuronales durante un máximo de 2 semanas, lo que permite la expansión de los cultivos. En resumen, nuestro protocolo actualizado de diferenciación de neuronas simpáticas muestra una alta eficiencia de diferenciación, mejor reproducibilidad, más flexibilidad y mejor maduración neuronal en comparación con la versión anterior. Este protocolo proporcionará a los investigadores las células necesarias para estudiar los trastornos humanos que afectan al sistema nervioso autónomo.

Introducción

Las neuronas simpáticas postgangliónicas (simron) pertenecen al sistema nervioso autónomo (ANS) y tienen múltiples papeles importantes en la respuesta y regulación de la homeostasis del cuerpo independiente de la conciencia. Por ejemplo, el estrés estimula las sin, y evoca la respuesta de lucha o vuelo que conduce a un aumento de la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la sudoración. Los SymN se ven afectados en múltiples trastornos humanos debido a la genética, toxicidad/lesión, o como compañeros de otras enfermedades. Un ejemplo de neuropatía genética es el trastorno infantil Disautonomia Familiar (FD), donde una severa desregulación de las simadoras causa crisis disautonómica, evidente por sudoración, manchadeo de la piel, ataques de vómitos, hipertensión y ansiedad1. Un ejemplo de toxicidad es el tratamiento de quimioterapia, que se ha divulgado para tener efectos secundarios tóxicos en las neuronas autonómicas2. Se sabe que la denervación autonómica y la hiperinnervación pueden conducir o acompañar a enfermedades como la enfermedad de Parkinson o la enfermedad renal hipertensiva3,4. Por lo tanto, ser capaz de llevar a cabo investigaciones y comprender los mecanismos de la biología sinmN y defectos en el contexto de la enfermedad es beneficioso para la búsqueda de tratamientos novedosos y eficaces.

Anatomía
El sistema nervioso periférico se ramifica en divisiones sensoriales y autonómicas. Los nervios aferentes del sistema nervioso sensorial son responsables de la sensación de dolor y tacto, mientras que el ANS es responsable de transmitir información de todos los órganos al cerebro. El ANS se divide en el sistema nervioso entérico, inervando el tracto gastrointestinal, el sistema nervioso parasimpático, que es importante para la relajación, y el sistema nervioso simpático (SNS), que es importante para la activación / regulación de los órganos. El SNS adapta un sistema de dos neuronas5. Los axones neurales simpáticos pregangliónicos en la médula espinal primero se proyectan a los ganglios simpáticos, donde se encuentran los cuerpos celulares simios posganglónicos. Estas neuronas entonces envían proyecciones largas para inervate los tejidos diana de cada órgano en el cuerpo. Las señales transmitidas por las neuronas pregangliónicas son colinérgicas, mientras que los símN postgangliónicos son adrenérgicos y por lo tanto expresan norepinefrina (NE) como su principal neurotransmisor. Hay pocas excepciones notables de las neuronas simpáticas postgangliónicas que son colinérgicas, incluyendo las que inervan los vasos sanguíneos. Las neuronas postgangliónicas adrenérenérgicas expresan las enzimas tirosina hidroxilasa (TH), la aromática L-aminoácido decarboxilasa (AAAD), la dopamina-hidroxilasa (DBH) y la monoaminooxidasa (MAO-A), todas responsables de generar y metabolizar NE. Además, expresan los transportadores de reciclaje NE y/o los receptores de receptores adrenérgicos (ADRA2), el receptor adrenérgico (ADR2B), el transportador de noradrenalina (NET1) y el transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).

Desarrollo
Durante el desarrollo embrionario, los sinmos se derivan de la cresta neural (NC), que emerge entre el tubo neural y la superposición de ectodermos6,y pueden diferenciarse en múltiples linajes celulares, incluyendo melanocitos, osteoblastos, adipocitos, glia, neuronas entéricas, neuronas sensoriales y neuronas autonómicas7. Las células de la cresta neural (NCC) son células altamente migratorias que toman varias rutas a través del embrión. En esta etapa temprana del desarrollo de NC, las células expresan los marcadores SNAIL1/2, FOXD3 y SOX108,,9,10,11. La ruta de migración junto con la ubicación axial que adoptan determina el subtipo NC en el que se desarrollarán. Estos subtipos NC se pueden distinguir por su expresión génica HOX específica: los NCC craneales no expresan genes HOX, los NCC vagales expresan HOX 1–5, los NCC troncales expresan HOX 6–9 y los NCC sacros expresan HOX 10–1112. Entre ellos, los NCC troncales se reconocen como la fuente principal de symNs. Los precursores de SymN expresan el factor de transcripción MASH1/ASCL113, que promueve la expresión de PHOX2B14 e INSM115. La familia GATA de factores de transcripción se expresa durante el desarrollo simpático tardío. GATA2 y GATA3 se expresan en los sinmN, que a su vez activa DBH16. El factor de transcripción HAND2 también es importante para la expresión y el mantenimiento de DBH y TH17.

Los HpSC (por ejemplo, células madre embrionarias e pluripotentes inducidas) son una poderosa herramienta18 para recapitular paradigmas de desarrollo y generar sinmN que luego se pueden emplear para el modelado de enfermedades de diversos trastornos humanos. Por lo tanto, al generar sinmos a partir de hPSCs, es crucial seguir las pautas de desarrollo y evaluar la expresión de marcadores apropiados a lo largo del proceso de diferenciación.

Protocolo SymN anterior
Pocos grupos de investigación han informado previamente de la generación de sinmN sde hPSCs19,20,21. La comparación directa de estos protocolos entre sí y el nuestro fue revisada recientemente22. En 201623,publicamos un protocolo de diferenciación para la generación de neuronas autonómicas con carácter symN(Figura 1A). Este protocolo utilizaba un medio basado en KSR, que se utilizaba tanto en el mantenimiento de hPSC indiferenciados como en la diferenciación celular. Además, se mantuvieron los hPSC en fibroblastos embrionarios de ratón (células alimentadoras de MEF). Empleamos este protocolo y PSCs de pacientes con FD para modelar el trastorno23. En 2019, describimos una versión más detallada de este protocolo anterior24. En resumen, el destino neural fue inducido por la inhibición SMAD dual25 para bloquear la señalización de TGF y BMP en los primeros 2 días. La activación de WNT mediante CHIR99021 promovió progenitores neuronales para convertirse en células NC. En el día 11, las células fueron ordenadas por FACS para CD49D+ o SOX10+ poblaciones26,23, que produjo aproximadamente 40% de eficiencia de generación NC. Por lo tanto, la clasificación era necesaria para garantizar la eficiencia y pureza para los próximos pasos de diferenciación. Los NCC se mantuvieron y se amplificaron como esferoides con el tratamiento combinado de FGF2 y CHIR. Después de 4 días, los esferoides NC de mantenimiento fueron chapados y recibieron BDNF, GDNF y NGF para terminar la maduración de la simN. Aunque estos sinmN expresaron marcadores sinmN fuertes como ASCL1, TH, DBH y PHOX2A, los marcadores para sinmNs más maduros, incluida la expresión del receptor de acetilcolina nicotínico (CHRNA3/CHRNB4) y el transportador de vesículas (VMAT1-2), eran bajos incluso después de 70 días de diferenciación. Los genes HOX en este protocolo no fueron probados formalmente, y las propiedades neuronales maduras, incluyendo la actividad electrofisiológica de las células, no fueron verificadas.

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para generar symNs(Figura 1B). Los HPSC se mantienen en condiciones libres de alimentación, en platos recubiertos con vitronectina (VTN), utilizando los medios Essential 8 (E8)27. La fórmula de los medios de diferenciación se ha modificado en cada etapa, aumentando así el porcentaje de la población NC28. La maduración de la sinmN se puede hacer en CD49D+/SOX10+ poblaciones de NCC a granel ordenadas o no ordenadas. Ambos muestran altos niveles de expresión de marcador symN para el día 30. Además, los sinmN generados con este protocolo responden a la grabación electrofisiológica y a los tratamientos con activador de SIMn y compuestos inhibidores.

Protocolo

NOTA: La línea de reporteroh9 PHOX2B:GFP fue proporcionada por Oh et al.19. Algunas imprimaciones qPCR utilizadas en este artículo se obtuvieron de OriGene Technologies, mientras que algunas secuencias se obtienen de Frith et al.20,30.

1. Configuración para recubrimiento de platos, preparación de medios y mantenimiento de hPSC

  1. Recubrimiento de platos
    1. Recubrimiento vitronectina (VTN)
      1. Colocar los viales de VTN en un baño de agua a 37 oC hasta que esté completamente descongelado y, a continuación, mezcle bien.
      2. Para una placa Petri de 100 mm, mezcle 7 ml de solución salina tamponada de fosfato 1x (PBS) con 0,5 mg/ml de VTN, agregue la solución VTN al plato e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
    2. Recubrimiento de matriz de membrana de sótano
      1. Descongelar los viales de matriz de membrana del sótano (ver Tabla de Materiales)sobre hielo a 4oC durante la noche.
      2. Para un pozo de una placa de 6 pocillos, mezcle 2 ml de DMEM/F12 con una matriz de membrana de sótano de 200x, agregue la solución de matriz de membrana del sótano al plato, envuelva el plato con película de parafina y guárdelo en un recipiente limpio a 4 oC durante la noche. Trabaje lo más rápido posible. Los platos recubiertos se pueden guardar en 4 oC durante un máximo de 2 semanas.
    3. Recubrimiento de poliornitina (PO)/laminina (LM)/fibronectina (FN)
      1. El primer día, para un pozo de una placa de 24 pocillos, mezcle 15 g/ml de PO con 1 ml de PBS 1x, incubar a 37oC, 5%CO2 durante la noche. Descongelar tanto LM como FN a -20 oC durante la noche y almacenar a 4oC hasta que esté completamente descondén.
      2. En el segundo día, aspirar la solución de PO, lavar los pozos 2x con 1x PBS, añadir 1 mL de 1x PBS que contenga 2 g/ml de LM y 2 g/ml de FN e incubar a 37 oC en 5% de CO2 durante la noche. En este punto, el plato con la solución LM/FN se puede mantener en la incubadora durante meses, siempre y cuando no se seque. Agregue más 1x PBS para evitar que el plato se seque.
  2. Preparación de los medios
    1. Preparar el medio Essential 8 (E8) descongelando una botella de suplemento E8 a 4 oC durante la noche. Mezclar el suplemento con 500 mL de medio E8 y antibióticos si es necesario.
      NOTA: La solución E8 en funcionamiento debe utilizarse en un plazo de 2 semanas.
    2. Preparar el medio de congelación hPSC mezclando 90 ml de medio E8 completo con 10 ml de DMSO para un volumen total de 100 ml. Esterilizar por filtro.
    3. Preparar el medio de diferenciación del día 0 al día 1 mezclando 100 ml de medio esencial 6 (E6) con 10 M SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021, y 10 m Y27632 para un volumen total de 100 ml.
    4. Preparar el medio de diferenciación del día 2 a 10 mezclando 100 ml de medio E6 con 10 M SB y 0,75 oM CHIR99021 para un volumen total de 100 ml.
    5. Preparar el medio esferoide del día 10 a día 14 mezclando el medio neurobasal con 2 ml de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM de L-glutamato, 3 m de CHIR99021 y 10 ng/mL FGF2 para un volumen total de 100 ml.
    6. Preparar el día 14 a día 28 medio para el mantenimiento esferoide a largo plazo mediante la adición de 0,5 m de RA fresca al día 10 a día 14 medio esferoide para cada alimentación.
      NOTA: Mantenga siempre el RA a -80 oC.
    7. Preparar el medio de maduración SymN mezclando el medio neurobasal con 2 ml de B27 (50x), 1 ml de N2 (100x), 2 mM de L-glutamato, 25 ng/mL bdNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 mM de ácido ascórbico y 0,2 mM dbcAMP para un volumen total de 10 mL. La solución debe utilizarse en un plazo de 2 semanas. Antes de cada alimentación, agregue un RA fresco de 0,125 m. Esta solución se utiliza desde el día 14 (opción 1) o el día 28 (opción 2).
    8. Prepare el tampón FACS mezclando DMEM con 2% DE FBS, 2 mM de L-glutamato y antibióticos si es necesario para un volumen total de 100 ml.
  3. mantenimiento hPSC
    1. Descongelar y mantener los hPSCs
      1. Preparar un plato de 100 mm recubierto de VTN.
      2. Para descongelar un vial de hPSCs directamente a partir de nitrógeno líquido, coloque el vial en un baño de agua de 37 oC, balanceando cuidadosamente el tubo en el agua hasta que se descongele. Transfiera los hPSC descongelarse a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de 1pbS y centrífuga a 200 x g durante 4 min.
      3. Deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de e8 medio al tubo. Pipetear unas cuantas veces para resuspender completamente el pellet y luego añadir otros 9 ml de medio E8 para alcanzar 10 ml en total.
      4. Aspirar la solución VTN de la placa de 100 mm.
      5. Transfiera los hPSC a un plato de 100 mm, agítese suavemente (arriba-abajo y izquierda-derecha, no en círculos) para asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente en el plato
      6. Incubar a 37oC, en 5% CO2.
      7. Al día siguiente, aspirar todo el medio y alimentar con 10 mL de E8.
      8. Alimente de esta manera todos los días durante los próximos 3-4 días y luego prepárese para separarse.
    2. Dividir los hPSC
      NOTA: los hPSC en el punto de división deben ser entre 80% y 90% de confluente. Se deben observar grandes colonias con bordes lisos y brillantes. Sin embargo, se debe evitar el contacto entre cada colonia(Figura 2B,día 0 y Figura 6B).
      1. Prepare platos de 100 mm recubiertos con VTN según sea necesario.
      2. Aspirar el E8 y lavar el plato que necesita ser dividido 1x con 1x PBS.
      3. Aspira el 1x PBS y agrega 4 mL de 0.25 M EDTA. Incubar durante 2 min a 37oC, 5%CO2.
        NOTA: Los hPSC deben dividirse/replacarse como pequeñas colonias. No tratar con EDTA de más de 2 min para evitar la separación en células individuales. Las células deben estar todavía unidas a la superficie del plato después del tratamiento de 2 minutos.
      4. Aspirar el EDTA, separar las colonias mediante el pipeteo fuertemente 10 mL de medio E8 en la superficie del plato, y recoger todos los medios y células en un tubo de 15 ml.
      5. Con hPSCs en 80%–90% de confluencia, divida las colonias por 1:15-1:20. Por ejemplo, para dividir los hPSC s por 1:20 en un plato de 100 mm, tome 500 ml de solución E8/hPSCs y mezcle con 9,5 ml de medio E8 fresco.
      6. PlacahPS en platos de 100 mm recubiertos con VTN.
        NOTA: Se recomienda establecer la relación de división ideal para cada investigador y línea celular de forma independiente.
    3. Congelación de hPSCs
      1. Para un plato de 100 mm de hPSCs que esté listo para ser partido, prepare tres crioviales y 3,5 ml de medio de congelación.
        NOTA: Los medios y viales deben conservarse en 4 oC o en hielo hasta su uso.
      2. Aspirar E8 y lavar el plato 2x con 1x PBS.
      3. Aspirar 1x PBS y añadir 4 mL de 0,25 M EDTA, incubar durante 2 min a 37oC, en 5% CO2.
        NOTA: los hPSC deben congelarse como pequeñas colonias en el momento en que se dividirían. No trate las células con EDTA durante más de 2 minutos para evitar la separación en células individuales. Las células deben estar todavía unidas en la superficie del plato después del tratamiento de 2 minutos.
      4. Aspirar el EDTA, separar las colonias mediante el pipeteo fuertemente 10 mL de 1x PBS en la superficie del plato, y recoger todos los medios y células en un tubo de 50 ml.
      5. Añadir 20 ml de 1x PBS y centrifugar a 200 x g durante 4 min para lavar el EDTA restante.
      6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de medio de congelación.
      7. Distribuya los hPSC uniformemente en los tres crioviales, 1 ml cada uno.
      8. Almacenar a -80 oC durante la noche en una caja de congelación controlada o en un sándwich de espuma de poliestireno para garantizar un descenso lento de la temperatura, y luego transferir a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

2. Sembrar hPSCs para iniciar la diferenciación (día 0)

NOTA: los hPSC deben estar listos para la diferenciación después de ser estabilizados (es decir, dividirse de 2 a 3 veces después de descongelarse). Asegúrese de que las colonias son saludables, con bordes lisos y brillantes, y diferenciación mínima(Figura 2B).

  1. Preparar platos recubiertos con matriz de membrana del sótano (24 pozos o 6 platos de pozos) un día antes del día 0 según sea necesario. Lleve los platos a RT al comienzo de la diferenciación.
  2. Haga que el día 0-1 de diferenciación sea medio según sea necesario.
  3. Aspirar el E8 del confluente, listo para dividir los hPCS, y lavar el plato 2x con 1x PBS.
  4. Añadir 7 mL de 0,25 M EDTA por plato de 100 mm, incubar a 37oC, 5% CO2,durante 15 min.
    NOTA: En este punto, el tratamiento con EDTA se dispersa en células individuales.
  5. Pipet a todos los hPSCs (deben estar flotando) y transferir a un tubo de 50 ml. Agregue la misma cantidad o más de 1x PBS como solución EDTA para diluir el EDTA.
  6. Centrífuga a 200 x g durante 4 min.
  7. Deseche el sobrenadante, agregue 1 ml del medio de diferenciación del día 0-1 y pipetee para homogeneizar las células. Siga agregando más medio y luego mezcle para diluir la solución celular a una concentración ideal para contar las células.
    NOTA: No sobrediluir la solución celular. Las células de un plato completo de 100 mm deben diluirse en 5 ml de medio para comenzar.
  8. Cuente el número de celda usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
  9. Diluir la solución celular según sea necesario para alcanzar 125.000 células/cm2 en un volumen final bajo (por ejemplo, 2 ml por pozo para un plato de 6 pozos o 500 ol por pozo para un plato de 24 pozos).
    NOTA: Un volumen bajo ayuda a que las celdas se conecten más rápido.
  10. Aspirar toda la solución de matriz de membrana del sótano de los platos recubiertos y placar la solución celular en los pozos.
  11. Incubar a 37oC, en 5% CO2.

3. Inducción celular de la cresta neural (día 1 al día 10, Figura 2A)

  1. En el día 1 alimentar las células con el día 0-1 medio de diferenciación (3 mL por pozo para 6 platos de pozo y 1 mL por pozo para 24 platos de pozo).
  2. El día 2 alimentar las celdas con día 2-día 10 medio de diferenciación (3 mL por pozo para 6 platos de pozo y 1 mL por pozo para 24 platos de pozo).
  3. A partir de ahora, las células deben ser alimentadas cada dos días hasta el día 10 (es decir, el siguiente día de alimentación será el día 4).
    NOTA: A partir del día 6, se deben detectar crestas NC(Figura 2B). Para comprobar si se está produciendo una diferenciación, se recomienda llevar un cultivo de diferenciación paralela en pozos más pequeños (es decir, 24 pozos), que se puede teñir para SOX10/AP2a y utilizarse para la expresión génica de marcadores a lo largo del tiempo de diferenciación(Figura 2B,C).
  4. Si está ordenando celdas, proceda a la sección 4. De lo contrario, proceda a la sección 5.

4. Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para el marcador de cresta neural CD49D y la agregación de células NC en esferoides

NOTA: Para la clasificación facS, las muestras deben mantenerse en hielo y no exponerse a la luz después de la tinción hasta la clasificación.

  1. Prepare el búfer FACS si las celdas están ordenadas.
  2. Preparar el medio esferoide del día 10–14.
  3. El día 10, retire el medio y lave 1x con 1pbS.
  4. Añadir solución de disociación (ver Tabla de Materiales)a 2 ml por pozo para un plato de 6 pozos o 1 ml por pozo para un plato de 24 pozos, e incubar a 37 oC, 5% CO2 durante 20 min.
  5. Pipet a todos los hPSCs y transfiera a un tubo de 50 ml.
  6. Llene el resto del tubo con tampón FACS y centrífuga a 200 x g durante 4 min.
    NOTA: Cada tubo de 50 ml puede acomodar hasta 20 ml o menos de solución celular. El volumen del búfer FACS debe ser lo suficientemente alto como para neutralizar la solución de disociación.
  7. Deseche el sobrenadante, resuspenda las celdas con la cantidad apropiada de búfer FACS (2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos) y cuente para determinar el número de celda.
  8. Prepare los siguientes ejemplos.
    1. Muestra 1 (control sin mancha): 1 x 106 celdas en 400 l de tampón FACS. Filtrar las células a través de una tapa de colador de 20 m y mantener el tubo en hielo.
    2. Muestra 2 (control de solo DAPI): 1 x 106 celdas en 400 l de búfer FACS que contiene 0,5 ug/ml de DAPI. Filtrar las células a través de un tubo FACS con una tapa de colador y mantener el tubo en el hielo.
    3. Muestra 3 (con etiqueta CD49d): Suspenda el resto de las celdas con tampón FACS que contenga anticuerpos CD49D conjugados con PE/Cy7 (5 l para 1 x 106 celdas por 100 ml de tampón FACS) en un tubo de 15 ml e incubar en hielo durante 20 minutos.
  9. Llene los tubos con tampón FACS y centrífuga a 200 x g durante 4 min.
  10. Deseche el sobrenadante y resuspenda cada 5-10 x 106 celdas en 1 ml de tampón FACS que contenga 0,5 ug/ml de DAPI de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  11. Filtrar las células a través del tubo FACS con la tapa del colador y mantener el tubo en hielo.
  12. Prepare tubos FACS de recolección que contengan 2 ml de tampón FACS.
  13. Ordenar a través de la máquina FACS con láseres que pueden detectar DAPI y PE-Cy7 para aislar la población CD49D+.
  14. Después de ordenar, cuente las celdas ordenadas.
  15. Centrifugar todas las células ordenadas y resuspender en el día 10–14 medio esferoide a una concentración final de 0,5 x 106 células por 500 ol de medio.
  16. Placa 0.5 x 106 células por pozo en un accesorio ultrabajo 24 placas de pozo.
  17. Incubar las células a 37oC, en 5%CO2.

5. Agregación de células NC en esferoides

  1. Si no utiliza FACS para aislar las células NC y, en su lugar, agregándolas directamente en esferoides, primero prepare las celdas como se describe en los pasos 4.2–4.5.
  2. Llene el resto del tubo con 1pbS y centrífuga a 200 x g durante 4 min.
  3. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células con una cantidad apropiada de medio esferoide del día 10–14 (por ejemplo, 2 ml de medio por pozo para una placa de 6 pocillos) y cuente para determinar el número de celda.
  4. Diluir las células en el día 10–14 medio esferoide a 0.5 x 106 células por 500 s de medio.
  5. Placa de 500 l de la suspensión celular por pozo en un accesorio ultrabajo de 24 placas de pozo.
  6. Incubar las células a 37oC, en 5%CO2.

6. Mantenimiento de esferoides NC e inducción de progenitors simpáticos (día 10 a día 14, Figura 4A)

  1. Opción 1: Cultura esferoide mínima
    1. El día 11, agregue 500 ol del medio esferoide del día 10-14 a los esferoides NC sin aspirar el medio existente desde el día 10. Incubar a 37oC, en 5% CO2.
    2. En el día 12, incline la placa para acumular los esferoides NC en un lado de los pozos. Aspirar cuidadosamente y desechar tanto medio como sea posible, y alimentar con 1 ml del medio esferoide del día 10-14.
    3. Siga alimentando las células todos los días hasta el día 14.
    4. Opcional: Si los esferoides agregan y generan un grupo grande, utilice una pipeta para romper los grumos esferoides. Esto también garantiza que los esferoides individuales no se vuelvan demasiado grandes.
      NOTA: El rango de tamaño de esferoide ideal debe ser de alrededor de 100–500 m. Dentro de ese rango, el tamaño de los esferoides individuales no es crítico. Sin embargo, la morfología, como los bordes lisos y claros(Figura 3 y Figura 6)es importante para un mayor éxito. En el día 14, cada placa de 24 pozos contiene idealmente entre 50 y 60 esferoides de diferentes tamaños dentro del rango de tamaños antes mencionado.
  2. Opción 2: Cultura esferoide ampliada
    1. En el día 15, para mantener los esferoides NC, alimentar con 1,5 ml del medio esferoide del día 10-14 que contiene 0,5 m de RA. Incubar a 37oC, 5% CO2.
      NOTA: La AR debe añadirse fresca para cada alimentación y almacenarse siempre a -80 oC.
    2. A partir de ahora, alimentar cada dos días hasta el día 28 y luego continuar con el enchapado de los esferoides (sección 7.1).
      NOTA: Los esferoides en crecimiento se dividen aproximadamente 1 veces por semana clasificarlos con una pipeta de 1 ml para romperlos. Se dividen en una proporción aproximada de 1:2–1:4. Dentro del período de expansión de 2 semanas, las células deben cuadruplicar se cuadruplicar en número.

7. Diferenciación y maduración de la empresa (Opción 1: después del día 14; Opción 2: después del día 28)

  1. Esferoides de chapado en platos regulares
    1. Prepare 24 placas de pozo recubiertas con PO/LM/FM.
    2. Preparar el medio symN que contenga 0,125 m de RA (añadir fresco cada alimento) y 10 m Y27632 (solo el día 14).
    3. El día 14, incline la placa para acumular esferoides NC en un lado de los pozos. Aspirar cuidadosamente y desechar tanto medio como sea posible, y alimentar con 1 ml de medio symN.
    4. Retire el LM/FN de las placas recubiertas.
    5. Dividir y placa cada pozo de la placa de 24 pozos en 4 pozos separados de la nueva placa de 24 pozos recubiertos. Cada pozo original tendrá 1 ml, que contiene 50-60 esferoides. Esto produce 250 l, que contiene aproximadamente 10-15 esferoides para cada pocedés en la placa nueva.
    6. Añadir 250 s l de medio adicional por pozo.
      NOTA: Esta es una división de 1:4; asegúrese de que los esferoides se distribuyen correctamente dentro de la solución para que la división sea relativamente uniforme. El número de esferoides no se cuenta porque el número final no afecta al éxito de generar symNs.
    7. Incubar a 37oC, 5% CO2.
    8. El día 15 (o el día 29 para la opción 2), se alimenta reemplazando todo medio por 1 ml de medio symN que contenga 0,125 m de RA. A partir de ahora, las neuronas deben ser alimentadas cada 2 días hasta el día 20 (o el día 35 para la opción 2).
    9. Después del día 20 (o el día 35 para la opción 2), las neuronas deben ser alimentadas reemplazando cuidadosamente sólo la mitad del medio existente (500 l). A partir de ahora, alimente cada semana a menos que el medio se vuelva rápidamente amarillo.
    10. Siga la alimentación semanal hasta el punto de tiempo deseado.
      NOTA: los sinmos tienden a acumularse en estructuras similares a los ganglios y son propensos a separarse de los platos de cultivo. Para evitar esto, se recomienda la mitad de la alimentación y un manejo mínimo.
  2. Células de chapado para el registro electrofisiológico
    1. Preparar placas de electrofisiología recubiertas de PO/LM/FM 96 pozos.
    2. Preparar el medio symN que contenga 0,125 m de RA (añadir fresco cada alimento) y 10 m Y27632 (solo el día 14).
    3. En el día 14, recoger todos los esferoides, luego centrifugarlos a 200 x g durante 4 min.
    4. Deseche el sobrenadante, agregue 2 ml de solución de disociación y transfiera la mezcla a uno de los pocillos de la placa de fijación ultrabaja. Incubar a 37oC, en 5%CO2 durante 20-45 min.
      NOTA: Dependiendo del tamaño de los esferoides, el período de disociación puede ser superior a 20 min. Compruebe la disociación de la célula cada 10 minutos hasta 45 min. Opcionalmente, se pueden añadir 0,1 mg/ml de DNase con solución de disociación para evitar que el ADN libre de las células muertas haga que la solución sea pegajosa. Esto es opcional en este protocolo porque los esferoides no se agregarán una vez que se disocien por completo.
    5. Pipet para disociar completamente los esferoides, luego centrifugar a 200 x g durante 4 min.
    6. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células con la cantidad adecuada de medio symN y cuente el número de celda.
    7. Placa relinfe las células a 100.000/cm2 en pozos de electrofisiología recubiertos con PO/LM/FN en un volumen total de 200 l por poc.
    8. El día 15 (o el día 29 para la opción 2), siga los mismos procesos de alimentación que en la sección 7.1. El volumen total después del día 15 (o el día 29 para la opción 2) debe ser de 300 ml por pozo.
    9. Mida las señales eléctricas utilizando una máquina de matriz multielectrodo después del día 20 (o el día 35 para la opción 2).
      NOTA: En la opción 2, los esferoides se pueden chapar en cualquier momento entre el día 14 y el día 28. Las primeras mediciones de señales eléctricas se pueden realizar 1 semana después de enchapar los esferoides.

Resultados

En este protocolo, damos instrucciones sobre cómo generar symNs a partir de hPSCs. Las condiciones de cultivo que se han demostrado aquí se mejoraron de un protocolo publicado anteriormente23,24 (Figura 1A) a condiciones libres de alimentación y definidas químicamente(Figura 1B). Se proporcionan dos opciones, una en la que se realizan symN en un plazo de 20 días y otra en la que los CNC se pueden am...

Discusión

Recientemente publicamos dos reseñas, una discutiendo el uso de sínmNs derivados de hPSC para el modelado de enfermedades31, así como una comparación en profundidad de los protocolos de diferenciación disponibles22. Por lo tanto, aquí nos centramos en la solución de problemas del protocolo actual para ayudar al investigador interesado a tener éxito en la fabricación de symNs. Durante todo el proceso de diferenciación, con el fin de obtener datos consistentes, así...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a Heidi Ulrichs por la lectura crítica y la edición del manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishesFalcon353003
15 mL conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-664
24-well tissue culture platesFalcon353047
24-well ultra-low-attachment platesCorning07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubatorThermo Fisher/Life TechnologiesHeracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-656
6-well tissue culture platesCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibodyAbcamab108311Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibodyBD Pharmingen556604Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibodyBioLegend304313Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype)BioLegend400125Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dyeSigmaD95421:1000 dilution
Anti-DBH antibodyImmunostar22806Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibodyAbcamab13970Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibodyAbcamab50839Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibodyMabNET17-1Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibodySanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-365692Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibodyPel-FreezP40101- 150Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acidSigmaA8960-5GStock concentration: 100 mM
B27 supplementThermo Fisher/Life Technologies12587-010Stock concentration: 50x
BDNFR&D Systems248-BDStock concentration: 10 μg/mL
BMP4R&D Systems314-BPStock concentration: 6 mM
Cell counterThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Cell counting chamber slidesInvitrogenC10312
CentrifugeEppendorf57021&5424R
CHIR99021R&D Systems4423Stock concentration: 6 mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Stock concentration: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Stock concentration: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Stock concentration: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 mediumgibcoA15165-01
E8 mediumgibcoA15169-01Stock concentration: 1x
E8 supplementgibcoA15171-01Stock concentration: 50x
EDTASigmaED2SSStock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS machineBeckman CoulterCytoFLEX (for FACS)
FACS machineBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap)Falcon352235
FACS tubes (white cap)Falcon352063
Fetal bovine serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Stock concentration: 10 μg/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN)VWR/Corning47743-654Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamineThermo Fisher/Gibco25030-081Stock concentration: 200 mM
LN tankCustom Biogenic SystemsV-1500AB
MEA readerAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse laminin I (LM)R&D Systems3400-010-01Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplementThermo Fisher/Life Technologies17502-048Stock concentration: 100x
Neurobasal mediumgibco21103-049Stock concentration: 1x
NGFPeproTech450-01Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-136Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)SigmaP3655Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics)InvivoGenANTPM1Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machineBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR platesBio-Rad LaboratoriesHSP9601
recombinant FGF2R&D Systems233-FB/CFStock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acidSigmaR2625Stock concentration: 1 mM
SB431542Tocris/R&D Systems1614Stock concentration: 10 mM
Trypan blueCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bathVWR/Corning706308
Y27632R&D Systems1254Stock concentration: 10 mM

Referencias

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