JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolde, postgangliyonik sempatik nöronların insan pluripotent kök hücrelerinden üretimi için istikrarlı ve yüksek verimli bir ayırım stratejisi tanımlıyoruz. Bu model nöronlar birden fazla otonom bozuklukların çalışmalarının kullanımı için kullanılabilir hale getirecek.

Özet

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) hastalık modelleme ve in vitro insan embriyonik gelişim çalışması için güçlü bir araç haline gelmiştir. Daha önce otonom nöropatili hastalara uygulanan sempatik karakterli otonom nöronların türemesi için bir ayırım protokolü sunmuştuk. Ancak protokol Knock Out Serum Replasmanı (KSR) ve besleyici tabanlı kültür koşulları üzerine inşa edildi ve yüksek farklılaşma verimliliği sağlamak için hücre sıralamagerekliydi. Bu faktörler yüksek değişkenlik, yüksek maliyet ve düşük tekrarlanabilirlik neden olur. Ayrıca, elektriksel aktivite de dahil olmak üzere olgun sempatik özellikleri doğrulanmamıştır. Burada, PSC kültürünün ve farklılaşmasının besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşullarında gerçekleştirildiği optimize edilmiş bir protokol salıyoruz. Gövde nöral ibikini tanımlayan genetik belirteçler tanımlanır. Postgangliyonik sempatik nöronlar içine daha fazla farklılaşma hücre sıralama gerek kalmadan 20 gün sonra elde edilir. Elektrofizyolojik kayıt fonksiyonel nöron kimliğini daha da gösterir. Bizim farklılaşmış nöronlar tespit Ateş nikotin tarafından geliştirilmiş ve adrenerjik reseptör antagonist propranolol tarafından bastırılmış olabilir. Bu protokoldeki orta sempatik nöral atalar, kültürlerin genişlemesine olanak sağlayan 2 haftaya kadar nöral küresel olarak muhafaza edilebilir. Özetle, bizim güncellenmiş sempatik nöron farklılaşma protokolü yüksek farklılaşma verimliliği gösterir, daha iyi tekrarlanabilirlik, daha fazla esneklik, ve önceki sürüme göre daha iyi nöral olgunlaşma. Bu protokol otonom sinir sistemini etkileyen insan bozuklukları incelemek için gerekli hücreleri ile araştırmacılar sağlayacaktır.

Giriş

Postganglionik sempatik nöronlar (symNs) otonom sinir sistemine ait (ANS) ve yanıt ve bilinç bağımsız vücudun homeostaz düzenlenmesinde birden fazla önemli rolleri vardır. Örneğin, stres symNs uyarır ve kalp hızı, kan basıncı ve terleme bir artışa yol açan mücadele-veya-uçuş yanıtı çağrıştırıyor. SymNs genetik nedeniyle birden fazla insan bozuklukları etkilenir, toksisite / yaralanma, ya da diğer hastalıklara yardımcı olarak. Genetik nöropati nin bir örneği çocukluk çağı bozukluğu Ailesel Disotonomi (FD), symNs şiddetli bir disregülasyon disotonomik krize neden olur, terleme ile belirgin, cilt lekeleme, kusma atakları, hipertansiyon, ve anksiyete1. Toksisite bir örnek kemoterapi tedavisi, hangi otonom nöronlar üzerinde toksik yan etkileri olduğu bildirilmiştir2. Bu otonom denervasyon ve hiper-innervasyon hem yol açabilir bilinmektedir, ya da eşlik, Parkinson hastalığı veya hipertansif böbrek hastalığı gibi hastalıklar3,4. Bu nedenle, symN biyolojisi ve hastalıkları bağlamında kusurların mekanlarını araştırabilmek ve anlayabilmek, yeni ve etkili tedavilerin araştırılmasında faydalıdır.

Anatomi
Periferik sinir sistemi duyusal ve otonom bölünmeleriçine dallar. Duyusal sinir sisteminin afferent sinirler ağrı ve dokunma hissi sorumludur, ANS beyne tüm organlardan bilgi geçişi sorumludur ise. ANS enterik sinir sistemi ayrılır, gastrointestinal sistem innerve, parasempatik sinir sistemi, hangi gevşeme için önemlidir, ve sempatik sinir sistemi (SNS), hangi aktivasyon / organların düzenlenmesi için önemlidir. SNS iki nöronlu bir sistem5uyarlar. Omurilikte preganglionik sempatik nöral aksonlar ilk olarak postganglionik symN hücre organlarının bulunduğu sempatik ganglia'ya proje lenir. Bu nöronlar daha sonra vücuttaki her organın hedef dokuları innerve etmek için uzun projeksiyonlar göndermek. Preganglionik nöronlar tarafından iletilen sinyaller kolinerjiktir, postganglionik symNs adrenerjik ve böylece ekspres norepinefrin (NE) ana nörotransmitter olarak. Postgangliyonik birkaç önemli istisnalar vardır, kolinerjik sempatik nöronlar, kan damarları innerve olanlar da dahil olmak üzere. Adrenerjik postgangliyonik nöronlar tirozin hidroksilaz (TH), aromatik L-amino asit dekarboksilaz (AAAD), dopamin β-hidroksilaz (DBH) ve monoamin oksidaz (MAO-A), tüm üreten ve metabolize NE sorumlu enzimleri ifade. Ayrıca, ne geri dönüşüm taşıyıcıları ve /veya reseptörleri α-adrenerjik reseptör (ADRA2), β-adrenerjik reseptör (ADR2B), norepinefrin taşıyıcı (NET1) ve vesiküler monoamin taşıyıcı (VMAT1/2) ifade ederler.

Geliştirme
Embriyonik gelişim symNs sırasında nöral tepecik türetilmiştir (NC), hangi nöral tüp ve overlaying ektoderm arasında ortaya çıkar6, ve birden fazla hücre soyları ayırt edebilirsiniz, melanositler de dahil olmak üzere, osteoblastlar, adipositler, glia, enterik nöronlar, duyusal nöronlar, ve otonom nöronlar7. Nöral krest hücreleri (NVR) embriyo ile çeşitli yolları almak son derece göçmen hücrelerdir. NC gelişiminin bu erken aşamasında, hücreler işaretleri SNAIL1/2, FOXD3 ve SOX108,9,,10,11ifade . Benimsedikleri eksenel konumla birlikte geçiş rotası, geliştirecekleri NC alt türünü belirler. Bu NC alt tipleri kendi özel HOX gen ekspresyonu ile ayırt edilebilir: Kranial NCC'ler HOX genlerini ifade etmez, vagal NCC'ler HOX 1-5 ekspres, gövde NCCs ekspres HOX 6-9, ve sakral NCCs ekspres HOX 10-1112. Bunlar arasında, gövde NCCs symNs ana kaynağı olarak kabul edilmektedir. SymN öncüleri transkripsiyon faktörü MASH1/ASCL113ifade , PHOX2B14 ve INSM115ifade teşvik . GATA ailesi transkripsiyon faktörleri geç sempatik gelişim sırasında ifade edilir. GATA2 ve GATA3 symNs ifade edilir, hangi sırayla DBH16aktive . Transkripsiyon faktörü HAND2 de ifade ve DBH ve TH17bakım için önemlidir.

HPSCs (örneğin, embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücreler) güçlü bir araç18 gelişimsel paradigmalar özetlemek ve daha sonra çeşitli insan bozukluklarının hastalık modelleme için istihdam edilebilir symNs oluşturmak. Bu nedenle, hPSCs gelen symNs oluştururken, gelişimsel yönergeleri takip etmek ve farklılaşma süreci boyunca uygun belirteçleri ifade değerlendirmek çok önemlidir.

Önceki symN protokolü
Birkaç araştırma grupları daha önce hPSCs19,,20,,21gelen symNs nesil bildirdin. Birbirlerine bu protokollerin doğrudan karşılaştırma ve bizim son zamanlarda22gözden geçirildi . 201623yılında symN karakterli otonom nöronların üretimi için bir ayırım protokolü yayınladık (Şekil 1A). Bu protokol, hem farklılaşmamış hPSC'lerin bakımında hem de hücre farklılaşmasında kullanılan KSR tabanlı ortam kullanılmıştır. Ayrıca fare embriyonik fibroblastlarında (MEF besleyici hücreler) hPSC'ler tutuldu. Biz bozukluğu modellemek için FD hastalarından bu protokol ve PSCs istihdam23. 2019 yılında, bu eski protokol24daha ayrıntılı bir sürümünü açıkladı. Özetle, nöral kader ilk 2 gün içinde TGF-β ve BMP sinyalini engellemek için çift SMAD inhibisyonu25 ile indüklendi. CHIR99021 kullanarak WNT aktivasyonu NC hücreleri haline nöral ataları terfi etti. 11. günde hücreler, CD49D+ veya SOX10+ popülasyonlar26,23için FACS tarafından sıralandırıldı, bu da yaklaşık %40 NC üretim verimliliği elde etti. Böylece, farklılaşma sonraki adımlar için verimlilik ve saflık sağlamak için sıralama gerekli oldu. NNC'ler FGF2 ve CHIR kombine tedavisi ile küresel olarak muhafaza edildi ve güçlendirilmiş. 4 gün sonra, bakım NC spheroids kaplama ve BDNF verildi, GDNF, ve NGF symN olgunlaşma bitirmek için. Bu symN'ler ASCL1, TH, DBH ve PHOX2A gibi güçlü symN belirteçlerini ifade etse ler de, nikotinik asetilkolin reseptörünün (CHRNA3/CHRNB4) ve vezikül taşıyıcısının (VMAT1/2) ekspresyonu da dahil olmak üzere daha olgun symN'ler için belirteçler 70 günlük farklılaşmadan sonra bile düşüktü. Bu protokoldeki HOX genleri resmi olarak test edilmedi ve hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesi de dahil olmak üzere olgun nöral özellikler doğrulanmadı.

Burada, symNs oluşturmak için optimize edilmiş bir protokol salıyoruz (Şekil 1B). HPSC'ler besleyicisiz koşullarda, vitronektin (VTN) kaplamalı yemeklerde, Essential 8 (E8) media27kullanılarak muhafaza edilir. Farklılaşma ortamının formülü her aşamada değiştirilerek NC popülasyonunun yüzdesi28'dir. SymN olgunlaşma CD49D+/SOX10+ sıralanmış veya sıralanmamış toplu NCC popülasyonları üzerinde yapılabilir. Her ikisi de 30. Ayrıca, bu protokol ile oluşturulan symNs elektrofizyolojik kayıt ve symN aktivatör ve inhibitör bileşikleri ile tedavilere duyarlıdır.

Protokol

NOT: H9 PHOX2B:GFP muhabir hattı Oh ve ark.19tarafından sağlanmıştır. Bu yazıda kullanılan bazı qPCR astarları OriGene Technologies'den, birkaç sekans ise Frith ve ark. 20,30'danelde edilebilir.30

1. Bulaşık kaplama, ortam hazırlama ve hPSC bakımı için kurulum

  1. Çanak kaplama
    1. Vitronectin (VTN) kaplama
      1. VTN şişelerini 37 °C'lik bir su banyosuna tamamen eriyene kadar yerleştirin ve iyice karıştırın.
      2. 100 mm Petri kabı için 7 mL 1x fosfat tamponlu salini (PBS) ile 0,5 mg/mL VTN karıştırın, kabın vtn çözeltisini ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Bodrum membran matris kaplama
      1. Bir gecede 4 °C'de buz üzerinde bodrum membran matrisinin (Bkz. Malzeme Tablosu)çözülme şişeleri.
      2. 6 kuyuplakadan biri için 2 mL DMEM/F12'yi 20 μL 100x bodrum membran matrisiyle karıştırın, tabağa bodrum membran matris çözeltisi ekleyin, yemeği parafin filmle sarın ve bir gecede 4 °C'de temiz bir kapta saklayın. Mümkün olduğunca çabuk çalışın. Kaplamalı yemekler 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
    3. Poliornitin (PO)/laminin (LM)/fibronektin (FN) kaplama
      1. İlk gün, 24 kuyuplakasının bir kuyusu için 15 μg/mL PO ile 1 mL 1x PBS'yi karıştırın, 37 °C'de % 5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Lm ve FN'yi bir gecede -20 °C'de eritin ve tamamen çözülene kadar 4 °C'de saklayın.
      2. İkinci gün, aspire PO çözeltisi, kuyuları 1x PBS ile yıkayın, 1 mL 1x PBS 2 μg/mL LM ve 2 μg/mL FN içeren ekleyin ve %5 CO2 gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Bu noktada LM/FN çözeltisi içeren çanak, kuruması sürece aylarca kuvözde tutulabilir. Yemeğin kurumasını önlemek için daha fazla 1x PBS ekleyin.
  2. Medya hazırlığı
    1. Bir şişe E8 takviyesini bir gecede 4 °C'de eriterek Essential 8 ortamını (E8) hazırlayın. E8 orta 500 mL ve gerekirse antibiyotik ile ek karıştırın.
      NOT: Çalışma E8 çözümü 2 hafta içinde kullanılmalıdır.
    2. Toplam 100 mL hacim için 10 mL DMSO ile 90 mL tam E8 ortamı karıştırarak hPSC dondurma ortamını hazırlayın. Filtre sterilize.
    3. 10 μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 ve 10 μM Y27632 toplam 100 mL hacim için 100 mL temel 6 (E6) orta karıştırılarak günü 0'dan güne 1 farklılaştırma ortamına hazırlayın.
    4. 100 mL E6 orta sını 10 μM SB ve 0,75 μM CHIR99021 ile karıştırarak günü 2'den güne 10 farklılaştırma ortamına hazırlayın.
    5. Toplam 100 mL hacim için 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 3 μM CHIR99021 ve 10 ng/mL FGF2 ile nörobazal ortamı karıştırarak günü 10 gün 14 küresel orta ile hazırlayın.
    6. Her besleme için güne 10 gün 14 küresel orta 0.5 μM taze RA ekleyerek küresel uzun süreli bakım için gün 14 gün 28 orta hazırlayın.
      NOT: RA'yı her zaman -80 °C'de tutun.
    7. Nörobazal ortamı 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-glutamat ile karıştırarak SymN olgunlaşma ortamını hazırlayın, Toplam 100 mL hacim için 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM askorbik asit ve 0.2 mM dbcAMP. Çözelti 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Her beslemeden önce 0,125 μM taze RA ekleyin. Bu çözüm 14.(seçenek 1) veya 28.gün (seçenek 2) ile kullanılır.
    8. Toplam 100 mL hacim için gerekirse DMEM'i %2 FBS, 2 mM L-glutamat ve antibiyotiklerle karıştırarak FACS tamponu hazırlayın.
  3. hPSC bakım
    1. HPSC'lerin çözülmesi ve tutulması
      1. Bir Adet VTN kaplamalı 100 mm çanak hazırlayın.
      2. Doğrudan sıvı nitrojenden gelen bir hPSC şişesini eritmek için şişeyi 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve tüpü eriyene kadar dikkatlice suda sallayın. Çözülmüş hPSC'leri 10 mL 1x PBS içeren 15 mL'lik bir tüpe ve 4 dk için 200 x g'de santrifüje aktarın.
      3. Supernatant atın ve tüp e8 orta 1 mL ekleyin. Pipet birkaç kez tamamen pelet yeniden askıya almak ve daha sonra 10 mL toplam ulaşmak için E8 orta başka bir 9 mL ekleyin.
      4. 100 mm çanak VTN çözeltisi aspire.
      5. Hücrelerin çanakta eşit olarak dağıtıldıklarından emin olmak için hPSC'leri 100 mm'lik bir tabağa aktarın, yavaşça sallayın (yukarı-aşağı ve sol-sağ, daireler halinde değil)
      6. 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
      7. Ertesi gün, tüm orta aspire ve E8 10 mL ile yem.
      8. Önümüzdeki 3-4 gün boyunca her gün bu şekilde besleyin ve sonra ayrılmaya hazırlanın.
    2. HPSC'lerin bölünmesi
      NOT: Bölünme noktasındaki hPSC'ler %80-%90 eşzamanlı olmalıdır. Pürüzsüz ve parlak kenarları olan büyük koloniler gözlemlenmelidir. Ancak, her koloni arasındaki temastan kaçınılmalıdır(Şekil 2B, gün 0 ve Şekil 6B).
      1. Gerektiğinde VTN kaplamalı 100 mm tabakları hazırlayın.
      2. E8 aspire ve 1x PBS ile 1x bölünmesi gereken çanak yıkayın.
      3. 1x PBS aspire ve 0,25 M EDTA 4 mL ekleyin. 37 °C'de 2 dk, %5 CO2kuluçka .
        NOT: HPSC'ler küçük koloniler halinde bölünmelidir/doldurulmalıdır. Tek hücrelere ayrılmasını önlemek için EDTA ile 2 dakikadan uzun süre tedavi etmeyin. Hücreler 2 dk tedaviden sonra hala çanak yüzeyine takılmalıdır.
      4. EDTA'yı aspire edin, 10 mL E8 ortamını çanak yüzeyine güçlü bir şekilde borulandırarak kolonileri ayırın ve tüm ortam ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
      5. %80-%90 birleşmede hPSC'ler ile kolonileri 1:15-1:20'ye bölün. Örneğin, hPSC'leri 1:20'ye bölmek için 500 μL E8/hPSCs çözeltisi alın ve 9,5 mL taze E8 ortamıile karıştırın.
      6. VTN kaplamalı 100 mm tabaklarda plaka lı hPSC'ler.
        NOT: Her araştırmacı ve hücre hattı için ideal bölme oranını bağımsız olarak oluşturman tavsiye edilir.
    3. Dondurucu hPSC'ler
      1. Bölünmeye hazır 100 mm'lik bir hPSC çanak için üç kriyon ve 3,5 mL dondurucu ortam hazırlayın.
        NOT: Ortam ve şişeler kullanıma kadar 4 °C'de veya buz üzerinde tutulmalıdır.
      2. E8'i aspire edin ve 1x PBS ile 2x yıkayın.
      3. Aspire 1x PBS ve 0,25 M EDTA 4 mL ekleyin, 37 °C'de 2 dakika kuluçka, %5 CO2.
        NOT: hPSC'ler bölünecekleri anda küçük koloniler halinde dondurulmalıdır. Tek hücrelere ayrılmasını önlemek için hücreleri 2 dk'dan uzun süre EDTA ile tedavi etmeyin. Hücreler 2 dk tedaviden sonra hala çanak yüzeyine takılmalıdır.
      4. EDTA'yı aspire edin, 10 mL'lik 1x PBS'yi çanak yüzeyinde güçlü bir şekilde borulandırarak kolonileri ayırın ve 50 mL'lik bir tüpte tüm ortam ve hücreleri toplayın.
      5. Kalan EDTA'yı yıkamak için 200 x g'de 20 mL 1x PBS ve santrifüj ekleyin.
      6. Supernatant atın ve donma orta 3 mL pelet resuspend.
      7. HPSC'leri üç cryovial'a eşit olarak dağıtın, her biri 1 mL.
      8. -80 °C'de bir gecede kontrollü bir dondurucu kutuda veya strafor sandviçte saklayın ve daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen tankına aktarın.

2. Fide hPSC'ler farklılaşma (gün 0) başlatmak için

NOT: hPSC'ler stabilize edildikten sonra farklılaşmaya hazır olmalıdır (yani, çözülmeden sonra 2-3x bölünerek). Kolonilerin sağlıklı, pürüzsüz, parlak kenarlara ve minimal farklılaşmaya sahip olduğundan emin olun (Şekil 2B).

  1. Gerektiğinde 0. günden bir gün önce bodrum membran matris kaplı yemekleri (24 kuyu veya 6 kuyu yemeği) hazırlayın. Farklılaşmanın başlangıcında yemekleri RT'ye getirin.
  2. Gerektiğinde günü 0-1 farklılaştırma ortamı haline getirin.
  3. E8'i kabartmadan aspire edin, hPCS'leri bölmeye hazır olun ve yemeği 2x 1x PBS ile yıkayın.
  4. 100 mm çanak başına 0,25 M EDTA 7 mL ekleyin, 37 °C,% 5 CO2,15 dakika kuluçka.
    NOT: Bu noktada EDTA tedavisi tek hücrelere dağılmak üzere uzar.
  5. Tüm hPSC'leri (yüzer olmalılar) kapatın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın. EDTA'yı seyreltmek için EDTA çözeltisi ile aynı miktarda veya daha fazla 1x PBS ekleyin.
  6. Santrifüj 200 x g 4 dk.
  7. Supernatant atın, gün 0-1 diferansiyasyon orta ve hücreleri homojenize pipet 1 mL ekleyin. Daha fazla orta ekleyerek izleyin ve daha sonra hücreleri saymak için ideal bir konsantrasyon için hücre çözeltisi seyreltmek için karıştırın.
    NOT: Hücre çözeltisini aşırı seyreltme. Bir tam 100 mm çanak hücreleri başlamak için orta 5 mL seyreltilmiş olmalıdır.
  8. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre numarasını sayın.
  9. Hücre çözeltisini düşük son hacimde 125.000 hücre/cm2'ye ulaşmak için gerektiği gibi seyreltin (örneğin, 6 kuyuluk için kuyu başına 2 mL veya 24 kuyu luk bir yemek için kuyu başına 500 l).
    NOT: Düşük hacimli hücreler daha hızlı takılmaya yardımcı olur.
  10. Kaplanmış tabaklardan tüm bodrum membran matris çözeltisinin aspire edilmesi ve hücre çözeltisinin kuyulara sataşması.
  11. 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.

3. Nöral krest hücre indüksiyonu (gün 1-gün 10, Şekil 2A)

  1. 1. günde hücreleri 0-1 farklılaştırma ortamıyla besleyin (6 kuyu için kuyu başına 3 mL ve 24 kuyu yemeği için iyi başına 1 mL).
  2. 2. günde hücreleri 2 günlük 10 farklılaştırma ortamıyla besleyin (6 kuyu için kuyu başına 3 mL ve 24 kuyu yemeği için iyi başına 1 mL).
  3. Şu andan itibaren hücreler 10.
    NOT: 6. günden itibaren NC sırtları tespit edilmelidir (Şekil 2B). Farklılaşma nın gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol etmek için, SOX10/AP2a için lekelenebilecek ve ayırt etme zamanı boyunca marker gen ekspresyonu için kullanılan küçük kuyularda (yani 24 kuyu) paralel bir farklılaşma kültürü taşıması tavsiye edilir(Şekil 2B,C).
  4. Hücreleri sıralıyorsanız, bölüm 4'e devam edin. Aksi takdirde, bölüm 5'e devam edin.

4. Nöral krest marker CD49D için floresan aktif hücre sıralaması (FACS) ve küresel lerde NC hücrelerinin toplanması

NOT: FACS sıralama için numuneler buz üzerinde tutulmalı ve sıralamaya kadar boyandan sonra ışığa maruz kalmalıdır.

  1. Hücreler sıralanmışsa FACS arabelleği hazırlayın.
  2. Gün 10-14 küresel orta hazırlayın.
  3. 10. günde, ortayı çıkarın ve 1x PBS ile 1x yıkayın.
  4. Ayrıştırma çözeltisi (Bkz. Malzeme Tablosu)6 kuyu luk bir yemek için her kuyuda 2 mL veya 24 iyi bir yemek için kuyu başına 1 mL ve 37 °C'de %5 CO2, 20 dk için %5 CO 2'de kuluçkaya yatırın.
  5. Tüm hPSC'leri kapatın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  6. 4 dakika için 200 x g FACS tampon ve santrifüj ile tüp geri kalanını doldurun.
    NOT: Her 50 mL tüp 20 mL veya daha az hücre çözeltisi barındırabilir. FACS arabelleği hacmi, dissosiasyon çözümünün nötralize edilebilecek kadar yüksek olmalıdır.
  7. Supernatant atın, FACS arabellek uygun miktarda hücreleri yeniden askıya (~ 2 mL bir kuyu başına 6 iyi plaka) ve hücre numarasını belirlemek için saymak.
  8. Aşağıdaki örnekleri hazırlayın.
    1. Örnek 1 (lekesiz kontrol): 400 μL FACS arabelleğinde 1 x 106 hücre. Hücreleri 20 μm'lik bir süzgeç başlığından filtreleyin ve tüpü buzda tutun.
    2. Örnek 2 (DAPI sadece kontrol): 0.5 ug/mL DAPI içeren 400 μL FACS arabelleğinde 1 x 106 hücre. Hücreleri bir süzgeç kapağı olan bir FACS tüpünden süzün ve tüpü buzda tutun.
    3. Örnek 3 (CD49d etiketli): 15 mL'lik bir tüpte PE/Cy7 konjuge CD49D antikor içeren FACS arabelleği (100°L FACS tamponunda 1x 106 hücre için 5 l) içeren FACS arabelleği olan hücrelerin geri kalanını 15 mL'lik bir tüpte askıya alın ve 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  9. 4 dk için 200 x g FACS tampon ve santrifüj ile tüpler doldurun.
  10. Üreticinin talimatlarına göre 0,5 ug/mL DAPI içeren FACS tamponunun 1 mL'lik 5-10 x 106 hücresini atın ve yeniden askıya alın.
  11. Hücreleri süzgeç kapağıyla FACS tüpünden süzün ve tüpü buzda tutun.
  12. 2 mL FACS tamponu içeren toplama FACS tüpleri hazırlayın.
  13. CD49D+ popülasyonu izole etmek için DAPI ve PE-Cy7'yi algılayabilen lazerlerle FACS makinesini sıralayın.
  14. Sıralamadan sonra, sıralanan hücreleri sayın.
  15. Tüm sıralanmış hücreleri santrifüj edin ve 10-14 gün küresel orta 500 μL orta başına 0,5 x 106 hücre son konsantrasyonuna resuspend.
  16. Plaka 0.5 x 106 hücreleri ultra-düşük eki 24 iyi plakalar içine iyi başına.
  17. Hücreleri 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.

5. Küresel lerde NC hücrelerinin toplanması

  1. NC hücrelerini izole etmek için FACS kullanmıyorsanız ve bunun yerine doğrudan küresel olarak biraraya getirmiyorsanız, öncelikle 4.2-4.5 adımlarında açıklandığı gibi hücreleri hazırlayın.
  2. Tüpün geri kalanını 1x PBS ile doldurun ve 4 dk için 200 x g'de santrifüj.
  3. Supernatant atın, gün 10-14 küresel orta uygun bir miktar hücreleri yeniden askıya (örneğin, 6 kuyu plaka için iyi başına orta ~ 2 mL) ve hücre numarasını belirlemek için saymak.
  4. 10-14 küresel orta gün içinde hücreleri seyreltin 0.5 x 106 hücre 500 μL orta başına.
  5. Ultra düşük eki 24 kuyu plakasında kuyu başına hücre süspansiyonunun 500 μL plakası.
  6. Hücreleri 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.

6. NC küresel bakım ve sempatik progenitor indüksiyon (gün 10 gün 14, Şekil 4A)

  1. Seçenek 1: Minimal küresel kültür
    1. 11. günde, NC küresel spheroidlerine 10.günden itibaren mevcut ortamı sindirmeden 500 μL gün 10-14 küresel orta ekleyin. 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
    2. 12. günde, kuyuların bir tarafında NC küreselleri biriktirmek için plakayı yatırın. Dikkatle aspire ve mümkün olduğunca çok orta atın ve gün 10-14 küresel orta 1 mL ile yem.
    3. 14. güne kadar hücreleri her gün beslemeye devam edin.
    4. İsteğe bağlı: Eğer küresel ler toplanır ve büyük bir küme oluştururlarsa, küresel kümeleri kırmak için bir pipet kullanın. Bu aynı zamanda bireysel küresellerin çok büyük alamadım sağlar.
      NOT: İdeal küresel boyut aralığı 100-500 μm civarında olmalıdır. Bu aralıkta, bireysel küresellerin boyutu kritik değildir. Ancak, morfoloji, pürüzsüz ve net kenarları gibi(Şekil 3 ve Şekil 6)daha fazla başarı için önemlidir. Gün 14, her 24 iyi plaka ideal yukarıda belirtilen boyut aralığı içinde farklı boyutlarda yaklaşık 50-60 sferoidler içerir.
  2. Seçenek 2: Genişletilmiş küresel kültür
    1. 15. günde, NC küreseloidleri tutmak için, 0,5 μM RA içeren 10-14 küresel ortam 1.5 mL ile beslenir. 37 °C,% 5 CO2inkübat.
      NOT: RA her besleme için taze eklenmeli ve her zaman -80 °C'de saklanmalıdır.
    2. Şu andan itibaren, 28.
      NOT: Büyüyen küreseloidler, 1 mL'lik pipetle boruile parçalayarak haftada yaklaşık 1 x bölünürler. Yaklaşık 1:2-1:4 oranında bölünürler. 2 haftalık genişleme süresi içinde, hücrelerin kabaca sayı olarak dört katına çıkmalıdır.

7. SymN farklılaşma ve olgunlaşma (Seçenek 1: gün 14 sonra; Seçenek 2: 28. günden sonra)

  1. Düzenli yemeklerde spheroidlerin kaplaması
    1. PO/LM/FM kaplamalı 24 kuyu plakası hazırlayın.
    2. 0,125 μM RA (her beslemeyi taze ekleyin) ve 10 μM Y27632 (sadece 14. gün) içeren symN ortamı hazırlayın.
    3. 14. günde, kuyuların bir tarafında NC küreselleri birikmesi için plakayı yatırın. Dikkatle aspire ve mümkün olduğunca çok orta atın ve symN orta 1 mL ile yem.
    4. LM/FN'yi kaplamalı plakalardan çıkarın.
    5. 24 kuyu plakasından her kuyuyu yeni, kaplamalı 24 kuyunun 4 ayrı kuyuya ayırın ve plakalayın. Her orijinal kuyu ~ 50-60 spheroids içeren 1 mL olacaktır. Bu verim 250 μL, yeni plaka her kuyu için yaklaşık 10-15 küresel içeren.
    6. Kuyu başına 250 μL ek ortam ekleyin.
      NOT: Bu 1:4 bir bölünme; bölme nispeten eşit olacak şekilde küresellerin çözelti içinde düzgün bir şekilde dağıtıldıklarından emin olun. Son sayı symNoluşturma başarısını etkilemediği için küresel lerin sayısı sayılmaz.
    7. 37 °C,% 5 CO2inkübat.
    8. 15. günde (veya seçenek 2 için 29. gün) tüm ortamları 0,125 μM RA içeren 1 mL symN ortamı ile değiştirerek besleyin. Şu andan itibaren, nöronlar gün 20 (veya seçenek 2 için gün 35) kadar her 2 günde bir beslenmelidir.
    9. 20. günden sonra (veya seçenek 2 için 35. günden sonra), nöronlar mevcut ortamın sadece yarısı (500 μL) dikkatle değiştirilerek beslenmelidir. Şu andan itibaren, ortam hızla sarıya dönüşmedikçe her hafta beslenin.
    10. İstenilen zaman noktasına kadar haftalık beslemeye devam edin.
      NOT: symNs ganglia benzeri yapılarda toplam eğilimindedir ve kültür yemekleri ayırmak için eğilimli. Bunu önlemek için, yarı beslemeve minimum işleme önerilir.
  2. Elektrofizyolojik kayıt için kaplama hücreleri
    1. PO/LM/FM kaplamalı 96 kuyu elektrofizyoloji plakası hazırlayın.
    2. 0,125 μM RA (her beslemeyi taze ekleyin) ve 10 μM Y27632 (sadece 14. gün) içeren symN ortamı hazırlayın.
    3. 14. günde, tüm küresel leri toplayın, sonra 4 dk için 200 x g'de santrifüj edin.
    4. Supernatant atın, dissosilasyon çözeltisi 2 mL ekleyin ve ultra düşük eki plaka kuyularından birine geri karışımı aktarın. 37 °C'de, %5 CO2'de 20-45 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Küresellerin boyutuna bağlı olarak, ayrışma süresi 20 dk'dan uzun olabilir. Hücrenin ayrışma süresini kontrol edin her 10 dakikada bir 45 dk. İsteğe bağlı olarak, 0,1 mg/mL DNase ayrıştırma solüsyonu ile eklenebilir ve çözeltiyi yapış hale getiren ölü hücrelerden serbest DNA'yı önleyin. Bu protokolde isteğe bağlıdır, çünkü küreseller tamamen ayrıştırıklarında bir araya gelmezler.
    5. Pipet tamamen spheroids ayrıştırmak için, sonra 4 dakika için 200 x g santrifüj.
    6. Supernatant atın, symN orta uygun miktarda hücreleri yeniden askıya ve hücre numarasını saymak.
    7. Hücreleri 100.000/cm2'de PO/LM/FN kaplı elektrofizyoloji kuyularında kuyu başına 200°L toplam hacimde kaplayın.
    8. 15. günde (veya seçenek 2 için 29. gün) bölüm 7.1'deki yle aynı besleme işlemlerini takip edin. 15. günden sonraki toplam hacim (veya seçenek 2 için 29. gün) kuyu başına 300 μL olmalıdır.
    9. Elektrik sinyallerini 20.
      NOT: Seçenek 2'de, spheroidler 14 gün 28 gün arasında her zaman kaplanabilir. İlk elektrik sinyalleri ölçümleri küresel lerin kaplamadan 1 hafta sonra yapılabilir.

Sonuçlar

Bu protokolde, hPSC'lerden symN'lerin nasıl üretilenlere ilişkin talimatlar veriyoruz. Burada gösterilen kültür koşulları daha önce yayınlanmış bir protokol23,24 (Şekil 1A)ile besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış koşullara(Şekil 1B)iyileştirilmiştir. İki seçenek sağlanır, biri 20 gün içinde symN'lerin yapıldığı, diğeri ise Daha sonra symN'lere ayrıştırılabilen da...

Tartışmalar

Geçenlerde iki değerlendirme yayınladı, bir hastalık modelleme için hPSC kaynaklı symNs kullanımını tartışırken31 yanı sıra mevcut farklılaşma protokolleri derinlemesine bir karşılaştırma22. Bu nedenle, burada ilgili araştırmacı symNs yapmada başarılı yardımcı olmak için mevcut protokol sorun giderme üzerinde duruluyor. Tüm farklılaşma sürecinde, sağlıklı farklılaşmış hücrelerin yanı sıra tutarlı veri elde etmek için, her aşam...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Heidi Ulrichs'e makalenin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishesFalcon353003
15 mL conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-664
24-well tissue culture platesFalcon353047
24-well ultra-low-attachment platesCorning07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubatorThermo Fisher/Life TechnologiesHeracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-656
6-well tissue culture platesCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibodyAbcamab108311Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibodyBD Pharmingen556604Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibodyBioLegend304313Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype)BioLegend400125Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dyeSigmaD95421:1000 dilution
Anti-DBH antibodyImmunostar22806Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibodyAbcamab13970Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibodyAbcamab50839Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibodyMabNET17-1Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibodySanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-365692Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibodyPel-FreezP40101- 150Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acidSigmaA8960-5GStock concentration: 100 mM
B27 supplementThermo Fisher/Life Technologies12587-010Stock concentration: 50x
BDNFR&D Systems248-BDStock concentration: 10 μg/mL
BMP4R&D Systems314-BPStock concentration: 6 mM
Cell counterThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Cell counting chamber slidesInvitrogenC10312
CentrifugeEppendorf57021&5424R
CHIR99021R&D Systems4423Stock concentration: 6 mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Stock concentration: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Stock concentration: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Stock concentration: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 mediumgibcoA15165-01
E8 mediumgibcoA15169-01Stock concentration: 1x
E8 supplementgibcoA15171-01Stock concentration: 50x
EDTASigmaED2SSStock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS machineBeckman CoulterCytoFLEX (for FACS)
FACS machineBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap)Falcon352235
FACS tubes (white cap)Falcon352063
Fetal bovine serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Stock concentration: 10 μg/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN)VWR/Corning47743-654Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamineThermo Fisher/Gibco25030-081Stock concentration: 200 mM
LN tankCustom Biogenic SystemsV-1500AB
MEA readerAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse laminin I (LM)R&D Systems3400-010-01Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplementThermo Fisher/Life Technologies17502-048Stock concentration: 100x
Neurobasal mediumgibco21103-049Stock concentration: 1x
NGFPeproTech450-01Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-136Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)SigmaP3655Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics)InvivoGenANTPM1Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machineBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR platesBio-Rad LaboratoriesHSP9601
recombinant FGF2R&D Systems233-FB/CFStock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acidSigmaR2625Stock concentration: 1 mM
SB431542Tocris/R&D Systems1614Stock concentration: 10 mM
Trypan blueCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bathVWR/Corning706308
Y27632R&D Systems1254Stock concentration: 10 mM

Referanslar

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imbiyolojisiSay 159insan pluripotent k k h crelerin ral ibiksempatik n ronlarotonom sinir sistemisempatik sinir sistemibesleyicisizkimyasal olarak tan mlanm k k h cre k lt r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır