用于活、完整组织中细胞分部分析的果蝇拉瓦尔和普帕尔睾试验的制备

摘要

该协议的目的是使用果蝇美细胞精细胞，通过活细胞和固定细胞显微镜分析完整组织中细胞分裂。该协议演示了如何从果蝇幼虫和早期幼虫中分离出完整、完整的睾口，以及如何处理和安装它们进行显微镜检查。

摘要

实验性分析活细胞、完整组织和器官中的分裂，对于我们理解细胞分裂如何与发育、组织平衡和疾病过程结合至关重要。接受梅氏病的果蝇精子细胞是这种分析的理想选择，因为 （1） 含有精子细胞的整个果蝇睾比相对容易准备显微镜，（2） 精子细胞的体积大使它们非常适合高分辨率成像，（3） 强大的果蝇遗传工具可与体内分析相结合。在这里，我们提出了一个易于访问的协议，用于制备来自果蝇的第三颗幼虫和早期幼虫的整个睾试验。我们描述了如何识别制备的整个睾底中的微细胞，以及如何通过延时显微镜来描绘它们的生活。还提供了固定和免疫染色整个睾试验的协议。与使用成人睾测试进行精子细胞分析的现有协议，幼虫睾试验的使用有几个优点。最重要的是，幼虫睾比比成人睾比更小，对细胞的挤拥程度更低，这极大地方便了精子细胞的高分辨率成像。为了证明这些优点和协议的应用，我们展示了在通过延时共聚焦显微镜成像的单一精子细胞中，在细胞分裂过程中，内质视网膜在主轴微管的再分配。协议可以结合表达任意数量的荧光标记蛋白或细胞标记，以及基因突变和其他遗传工具，使这种方法特别强大，分析细胞分裂机制在整个组织和器官的生理背景下。

引言

细胞分裂通常^{使用培养1}中生长的细胞系进行研究。虽然我们从这些研究中获得了丰富的宝贵见解和理解基本机制^2，但培养中生长的细胞不能完全概括细胞分裂的生理，因为它发生在完好的活组织中。例如，在完好的组织和器官中，细胞必须在正确的地点和正确的时间进行分裂，以便后代细胞正确位于组织内，以便它们能够进行适当的分化或功能程序，使细胞增殖与组织生长或平衡³适当协调。另一方面，对于在培养中生长的细胞，细胞分裂一般受培养媒介⁴的生长因子调节，因此我们不能从这些细胞中学习体内环境因素，如组织结构或发育信号如何影响分裂过程。还必须注意，许多用于研究细胞分裂的细胞系，如HeLa和U2OS细胞，都来自转移性肿瘤^5。因此，与健康细胞相比，这些癌细胞的基本生理的许多方面，如细胞周期调节机制和染色体稳定性，都可能发生变化。因此，对细胞分裂生理学的完全理解取决于我们研究其原生体内的分裂细胞的能力，这些环境中保存了生理调节机制和组织结构。

理解细胞分裂如何在完好的组织和器官内运作的进展受到体内或外体分析所固有的困难的阻碍。首先，在大型器官或厚组织中，很难或不可能进入分裂细胞进行微观分析。其次，通常很难预测单个细胞何时在体内分裂。第三，组织生理学在外活体培养过程中可能迅速恶化。在此协议中，我们描述了在完全完好的睾口中接受微粒细胞分裂时，对果蝇黑色无粒细胞进行活和固定分析的易访问方法。这些细胞是活的、活的、活的分析的理想选择，因为它们很容易通过标准光学方法（如共聚焦显微镜）访问，它们在可预测的时间和地点进行分裂，并且完整的睾试验可在体内培养下保持长达 24 小时。此外，果蝇精子细胞是大圆形细胞（直径约20~30μm），在分裂时不会改变形状，因此非常适合对细胞组分（如主轴装置和细胞质细胞器）进行高分辨率、延时成像。虽然这些细胞经历梅氏病，而不是线虫病，许多必要的细胞分裂过程是非常相似的这两个细胞分裂机制^6。这些优势，加上强大的果蝇遗传工具，使果蝇精子细胞成为一个广泛使用的模型，用于对基本细胞分裂过程进行前活体分析，包括主轴形成和调节、细胞激酶和细胞机重塑和分区^{7、8、9、10、11。8,9,10,117}

精子细胞是处于精子成形阶段的细胞。在果蝇，精子生成开始于一组生殖系干细胞，位于一个小区域或"枢纽"在睾比^12，13,13的一个极点。这些细胞被不对称的线粒体分裂，产生一个单一的分化精子。然后，精子经过四个同步线粒体，产生一组16个细胞，在单个囊肿内保持密切关联。在这个阶段，细胞从线粒体过渡到半胱细胞循环，被称为精子细胞。精子细胞在细胞周期的G2延长阶段花费大约两到三天，在此期间，它们急剧生长，并经历细胞学变化，为两个间皮分裂和随后的精子发生^13，14,14做准备。在单个囊肿内，整个16个精子细胞组，然后同时进入第一个囊肿。因此，在细胞分裂中可以同时成像几种美细胞。第一次美粒分进行约1.5小时，几乎立即跟随第二个美粒分，产生64个总精子，继续分化成成熟的精子。

使用精子细胞研究活的、完整组织的细胞分裂的一个独特优点是，细胞的组或囊肿在精子成世的不同阶段不断进步，精子成世各个阶段的细胞通常可以在任何给定的睾瘤中识别（见图3A）。因此，在整个睾试验中相对容易找到碘细胞。我们通常将分析重点放在第一个而不是第二个美病上，因为这些细胞更大，更容易接受高分辨率成像，但包含两个网格分裂的整个过程可以成功成像。还应注意的是，睾精制剂和培养的一般协议也可用于分析精子生成的其他过程，例如早期的线粒体干细胞或精子分裂，或当精子成熟成精子¹⁵时发生的细胞学变化。精子成世的许多方面在果蝇和人类^之间高度保存。

果蝇精子细胞开始达到精子成形的膜阶段，在果蝇发育的第三个星幼虫阶段^13。因此，从生命周期阶段分离的睾试验从第三颗星幼虫开始，包括幼虫和成人可用于分析精子细胞的分裂。一些优秀的协议可用于从成年雄性苍蝇中提取睾子，用于活和固定分析精子生成17，18，19。^17,18,19这些协议对于研究精子成世的晚期或必须使用仅在成人中可见的遗传标记可能更可取。该协议侧重于幼虫和早期普帕的睾制剂，因为这些阶段的睾试验具有几个优点，这些优点与高分辨率延时显微镜的细胞分裂分析特别相关。首先，幼虫和幼虫的睾比成人小，器官内的细胞不那么拥挤。因此，分裂精子细胞通常可以在幼虫睾试验的外表面附近成像，而不必穿透多层光散射组织。其次，成人睾试验由于附加的附属器官收缩而有节奏地移动，这些运动使单个细胞的延时成像具有挑战性。第三，幼虫睾试验在研究导致阴极或成人致命性的基因突变时是有利的。我们的方法针对显微镜阶段睾试验的长期培养进行了优化，允许在同一制备中通过精子成能的多个阶段对多轮细胞分裂或单个细胞的进展进行成像。我们还描述了一种用于固定和免疫染色整个睾试验的协议。总体而言，我们的协议对于有兴趣研究完整组织中细胞分裂的人特别有用，能够将精子细胞分析与高可处理的果蝇遗传工具相结合，使得这种方法特别有力。

研究方案

1. 准备动物、工具和介质进行解剖

1. 交叉雄性苍蝇和雌性苍蝇，以获得所需的基因型的后代。用于鉴定和分期的转基因标记包括GFP-tubulin标记的美质主轴和RFP-组音2A来标记染色体^8。每十字架使用5至10只雌性，并在25°C的培养箱中保持标准飞食上的十字架，直到第三只小幼虫开始爬起小瓶的两侧（4~5天）。早白的小狗将在一天后开始形成。
2. 获得两对带细尖的直钳。确保提示是尖锐的，即使在长度和直线 （图 1A）。仅将这些钳子用于解剖，不使用时用 10 μL 移液器提示盖住。
3. 准备手术刀工具。
   1. 将黑色阳极氧化钢昆虫销的钝端插入销架中，然后拧开支架的螺钉，将销固定到位。使用一对钳子，在解剖显微镜下，抓住中间的昆虫针，弯曲它形成135°的内部角度（图1B）。锋利的末端用于切割组织，而边缘用于在介质滴之间转移睾试验。
   2. 不使用时，用 1，000 μL 移液器尖端盖住。
4. 在组织培养罩中工作，准备施耐德介质的5 mL等位，并在4°C储存，直到使用时间。当准备开始解剖时，将一个 5 mL 介质等位温度加热到室温。然后将加热的解剖介质转移到 10 mL 注射器上，并连接 0.22 μm 注射器过滤器。

2. 从拉瓦和早期普帕的睾试验的解剖

1. 使用充满介质的滤芯在玻璃幻灯片的顶部、中间和底部排出三滴介质（每滴 50 μL）。
2. 使用解剖探针将五到十分之三的幼虫或早期幼虫（仍然是白色或黄色的幼虫）转移到顶部掉落。用解剖探头在介质中轻轻搅拌幼虫和幼虫，以去除任何食物或碎片。
3. 在解剖显微镜下，用解剖探针将单个幼虫或幼虫侧转动，以识别两个双边睾试验（如果存在），它们作为椭圆形的半透明结构出现在身体后三分之一（图2A，B）。缺乏睾试验的动物是雌性的，应该丢弃。
4. 当发现雄性幼虫或幼虫时，将其移到介质的第二滴。重复，直到3或4雄性幼虫和/或幼虫被转移到第二滴介质。
5. 在第二滴媒体工作，抓住一只雄性幼虫或小狗与一对钳子在其中区，只是前睾。使用第二对钳子轻轻地将动物撕成两半。
6. 用一对钳子将幼虫或小狗的后端放在玻璃滑道上。从钳子旁边开始，使用手术刀工具的边缘向下推刀，并将手术刀朝动物的切割端移动。这将排出动物的内部器官，包括肠道、脂肪体和睾口。
7. 轻轻地将睾试验与其余器官分开。睾试验是清晰，椭圆形的器官嵌入脂肪身体的丝带（图2C）。
8. 将测试一次传输到介质的第三个下降。为此，将手术刀的边缘插入脂肪体下方，将组织从介质中取出，然后快速将其移动到第三滴。
9. 或者，如果睾试验物上还没有足够的脂肪体来成功提升组织，则使用用解剖介质预先浸湿的玻璃巴斯德移液器轻轻转移组织。
10. 使用手术刀工具的锋利端轻轻地切掉多余的脂肪体从睾牛，只留下一个小边缘的脂肪身体的边缘边缘（图2C）。没有必要去除所有的脂肪身体，并试图这样做可能会导致睾试验的损坏或破裂。
11. 对玻璃幻灯片上的所有雄性幼虫重复上述步骤。
12. 继续执行步骤 3 或步骤 5。

3. 用于实时显微成像的安装测试

注:这个安装程序是从最近公布的德罗索虫幼虫脑神经爆炸成像²⁰的治疗方案改编的。其他详细信息请参阅此参考。

1. 使用滤芯注射器将一滴施耐德的介质（约 30 μL）沉积到 50 mm 透气培养盘的中心。
2. 使用预湿的巴斯德移液器将准备好的睾试验转移到透气盘上的滴。睾试验通常浮动到跌落的表面。
3. 使用手术刀工具轻轻地将睾牛向下推到透气膜上。小心不要用手术刀的尖点使透气膜破裂。将所有睾测试推到跌落的中心。
4. 使用充满卤化碳油的1 mL注射器在气体渗透膜上制造四滴油，每滴约30μL。在包含睾试验的介质滴周围放置油滴，以对应于 22 mm 玻璃盖玻片的四个角。
5. 将 22 mm 玻璃盖玻片的角与四滴卤化碳油排列，并轻轻地将盖玻片降到介质和油上。让盖玻片沉淀，并使包含睾试验的介质在油滴之间扩散。
6. 拆下多余的介质，使盖玻片沉降到测试物表面。在解剖显微镜下观察睾试验时，将精细任务的角落擦拭到盖玻片下的介质中，以吸走少量液体。威克远离足够的介质，直到玻璃盖玻片只是接触最大的睾测试的表面。至关重要的是，不要去除过多的介质，并降低盖玻片太远，因为这将对睾试验施加压力，并导致它们破裂（参见图5）。

4. 碘精细胞的活成像

注:可以使用激光扫描或旋转圆盘共聚焦显微镜对精子细胞进行成像。系统必须有足够的速度和灵敏度，以避免荧光蛋白的光漂白或组织的光损伤。

1. 在睾口正上方的玻璃盖玻片上放置一滴浸入式油。翻转盘子，并将其放在显微镜舞台上，将显微镜目标（40 倍或 60 倍）移入油中，直到其刚低于睾试验。使用传输的光查找单个睾比，并将其集中。
2. 使用共聚焦捕获快速图像时，将睾测试围绕四处移动以检查单元格的组织。睾试验的一端将有许多小的，密集包装的细胞。这一端含有生殖系干细胞和精子。向器官的另一端移动，识别逐渐被组织成离散簇或囊肿的逐渐较大的细胞。这些大细胞是精子细胞（图3A）。
3. 如果成像GFP-tubulin，通过位于细胞皮层的两个明亮的微管组（即中心细胞）的存在，识别在30-60分钟内开始梅氏症的精子细胞（图3B，C）。
4. 一旦确定了囊性精细胞的囊肿，就设置采集参数以捕获随时间推回的图像堆栈。通常，在 z 维数中间隔 1.5 μm 的 15-20 个图像足以捕获同一囊肿内多个精子细胞的全部体积。
5. 如果对整个第一个除法进行成像，则每 2 分钟获取一次完整的 z 堆栈，大约需要 1.5 小时。可以使用更快的采集速率，特别是如果只分析特定的梅氏症事件。但是，请注意不要因样品反复暴露于激光激发而造成光漂白或光损伤。
6. 使用连续的自动对焦控制系统，防止焦距在采集的漫长过程中漂移。假定室温约为22~23°C，因此通常不需要在显微镜阶段对样品进行温度控制。如果温度控制可用，在显微镜阶段将样品保持在 25°C。
7. 如果找不到微离子精细胞，将样品储存数小时或过夜，再储存在25°C培养箱中并成像。

5. 固定和免疫染色

1. 从上一步2.10开始，使用玻璃巴斯德移液器将睾口转移到9井玻璃解剖盘中的井中，在PBSTx中含有0.5 mL的8%甲醛（磷酸盐缓冲盐水，0.3%Triton X-100）。确保睾菜放在盘子底部。
   注:甲醛是有毒的，应在烟头用手套处理。
2. 在室温下将睾试验固定 20 分钟。
3. 将睾口转移到含有 0.5 mL PBSTx 的井中，用温和的搅拌洗涤 5 分钟。再用新鲜PBSTx在新井中重复洗涤步骤两次。
4. 在含有5%牛血清白蛋白（BSA）的0.5mL PBSTx中稀释原抗体至所需浓度，在1.5mL微离心管中。将测试从9口玻璃解剖盘转移到稀释的原抗体管，并在4°C下用温和的摇动或坚果孵育过夜。
5. 在9口玻璃解剖盘的井中用0.5 mL的PBSTx清洗睾试验5分钟。再用新鲜PBSTx重复洗涤步骤两次。
6. 在含有5%BSA的250μL的PBSTx中稀释继发抗体，并分配成9口玻璃解剖盘的清洁井。如果需要，添加 DAPI 来染色 DNA。将睾试验转移到含有二次抗体的井中，用塑料包装盖住，在黑暗中用温和的搅拌孵育4小时。
7. 将睾口转移到充满 0.5 mL PBSTx 的干净井中，用新鲜的 PBSTx 两次清洗 5 分钟，第三次 30 分钟。

6. 安装固定测试

1. 使用巴斯德移液器将睾测试从上次洗涤转移到玻璃显微镜幻灯片上。如有必要，使用手术刀工具的边缘将睾牛向下推到幻灯片表面。
2. 使用精细任务擦拭的角落，从睾试验中清除多余的液体。去除尽可能多的液体。
3. 在睾试验中应用 30×50 μL 显微镜安装介质。
4. 将 22 mm 盖玻片放在安装介质的跌落上，让盖玻片沉淀，使安装介质在盖玻片下扩散。如有必要，对盖玻片施加轻压，以挤出多余的安装介质，让盖玻片停留在测试物表面。
5. 使用指甲油密封盖玻片的边缘。

结果

成功执行此协议后，通过共聚焦显微镜或其他荧光显微镜方法进行成像的睾口将完全完好无损。如图3A所示，睾牛的细胞组织得以保存，细胞分化从睾酮的一端到另一端（包括精子、精子细胞和单倍体精子）的进展是可见的。GFP-tubulin是识别精细胞分裂和细胞通过梅氏肿的活体成像的有用标记。如图3B所示，关于开始梅氏病的精子细胞可以通过他们的两?...

讨论

我们已经描述了一种用于制备幼虫或早期果蝇睾试验的协议，该测试针对精子细胞细胞分裂的长期活成像进行了优化。这是分析完整组织生理语境中细胞分裂的有力方法。当与果蝇遗传工具结合使用时，这种方法的力量会进一步扩大，例如特定的基因突变、组织特异性RNAi介导的抑制以及荧光标记的蛋白质和细胞标记物。此外，幼虫和脓器睾试验体积小，以及成像离玻璃罩滑非常近的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium