Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Özet

Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.

Özet

Hücre bölünmesinin canlı, bozulmamış doku ve organlarda bölünmesi, hücre bölünmesinin gelişim, doku homeostazları ve hastalık süreçleri ile nasıl bütünleşiştüğünün anlaşılması için deneysel analizler gereklidir. (1) spermatosit içeren tüm Drosophila testisleri nispeten mikroskopi için hazırlamak kolay, çünkü meyozis geçiren Drosophila spermatositler bu analiz için idealdir, (2) spermatositlerin büyük boyutu onları iyi yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun hale getirir, ve (3) güçlü Drosophila genetik araçları in vivo analizi ile entegre edilebilir. Burada, Drosophila üçüncü instar larvaları ve erken pupa tüm testislerin hazırlanması için kolayca erişilebilir bir protokol sıyoruz. Hazırlanan tüm testislerde meyotik spermatositlerin nasıl tanımlanabileceğimizi ve zaman atlamalı mikroskopi ile nasıl görüntülenebileceğimizi anlatıyoruz. Fiksasyon ve immünboyama tüm testisler için protokoller de sağlanmaktadır. Larva testislerinin kullanımı, spermatosit analizi nde yetişkin testislerini kullanan mevcut protokollere göre çeşitli avantajlara sahiptir. En önemlisi, larva testisleri erişkin testislere göre hücrelerle daha küçük ve daha az kalabalıktır ve bu spermatositlerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesini büyük ölçüde kolaylaştırır. Bu avantajları ve protokollerin uygulamalarını göstermek için, zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile görüntülenmiş tek bir spermatositte hücre bölünmesi sırasında iğ mikrotübüllerine göre endoplazmik retikulumun yeniden dağılımını gösteren sonuçlar sayılmaktadır. Protokoller floresan etiketli proteinler veya organel belirteçleri herhangi bir sayı ifadesi ile kombine edilebilir, yanı sıra gen mutasyonları ve diğer genetik araçlar, bu yaklaşım özellikle tüm doku ve organların fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi mekanizmalarının analizi için güçlü hale.

Giriş

Hücre bölünmesi genellikle kültür¹yetiştirilen hücre hatları kullanılarak incelenir. Biz bu çalışmalardan temel mekanizmaların paha biçilmez bir anlayış ve anlayış zenginliği kazanmış olsa da², kültürde yetiştirilen hücreler tam olarak bozulmamış, canlı doku oluşur gibi hücre bölünmesi fizyolojisi özetlemek olamaz. Örneğin, bozulmamış doku ve organlarda, hücreler doğru yerde ve doğru zamanda bölmek gerekir, böylece döl hücreleri düzgün doku içinde yer, böylece uygun farklılaşma veya fonksiyonel programlar geçirebilir, ve böylece hücre çoğalması düzgün doku büyüme veya homeostaz ile koordine edilir³. Öte yandan kültürde yetişen hücreler için hücre bölünmesi genellikle kültür ortamı^4'tekibüyüme faktörleri tarafından düzenlenir ve bu nedenle doku mimarisi veya gelişimsel sinyalizasyon gibi canlı çevresel faktörlerin bölünme sürecini nasıl etkilediğini bu hücrelerden öğrenemeyiz. HeLa ve U2OS hücreleri gibi hücre bölünmesini incelemek için kullanılan hücre hatlarının birçoğunun metastatik tümörlerden elde edildiğini belirtmek de önemlidir⁵. Bu nedenle, bu kanser hücrelerinin temel fizyolojisi birçok yönü, hücre döngüsü düzenleyici mekanizmalar ve kromozomal stabilite gibi, büyük olasılıkla sağlıklı hücrelere göre değiştirilmiştir. Hücre bölünmesi fizyolojisinin tam olarak anlaşılması, bu nedenle, fizyolojik düzenleyici mekanizmaları ve doku mimarisini koruyan, yerli, in vivo ortamlarda bölen hücreleri inceleme yeteneğimize bağlıdır.

Hücre bölünmesinin bozulmamış doku ve organlar da nasıl işlediğini anlamadaki gelişmeler, in vivo veya ex vivo analizine doğal zorluklar nedeniyle engellenir. İlk olarak, büyük organlar veya kalın dokular içinde mikroskobik analiz için bölen hücrelere erişmek zor veya imkansız olabilir. İkinci olarak, genellikle tek tek hücrelerin in vivo bölmek ne zaman tahmin etmek zordur. Üçüncü olarak, doku fizyolojisi hızla ex vivo kültür sırasında bozulabilir. Bu protokolde, Drosophila melanogaster spermatositlerin tam bozulmamış testisler içinde meyotik hücre bölünmeleri geçirerek canlı ve sabit analizi için kolayca erişilebilir yöntemleri açıklıyoruz. Bu hücreler canlı, ex vivo analiz için idealdir çünkü konfokal mikroskopi gibi standart optik yöntemlerle kolayca erişilebilirler, öngörülebilir zamanlarda ve konumlarda bölünürler ve bozulmamış testisler ex vivo kültüründe yaklaşık 24 saate kadar muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, Drosophila spermatositler büyük yuvarlak hücrelerdir (yaklaşık 20-30 μm çapında) bölündüklerinde şekil değiştirmeyen, onları yüksek çözünürlükte, mil aparatı ve sitoplazmik organeller gibi hücresel bileşenlerin hızlandırılmış görüntülemesi için ideal hale getirir. Bu hücreler mitoz yerine meyozis geçmesine rağmen, temel hücre bölünmesi süreçlerinin çoğu bu iki hücre bölünmesi mekanizmaları arasında çok benzer⁶. Bu avantajlar, güçlü Drosophila genetik araçları ile birlikte, Drosophila spermatositler mil oluşumu ve düzenleme, sitokinenzis ve organel remodeling ve bölümleme⁷dahil olmak üzere temel hücre bölünmesi süreçlerinin ex vivo analizi için yaygın olarak kullanılan bir model yaptık^{7 ,8,9,10,11}.

Spermatositler spermatogenezin meyotik evresinde olan hücrelerdir. Drosophilayılında, spermatogenez testis bir kutup küçük bir bölgede veya "hub" bulunan germline kök hücrelerin bir grup ile başlar^12,13. Bu hücreler asimetrik bir mitoz bölünme, tek bir farklılaştırılmış spermatogonium yol açan. Spermatogonia sonra tek bir kist içinde yakından ilişkili kalır 16 hücrebir grup üretmek için dört senkron mitoz geçmesi. Bu aşamada hücreler mitotikten meyotik hücre döngüsüne geçiş tevesyetik olarak adlandırılırlar. Spermatositler hücre döngüsünün genişletilmiş bir G2 aşamasında yaklaşık iki ila üç gün geçirmek, sırasında onlar dramatik büyümek ve iki meiyotik bölünmeler ve sonraki spermiyogenez için hazırlık sitolojik değişikliklere uğrar^13,14. Tek bir kist içinde 16 spermatosit tüm grup daha sonra aynı anda ilk meyotik bölünme girin. Böylece, birkaç meyotik spermatosit hücre bölünmesi ile devam ederken aynı anda görüntülenebilir. İlk meyotik bölünme yaklaşık 1,5 saat devam eder ve hemen ikinci meyotik bölünme tarafından takip edilir, olgun spermatozoa içine ayırt etmek için devam 64 toplam spermatidler verim.

Canlı hücre bölünmesi ni incelemek için spermatosit kullanmanın eşsiz bir avantajı, bozulmamış doku grupları nın veya hücrelerin kistlerinin spermatogenezin farklı aşamalarında sürekli ilerlemeleri dir ve spermatogenezin tüm aşamalarındaki hücreler genellikle herhangi bir testiste tanımlanabilir (Bkz. Şekil 3A). Bu nedenle, tüm testislerde meyotik hücreleri bulmak nispeten kolaydır. Bu hücreler yüksek çözünürlüklü görüntülemeye çok daha büyük ve daha elverişli olduğu için genellikle analizlerimizi ikinci meyozisyerine ilkine odaklarız, ancak her iki meyyotik bölümü de kapsayan tüm süreç başarılı bir şekilde görüntülenebilir. Ayrıca testis hazırlık ve kültür için genel protokol spermatogenez diğer süreçleri analiz etmek için de kullanılabilir unutulmamalıdır, önceki mitotik kök hücre veya spermatogonial bölünmeler veya spermatidler spermatozoa içine olgun olarak meydana gelen sitolojik değişiklikler gibi¹⁵. Spermatogenezbu yönlerinin çoğu drosophila ve insanlar arasında son derece korunur¹⁶.

Drosophila spermatositler Drosophila gelişiminin üçüncü instar larva evresi sırasında spermatogenezin meziyotik fazulaşmaya başlar¹³. Bu nedenle, üçüncü instar larvaları ile başlayan ve pupa ve yetişkinler de dahil olmak üzere yaşam döngüsü aşamalarından izole testisler spermatositlerin bölünmesi analizi için kullanılabilir. Spermatogenez¹⁷,^18,,19canlı ve sabit analiz için yetişkin erkek sinekler testislerinin çıkarılması için çeşitli mükemmel protokoller mevcuttur. Bu protokoller spermatogenezin geç evrelerinin incelenmesi veya sadece yetişkinlerde görülebilen genetik belirteçlerin kullanılması gerekiyorsa tercih edilebilir. Protokol bunun yerine larvave erken pupadan testis hazırlığına odaklanır, çünkü bu aşamalarda testislerin özellikle yüksek çözünürlüklü, hızlandırılmış mikroskopi ile hücre bölünmesi analizine uygun çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, larva ve pupa testisleri yetişkinlerden daha küçüktür ve organ içindeki hücreler daha az kalabalıktır. Bu nedenle, spermatositlerin bölünmesi genellikle larva testislerinin dış yüzeyine yakın, ışık saçılma dokusunun birden fazla katmanından nüfuz etmek zorunda kalmadan görüntülenebilir. İkinci olarak, erişkin testisler bağlı aksesuar organların kasılmaları nedeniyle ritmik hareket, ve bu hareketler bireysel hücrelerin zaman atlamalı görüntüleme zor olun. Ve üçüncüsü, larva testisleri pupal veya erişkin öldürücüye neden olan gen mutasyonlarını incelerken avantajlıdır. Yöntemlerimiz mikroskop aşamasında testislerin uzun vadeli kültür için optimize edilmiştir, hücre bölünmesi birden fazla tur görüntüleme veya aynı hazırlık spermatogenez birden fazla aşamada bireysel hücrelerin ilerlemesi için izin. Ayrıca tüm testislerin fiksasyonu ve immünboyması için bir protokol uyguluyoruz. Genel olarak, protokollerimiz özellikle bozulmamış dokuda hücre bölünmesi eğitimi almak isteyenler için yararlıdır ve spermatosit analizini yüksek derecede çekici Drosophila genetik araçlarıyla birleştirme yeteneği bu özellikle güçlü bir yaklaşım dır.

Protokol

1. Diseksiyon için Hayvanları, Araçları ve Medyayı Hazırlayın

1. Çapraz erkek ve kadın istenilen genotip atasını elde etmek için uçar. Meyotik spermatositlerin tanımlanması ve evrelemesi için yararlı transgenik belirteçler, kromozomları^etiketlemekiçin GFP-tubulin ve rfp-histon 2A'yı etiketlemek için kromozom8 içerir. Çapraz başına beş ila on kadın kullanın ve üçüncü yıldız larvaları şişenin kenarlarında (4-5 gün) sürünmeye başlayana kadar 25 °C'lik bir kuluçka makinesinde standart sinek yiyeceğinde haçlar kullanın. Erken beyaz pupa bir gün sonra oluşmaya başlayacak.
2. İnce uçlu iki çift düz forceps elde edin. Uçların keskin, hatta uzunlukta ve düz olduğundan emin olun (Şekil 1A). Bu forsepsleri yalnızca diseksiyonlar için kullanın ve kullanılmadığında 10 μL pipet uçları yla kaplayın.
3. Bir neşter aleti hazırlayın.
   1. Siyah anodize edilmiş çelik böcek piminin künt ucunu bir pim tutucuya takın ve pimi yerinde sabitlemek için tutucunun vidasını bükün. Bir çift forseps kullanarak ve bir kesme mikroskobu altında, ortasındaki böcek iğnesini kavrar ve 135° bir iç açı oluşturacak şekilde bükün(Şekil 1B). Keskin uç doku kesmek için, kenar medya damlaları arasında testis aktarmak için kullanılırken.
   2. Kullanılmadığında 1.000 μL pipet ucu ile kap.
4. Doku kültürü başlığında çalışarak, Schneider'ın medyasından 5 mL aliquot hazırlayın ve kullanım saatine kadar 4 °C'de saklayın. Diseksiyon lara başlamaya hazır olduğunuzda, oda sıcaklığına kadar 5 mL'lik bir ortam ısıtın. Daha sonra ısıtılmış diseksiyon ortamını 10 mL şırıngaya aktarın ve 0,22 m şırınga filtresi takın.

2. Larva ve Erken Pupa testislerinin diseksiyonu

1. Bir cam kaydıranın üst, orta ve alt kısmındaüç damla (her biri 50°L) dışarı atmak için ortam dolu filtre şırıngını kullanın.
2. Beş ila on üçüncü instar larvaları veya erken pupa (hala beyaz veya sarı pupa) üst damla aktarmak için bir kesme prob kullanın. Hafifçe herhangi bir gıda veya enkaz kaldırmak için diseksiyon sondası ile medyada larva ve pupa çalkalayın.
3. Bir diseksiyon mikroskobu altında, vücudun arka üçüncü oval şekilli yarı saydam yapılar olarak görünen iki ikili testisleri tanımlamak için bir diseksiyon sondası ile yan tarafında tek bir larva veya pupa açın(Şekil 2A, B). Testisleri olmayan hayvanlar dişidir ve atılmalıdır.
4. Bir erkek larva veya pupa bulunduğunda ve temiz olduğunda, medyanın ikinci damlasına taşıyın. 3 veya 4 erkek larva ve/veya pupa medyanın ikinci damlasına aktarılana kadar tekrarlayın.
5. Medyanın ikinci damlasında çalışmak, tek bir erkek larva veya pupa ile orta bölgesinde bir çift forceps kavramak, sadece testisler için ön. Hayvanı yavaşça ikiye ayırmak için ikinci çift forceps'u kullanın.
6. Larva veya pupanın arka ucunu bir çift forceps ile cam kaydırak üzerinde tutun. Ponpların hemen yanından başlayarak, neşter aracının kenarını kullanarak miteyi aşağı itin ve neşteri hayvanın kesilen ucuna doğru hareket ettirin. Bu bağırsaklar, yağ organları ve testisler dahil hayvanın iç organları, dışarı atacaktır.
7. Testisleri diğer organlardan ayırın. Testisler açık, yağ vücut şeritler gömülü oval şekilli organlar (Şekil 2C).
8. Testisleri birer birer üçüncü ortam düşüşüne aktarın. Bunu başarmak için, yağ gövdesi altında neşter kenarına eklemek, ortamdan doku kaldırın ve hızlı bir şekilde üçüncü damla hareket ettirin.
9. Alternatif olarak, hala başarılı bir şekilde doku kaldırmak için testisler bağlı yeterli yağ vücut yoksa, yavaşça diseksiyon ortamı ile önceden ıslak olan bir cam Pasteur pipet kullanarak doku transferi.
10. Neşter aletinin keskin ucunu kullanarak aşırı yağ gövdesini testislerden hafifçe dilimleyin, kenarlarda sadece küçük bir yağ kenarı bırakarak kullanın(Şekil 2C). Tüm yağ vücut kaldırmak için gerekli değildir, ve bunu yapmaya çalışırken büyük olasılıkla zarar veya testislerin yırtılması neden olacaktır.
11. Cam slayt üzerinde erkek larvatüm yukarıdaki adımları tekrarlayın.
12. Adım 3'e veya adım 5'e geçin.

3. Canlı Mikroskobik Görüntüleme Için Montaj Testisleri

NOT: Bu montaj prosedürü Drosophila larva beyin nöroblastları görüntüleme için yeni yayınlanan bir protokol uyarlanmıştır²⁰. Bu başvuruda ek ayrıntılar bulunabilir.

1. 50 mm gaz geçirgen kültür yemeğinin ortasına Schneider'ın medyasından (yaklaşık 30°L) tek bir damla sını (yaklaşık 30°L) yatırmak için filtre şırıngasını kullanın.
2. Hazırlanan testisleri gaz geçirilme çanağı üzerindeki damlaya aktarmak için önceden ıslak pasteur pipeti kullanın. Testisler genellikle damla yüzeyine yüzer.
3. Testisleri gaz geçirilebilir membrana hafifçe itmek için neşter aletikullanın. Neşterin keskin noktası ile gaz geçirilebilir membran yırtMak için dikkat edin. Tüm testisleri damlanın ortasına doğru itin.
4. Gaz geçirgen membranÜzerinde her biri yaklaşık 30°L olmak üzere dört damla yağ yapmak için halokarbon yağıyla dolu 1 mL'lik bir şırınga kullanın. 22 mm'lik cam kapak lı bir kapağın dört köşesine karşılık gelecek şekilde testisleri içeren ortam damlasının etrafına yağ damlalarını boşluk bırakın.
5. 22 mm'lik cam kapak lı bir kapağın köşelerini dört damla halokarbon yağıyla hizalayın ve coverslip'i hafifçe ortama ve yağa indirin. Coverslip yerleşmek ve testisler içeren medya petrol damlaları arasında yayılmasını bekleyin.
6. Coverslip'in testislerin yüzeyine yerleşmesine izin vermek için fazla ortamı çıkarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında testisler gözlemlerken, sıvı küçük bir miktar uzakta wick için kapak altında ortama hassas bir görev silme köşesi ekleyin. Cam kapak kayma sadece en büyük testis yüzeyi ile temas edene kadar wick yeterli medya. Bu testisler üzerinde baskı uygulamak ve yırtılma neden olacak gibi çok fazla medya kaldırmak ve coverslip çok uzak düşürmek için önemlidir (Şekil 5'ebakınız).

4. Meiyotik Spermatositlerin Canlı Görüntülenmesi

NOT: Spermatositler lazer tarama veya dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Sistem, floresan proteinlerin fotobeyazmasını veya dokunun fotohasarından kaçınmak için yeterli hız ve duyarlılığa sahip olmalıdır.

1. Testislerin hemen üzerinde cam kapak üzerine bir damla daldırma yağı yerleştirin. Çanak üzerinde çevirin ve mikroskop aşamasında yerleştirin ve testisler hemen altında olana kadar yağ içine mikroskop hedefi (40x veya 60x) taşıyın. Tek bir testis bulmak ve odak haline getirmek için iletilen ışığı kullanın.
2. Konfokal ile hızlı görüntüler yakalarken, hücrelerin organizasyonunu incelemek için testis'i hareket ettirin. Testislerin bir ucunda çok sayıda küçük, yoğun paketlenmiş hücre bulunur. Bu uç germline kök hücreleri ve spermatogoniiçerir. Organın diğer ucuna doğru hareket, ayrıkümeler veya kistler halinde organize giderek daha büyük hücreleri belirlemek. Bu büyük hücreler spermatositlerdir (Şekil 3A).
3. GFP-tubulin görüntüleme ise, hücrenin korteksinde bulunan iki parlak mikrotübül asterin (yani, centrozomlar) varlığı ile 30-60 dakika içinde meyozasyon başlayacak spermatositleri tanımlayın(Şekil 3B, C).
4. Bir kez meyotik spermatosit bir kist tespit edilmiştir, zaman içinde görüntülerin z-yığınları yakalamak için edinim parametreleri kurmak. Tipik olarak, z boyutunda 1,5 μm aralıklı 15-20 görüntü elde etmek aynı kist içinde çeşitli spermatositlerin tam hacmiyakalamak için yeterlidir.
5. Yaklaşık 1,5 saat süren ilk meyotik bölümün tamamını görüntülemede her 2 dakikada bir tam z-yığınları edinin. Özellikle sadece belirli bir meyozolayı nın incelenmesi durumunda daha hızlı edinme oranları kullanmak mümkündür. Ancak, örneğin lazer uyarma sına tekrar maruz kalmasına bağlı olarak fotobeyazrlama veya fotohasara neden olmamak için dikkatli olmaya özen.
6. Satın alma uzun zaman boyunca odak kayması önlemek için sürekli, otomatik odaklama kontrol sistemi kullanın. Numunenin mikroskop aşamasında ki sıcaklık kontrolü genellikle 22-23 °C oda sıcaklığında olduğu varsayılsa gerekli değildir. Sıcaklık kontrolü varsa, numuneyi mikroskop aşamasında 25 °C'de saklayın.
7. Meyotik spermatosit bulunamazsa, numuneyi birkaç saat veya gece boyunca 25 °C'lik bir kuluçka makinesinde ve görüntüde tekrar saklayın.

5. Fiksasyon ve İmmünBoyama

1. Yukarıdaki adım 2.10 itibaren, PBSTx 0.5 mL içeren 9 kuyulu cam diseksiyon çanak bir kuyuya testisaktarmak için bir cam Pasteur pipet kullanın (fosfat% 0.3 Triton X-100 ile tamponlu salin). Testislerin yemeğin altında olduğundan emin olun.
   NOT: Paraformaldehit toksiktir ve duman kaputunda eldivenlerle işlenmelidir.
2. Testisleri oda sıcaklığında 20 dk olarak düzeltin.
3. Testisleri 0,5 mL PBSTx içeren bir kuyuya aktarın. 5 dakika boyunca hafif ajitasyonla yıkayın. Taze PBSTx ile yeni kuyularda yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.
4. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte %5 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren 0,5 mL PBSTx'te primer antikorları istenilen konsantrasyona seyreltin. Testisleri 9 kuyulu cam kesme kabından seyreltilmiş primer antikor tüpüne aktarın ve bir gecede 4 °C'de hafif sallanan veya fındıkla kuluçkaya yatırın.
5. Testisleri 0,5 mL PBSTx'te 5 dakika boyunca 9 kuyulu cam diseksiyon kabında yıkayın. Taze PBSTx ile yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.
6. %5 BSA içeren 250 μL PBSTx'teki sekonder antikorları seyreltin ve 9 kuyulu cam kesme kabının temiz bir kuyuya dağıtın. İstenirse, DNA leke için DAPI ekleyin. Testisleri ikincil antikor içeren kuyuya aktarın, plastik sargı ile kaplayın ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca hafif ajitasyon la karanlıkta kuluçkaya yatırın.
7. Testisleri 0,5 mL PBSTx ile dolu temiz bir kuyuya aktarın. 5 dakika boyunca iki kez taze PBSTx ile yıkayın ve 30 dakika boyunca üçüncü kez yıkayın.

6. Montaj Sabit Testisler

1. Testisleri son yıkamadan pasteur pipeti kullanarak cam mikroskopi slaytına aktarın. Gerekirse, testisleri slayt yüzeyine itmek için neşter aracının kenarını kullanın.
2. Testislerden fazla sıvıyı uzaklaştırmak için hassas bir görev silme nin köşesini kullanın. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın.
3. Testislere 30-50 μL'lik bir damla mikroskopi montaj ortamı uygulayın.
4. Montaj ortamının damlasına 22 mm'lik bir kapak kayması yerleştirin ve coverslip'in yerleşmesine ve montaj ortamının kapak altına yayılmasına izin verin. Aşırı montaj ortamını sıkmak için gerekirse coverslip'e hafif basınç uygulayın ve örtünün testislerin yüzeyinde dinlenmesine izin verin.
5. Kapak kayma kenarları mühür için oje kullanın.

Sonuçlar

Bu protokol başarıyla yürütüldüğünde, testisler konfokal mikroskopi veya diğer floresan mikroskopi yöntemleri ile görüntüleme için tamamen bozulmadan kalacaktır. Şekil 3A'dagörüldüğü gibi testislerin hücresel organizasyonu korunur ve hücre farklılaşmasının testisin bir ucundan spermatogonia, spermatositler ve haploid spermatidler gibi diğer ucuna ilerlemesi görülebilir. GFP-tubulin spermatositlerin bölünmesini belirlemek ve hücrelerin meyozis yoluyla ilerleme...

Tartışmalar

Spermatosit hücre bölünmesinin uzun süreli canlı görüntülemesi için optimize edilmiş larva veya erken pupal Drosophila testislerinin hazırlanması için bir protokol tanımladık. Bu bozulmamış doku fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi analizi için güçlü bir yöntemdir. Bu yöntemin gücü, spesifik gen mutasyonları, dokuya özgü RNAi aracılı baskılama ve floresan olarak etiketlenmiş protein ve organel belirteçleri gibi Drosophila genetik araçlarıyla birleştirildiğinde ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium