Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Resumo

O objetivo deste protocolo é analisar a divisão celular em tecido intacto por microscopia celular viva e fixa usando espermatocitos meióticos drosophila. O protocolo demonstra como isolar testículos inteiros e intactos das larvas de Drosophila e pupas primitivas, e como processá-los e montá-los para microscopia.

Resumo

A análise experimental das células que se dividem em tecidos e órgãos vivos e intactos é essencial para nossa compreensão de como a divisão celular se integra com o desenvolvimento, homeostase tecidual e processos de doenças. Os espermatocitos drosophila submetidos a meiose são ideais para esta análise porque (1) testículos de Drosophila inteiros contendo espermatocitos são relativamente fáceis de preparar para a microscopia, (2) o tamanho grande dos espermatocitos os torna adequados para imagens de alta resolução, e (3) poderosas ferramentas genéticas drosophila podem ser integradas com análise viva. Aqui, apresentamos um protocolo facilmente acessível para a preparação de testículos inteiros de larvas de Drosophila terceira instar e pupas precoces. Descrevemos como identificar espermatocitos meióticos em testículos inteiros preparados e como imaginá-los vivendo por microscopia de lapso de tempo. Também são fornecidos protocolos de fixação e imunocoloração de testículos inteiros. O uso de testículos larvais tem várias vantagens sobre os protocolos disponíveis que usam testículos adultos para análise de espermatocitos. Mais importante, os testículos larvais são menores e menos cheios de células do que testículos adultos, e isso facilita muito a imagem de alta resolução de espermatocitos. Para demonstrar essas vantagens e as aplicações dos protocolos, apresentamos resultados mostrando a redistribuição do retículo endoplasmático em relação aos microtúbulos do fuso durante a divisão celular em um único espermatocito, imagem por microscopia confocal de lapso de tempo. Os protocolos podem ser combinados com a expressão de qualquer número de proteínas ou marcadores de organela fluorescentemente marcados, bem como mutações genéticas e outras ferramentas genéticas, tornando esta abordagem especialmente poderosa para a análise de mecanismos de divisão celular no contexto fisiológico de tecidos e órgãos inteiros.

Introdução

A divisão celular é frequentemente estudada usando linhas celulares cultivadas na cultura¹. Embora tenhamos adquirido uma riqueza de insights inestimáveis e compreensão de mecanismos fundamentais a partir desses estudos², as células cultivadas na cultura não podem recapitular totalmente a fisiologia da divisão celular como ocorre em tecido vivo intacto. Por exemplo, em tecidos e órgãos intactos, as células devem se dividir no lugar certo e no momento certo para que as células prole estejam adequadamente situadas dentro do tecido, para que possam se submeter a programas de diferenciação ou funcionais adequados, e para que a proliferação celular seja devidamente coordenada com o crescimento tecidual ou a homeostase³. Para as células cultivadas na cultura, por outro lado, a divisão celular é geralmente regulada por fatores de crescimento no meio de cultura⁴, e, portanto, não podemos aprender com essas células como fatores ambientais in vivo, como arquitetura tecidual ou sinalização de desenvolvimento, influenciam o processo de divisão. Também é importante notar que muitas das linhas celulares usadas para estudar a divisão celular, como as células HeLa e U2OS, foram derivadas de tumores metastáticos⁵. Portanto, muitos aspectos da fisiologia básica dessas células cancerosas, como mecanismos de regulação do ciclo celular e estabilidade cromossômica, provavelmente foram alterados em comparação com células saudáveis. A compreensão completa da fisiologia da divisão celular, portanto, depende de nossa capacidade de estudar células divisórias em seus ambientes nativos, in vivo, que preservam mecanismos regulatórios fisiológicos e arquitetura tecidual.

Os avanços na compreensão de como a divisão celular opera dentro de tecidos e órgãos intactos são dificultados por dificuldades inerentes à análise in vivo ou ex vivo. Primeiro, pode ser difícil ou impossível acessar células divisórias para análise microscópica dentro de órgãos grandes ou tecidos grossos. Em segundo lugar, muitas vezes é difícil prever quando as células individuais se dividirão in vivo. Em terceiro lugar, a fisiologia do tecido pode se deteriorar rapidamente durante a cultura ex vivo. Neste protocolo, descrevemos métodos facilmente acessíveis para análise viva e fixa de espermatocitos drosophila melanogaster à medida que eles se submetem a divisões de células meióticas dentro de testículos totalmente intactos. Essas células são ideais para análise viva, ex vivo, pois são facilmente acessíveis com métodos ópticos padrão, como microscopia confocal, se dividem em momentos e locais previsíveis, e testículos intactos podem ser mantidos na cultura ex vivo por até cerca de 24h. Além disso, os espermatocitos drosophila são células redondas grandes (aproximadamente 20-30 μm de diâmetro) que não mudam de forma quando se dividem, tornando-os ideais para imagens de alta resolução e lapso de tempo de componentes celulares, como o aparelho de fuso e organelas citoplasmáticas. Embora essas células sejam submetidas à meiose em oposição à mitose, muitos dos processos essenciais de divisão celular são muito semelhantes entre esses dois mecanismos de divisão celular⁶. Essas vantagens, combinadas com poderosas ferramentas genéticas drosophila, tornaram drosophila espermatocitos um modelo amplamente utilizado para a análise ex vivo de processos essenciais de divisão celular, incluindo formação e regulação de fuso, citocinese e remodelação de organela^77,8,9,10,11.

Spermatocitos são células que estão no estágio meioático da espermatogênese. Em Drosophila,a espermatogênese começa com um grupo de células-tronco germinais que estão localizadas em uma pequena região ou "hub" em um pólo do testículo^12,13. Essas células se dividem por uma mitose assimétrica, dando origem a um único espermatogonium diferenciado. A espermatogonia então se submete a quatro mitoses síncronas para produzir um grupo de 16 células que permanecem intimamente associadas dentro de um único cisto. Nesta fase, as células transitam de um ciclo mitótico para um ciclo celular meiótico e são referidas como espermatocitos. Os espermatocitos passam cerca de dois a três dias em um estágio G2 prolongado do ciclo celular, durante o qual crescem dramaticamente e sofrem alterações citológicas na preparação para as duas divisões meióticas e posterior esperetriogênese^13,14. Todo o grupo de 16 espermatocitos dentro de um único cisto então entram na primeira divisão meiotica ao mesmo tempo. Assim, vários espermatocitos meióticos meioticos podem ser imagemao mesmo, à medida que prosseguem através da divisão celular. A primeira divisão meiótica prossegue por aproximadamente 1,5 h e é seguida quase imediatamente pela segunda divisão meiotica, produzindo 64 espermatozóides totais que passam a se diferenciar em espermatozoides maduros.

Uma vantagem única do uso de espermatocitos para estudar a divisão celular em tecido vivo e intacto é que grupos ou cistos de células progridem constantemente através dos diferentes estágios da espermatogênese, e as células em todos os estágios da espermatogênese geralmente podem ser identificadas em qualquer determinado testículo (ver Figura 3A). Portanto, é relativamente fácil encontrar células meióticas em testículos inteiros. Geralmente focamos nossas análises na primeira em oposição à segunda meiose porque essas células são muito maiores e mais acessíveis a imagens de alta resolução, mas todo o processo que abrange ambas as divisões meióticas pode ser visto com sucesso. Deve-se notar também que o protocolo geral para preparação e cultura de testículos pode ser usado para analisar outros processos de espermatogênese também, como as divisões mitóticas anteriores ou as formas espermagogoniais ou as alterações citológicas que ocorrem à medida que os espermatids amadurecem em espermatozoides¹⁵. Muitos desses aspectos da espermatogênese são altamente conservados entre drosophila e humanos¹⁶.

Os espermatocitos drosophila começam a atingir a fase meiótica da espermatogênese durante o terceiro estágio larval instar do desenvolvimento da Drosophila ¹³. Portanto, testículos isolados dos estágios do ciclo de vida começando com a terceira larva instar e incluindo pupas e adultos podem ser usados para análise de espermatocitos divisórias. Vários protocolos excelentes estão disponíveis para extração de testículos de moscas machos adultas para análise viva e fixa da espermatogênese^17,18,19. Esses protocolos podem ser preferíveis para estudar estágios tardios da espermatogênese ou se marcadores genéticos que só são visíveis em adultos devem ser usados. O protocolo se concentra, em vez disso, na preparação de testículos de larvas e pupas precoces, pois os testículos nessas fases têm várias vantagens que são especificamente pertinentes à análise de divisão celular por microscopia de alta resolução e lapso de tempo. Primeiro, os testículos de larvas e pupas são menores do que os de adultos, e as células dentro do órgão são menos aglomeradas. Por causa disso, a divisão de espermatocitos pode muitas vezes ser imagem próxima da superfície externa dos testículos larvais, sem ter que penetrar através de múltiplas camadas de tecido disperso de luz. Em segundo lugar, os testículos adultos se movem ritmicamente devido a contrações dos órgãos acessórios ligados, e esses movimentos tornam a imagem de lapso de tempo de células individuais desafiadora. E terceiro, os testículos larvais são vantajosos ao estudar mutações genéticas que causam letalidade pupal ou adulta. Nossos métodos são otimizados para a cultura de longo prazo dos testículos no estágio do microscópio, permitindo a imagem de múltiplas rodadas de divisão celular ou a progressão de células individuais através de múltiplos estágios de espermatogênese na mesma preparação. Também descrevemos um protocolo de fixação e imunocoloração de testículos inteiros. No geral, nossos protocolos são particularmente úteis para os interessados em estudar a divisão celular em tecido intacto, e a capacidade de combinar análise de espermatocitos com ferramentas genéticas drosophila altamente tratáveis faz desta uma abordagem especialmente poderosa.

Protocolo

1. Prepare animais, ferramentas e mídia para dissecação

1. Cruze moscas machos e fêmeas para obter a descendência do genótipo desejado. Marcadores transgênicos úteis para identificação e estadiamento de espermatocitos meióticos incluem gfp-tubulina para rotular o fuso meiótico e rfp-histona 2A para rotular cromossomos⁸. Use de cinco a dez fêmeas por cruz e mantenha cruzes em alimentos de mosca padrão em frascos em uma incubadora de 25 °C até que as larvas instar terceiros comecem a rastejar pelos lados do frasco (4-5 dias). Pupas brancas começarão a se formar um dia depois.
2. Obtenha dois pares de fórceps retos com pontas finas. Certifique-se de que as pontas estão afiadas, mesmo em comprimento, e retas(Figura 1A). Use estes fórceps apenas para dissecções, e tampa com pontas de pipeta de 10 μL quando não estiver em uso.
3. Prepare uma ferramenta de bisturi.
   1. Insira a extremidade contundente de um pino de inseto de aço anodizado preto em um suporte de pino e torça o parafuso do suporte para fixar o pino no lugar. Usando um par de fórceps e sob um microscópio dissecando, segure o pino de inseto no meio e dobre-o para formar um ângulo interno de 135°(Figura 1B). A extremidade afiada é para cortar tecido, enquanto a borda é usada para transferir testículos entre gotas de mídia.
   2. Tampa com uma ponta de pipeta de 1.000 μL quando não estiver em uso.
4. Trabalhando em uma capa de cultura de tecido, prepare as alíquotas de 5 mL da mídia de Schneider e armazene a 4 °C até o momento do uso. Quando estiver pronto para iniciar as dissecções, aqueça uma alíquota de 5 mL de mídia à temperatura ambiente. Em seguida, transfira a mídia de dissecção aquecida para uma seringa de 10 mL e conecte um filtro de seringa de 0,22 μm.

2. Dissecção de Testículos de Larvas e Pupas Primitivas

1. Use a seringa do filtro cheia de mídia para expelir três gotas de mídia (50 μL cada) na parte superior, média e inferior de um slide de vidro.
2. Use uma sonda dissecação para transferir de cinco a dez terceiros larvas instar ou pupas precoces (pupas que ainda são brancas ou amarelas) para a queda superior. Agite suavemente as larvas e as pupas na mídia com a sonda dissecante para remover qualquer alimento ou detrito.
3. Sob um microscópio dissecando, gire uma única larva ou pupa de lado com uma sonda dissecante para identificar os dois testículos bilaterais, se presentes, que aparecem como estruturas translúcidas em forma oval no terço posterior do corpo(Figura 2A, B). Animais que não possuem testículos são fêmeas e devem ser descartados.
4. Quando uma larva macho ou pupa é encontrada e está limpa, mova-a para a segunda gota de mídia. Repita até que 3 ou 4 larvas machos e/ou pupas tenham sido transferidas para a segunda gota de mídia.
5. Trabalhando na segunda gota da mídia, segure uma única larva masculina ou pupa com um par de fórceps em sua região média, apenas anterior aos testículos. Use o segundo par de fórceps para rasgar suavemente o animal ao meio.
6. Segure a extremidade posterior da larva ou pupa no escorregador de vidro com um par de fórceps. Começando ao lado dos fórceps, empurre para baixo a cutícula usando a borda da ferramenta do bisturi e mova o bisturi em direção à extremidade cortada do animal. Isso expulsará os órgãos internos do animal, que incluem as entranhas, corpos gordos e testículos.
7. Gentilmente provoque os testículos do resto dos órgãos. Os testículos são órgãos claros, em forma oval embutidos em fitas de corpo gordo(Figura 2C).
8. Transfira os testículos um de cada vez para a terceira gota de mídia. Para isso, insira a borda do bisturi sob o corpo de gordura, levante o tecido para fora da mídia e mova-o rapidamente para a terceira gota.
9. Alternativamente, se não houver corpo de gordura suficiente ainda ligado aos testículos para levantar com sucesso o tecido, transfira suavemente o tecido usando uma pipeta pasteur de vidro que foi pré-molhada com mídia de dissecção.
10. Use a extremidade afiada da ferramenta do bisturi para cortar suavemente o excesso de gordura do corpo dos testículos, deixando apenas uma pequena borda de corpo de gordura ao redor das bordas(Figura 2C). Não é necessário remover todo o corpo gordo, e tentar fazê-lo provavelmente resultará em danos ou rupturas dos testículos.
11. Repita os passos acima para todas as larvas masculinas no escorregador de vidro.
12. Proceda para o passo 3 ou para o passo 5.

3. Montagem de testículos para imagens microscópicas ao vivo

NOTA: Este procedimento de montagem foi adaptado a partir de um protocolo recentemente publicado para imagens de neuroblastos cerebrais larvais drosophila ²⁰. Podem ser encontrados detalhes adicionais nesta referência.

1. Use a seringa do filtro para depositar uma única gota da mídia de Schneider (cerca de 30 μL) no centro de um prato de cultura permeável a gás de 50 mm.
2. Use uma pipeta pasteur pré-molhada para transferir os testículos preparados para a queda no prato permeável a gás. Os testículos geralmente flutuam até a superfície da gota.
3. Use a ferramenta do bisturi para empurrar suavemente os testículos para baixo na membrana permeável a gás. Tome cuidado para não romper a membrana permeável a gás com o ponto afiado do bisturi. Empurre todos os testículos para o centro da queda.
4. Use uma seringa de 1 mL cheia de óleo de halocarboneto para fazer quatro gotas de óleo, cerca de 30 μL cada, na membrana permeável a gás. Espaça as gotas de óleo ao redor da gota de mídia contendo os testículos para corresponder aos quatro cantos de uma tampa de vidro de 22 mm.
5. Alinhe os cantos de uma tampa de vidro de 22 mm com as quatro gotas de óleo de halocarboneto e abaixe suavemente o deslizamento de cobertura sobre a mídia e o óleo. Deixe que o deslizamento de cobertura se acomode e para a mídia que contém os testículos se espalhem entre as gotas de óleo.
6. Remova o excesso de mídia para permitir que o deslizamento de cobertura se instale na superfície dos testículos. Enquanto observa os testículos sob um microscópio dissecando, insira o canto de uma delicada tarefa limpando a mídia sob o deslizamento de cobertura para afastar uma pequena quantidade de líquido. Afaste-se da mídia suficiente até que a tampa de vidro faça contato com a superfície do maior testículo. É fundamental não remover muita mídia e baixar muito o deslizamento de cobertura, pois isso irá exercer pressão sobre os testículos e fazê-los romper (ver Figura 5).

4. Imagem ao vivo de espermatocitos meioticos

NOTA: Os espermatocitos podem ser imagematravés de um escaneamento a laser ou microscópio confocal de disco giratório. O sistema deve ter velocidade e sensibilidade adequadas para evitar o fotobranqueamento de proteínas fluorescentes ou fotodanos do tecido.

1. Coloque uma gota de óleo de imersão na tampa do vidro logo acima dos testículos. Vire o prato e coloque-o no estágio do microscópio e mova o objetivo do microscópio (40x ou 60x) para dentro do óleo até que ele esteja logo abaixo dos testículos. Use a luz transmitida para encontrar um único testículo e trazê-la em foco.
2. Enquanto captura imagens rápidas com o confocal, mova os testículos ao redor para examinar a organização das células. Uma extremidade do testículo terá muitas células pequenas e densamente embaladas. Esta extremidade contém as células-tronco germinais e a espermatogonia. Movendo-se para a outra extremidade do órgão, identifique células progressivamente maiores organizadas em aglomerados discretos ou cistos. Essas células grandes são os espermatocitos(Figura 3A).
3. Se a imagem gfp-tubbulina, identifique os espermatocitos que iniciarão a meiose dentro de 30-60 min pela presença de duas asters microtúbulas brilhantes (ou seja, centrossomos) localizadas no córtex da célula(Figura 3B, C).
4. Uma vez identificado um cisto de espermatocitos meiticos, estabeleça parâmetros de aquisição para capturar pilhas z de imagens ao longo do tempo. Normalmente, a aquisição de imagens de 15 a 20 imagens espaçadas a 1,5 μm de distância na dimensão z é suficiente para capturar o volume total de vários espermatocitos dentro do mesmo cisto.
5. Adquira pilhas de z a cada 2 min se a imagem de toda a primeira divisão meiótica, que leva cerca de 1,5 horas. É possível utilizar taxas de aquisição mais rápidas, especialmente se apenas um evento específico de meiose for analisado. No entanto, tome cuidado para não causar fotobranqueamento ou fotodagem devido à exposição repetida da amostra à excitação a laser.
6. Use um sistema de controle de foco automático e contínuo para evitar a deriva focal durante o longo tempo de aquisição. O controle de temperatura da amostra no estágio do microscópio geralmente não é necessário, assumindo a temperatura ambiente de aproximadamente 22-23 °C. Se houver controle de temperatura, mantenha a amostra a 25 °C no estágio do microscópio.
7. Se os espermatocitos meiticos não forem encontrados, armazene a amostra por várias horas ou durante a noite em uma incubadora e imagem de 25 °C novamente.

5. Fixação e Imunocoloração

1. A partir do passo 2.10 acima, use uma pipeta pasteur de vidro para transferir testículos para um poço em um prato de dissecção de vidro de 9 poços contendo 0,5 mL de 8% de paraformaldeído em PBSTx (solução tamponada de fosfato com 0,3% Triton X-100). Certifique-se de que os testículos estão deitados na parte inferior do prato.
   NOTA: O paraformaldeído é tóxico e deve ser manuseado com luvas em uma capa de fumaça.
2. Fixe os testículos por 20 min em temperatura ambiente.
3. Transfira os testículos para um poço contendo 0,5 mL PBSTx. Lave por 5 min com agitação suave. Repita o passo de lavagem em novos poços com PBSTx fresco mais duas vezes.
4. Diluir o anticorpo primário à concentração desejada em PBSTx de 0,5 mL contendo albumina de soro bovino de 5% (BSA) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Transfira os testículos do prato de dissecção de vidro de 9 poços para o tubo de anticorpo primário diluído e incuba rasteira durante a noite a 4 °C com balanço suave ou porca.
5. Lave os testículos em 0,5 mL de PBSTx por 5 min em um poço de um prato de dissecar de vidro de 9 poços. Repita o passo de lavagem com PBSTx fresco mais duas vezes.
6. Diluir o anticorpo secundário em 250 μL de PBSTx contendo 5% de BSA e dispensar em um poço limpo de um prato de dissecar de vidro de 9 poços. Se desejar, adicione DAPI para manchar o DNA. Transfira os testículos para o poço que contém anticorpo secundário, cubra com plástico e incuba no escuro com agitação suave por 4 horas em temperatura ambiente.
7. Transfira os testículos para um poço limpo cheio de 0,5 mL de PBSTx. Lave com PBSTx fresco duas vezes por 5 min e uma terceira vez por 30 min.

6. Montagem de testes fixos

1. Transfira os testículos da última lavagem para um slide de microscopia de vidro usando uma pipeta Pasteur. Se necessário, use a borda da ferramenta do bisturi para empurrar os testículos para baixo na superfície do slide.
2. Use o canto de uma limpeza de tarefa delicada para afastar o excesso de líquido dos testículos. Remova o máximo de líquido possível.
3. Aplique uma gota de 30-50 μL de meio de montagem de microscopia nos testículos.
4. Coloque uma tampa de 22 mm sobre a gota do meio de montagem e deixe que a tampa se acomode e o meio de montagem se espalhe sob a tampa. Aplique pressão suave na tampa, se necessário, para espremer o excesso de montagem média e permitir que a tampa repouse sobre a superfície dos testículos.
5. Use esmalte para selar as bordas do deslizamento de cobertura.

Resultados

Quando este protocolo for executado com sucesso, os testículos permanecerão totalmente intactos para a imagem por microscopia confocal ou outros métodos de microscopia de fluorescência. Como visto na Figura 3A,a organização celular dos testículos é preservada, e a progressão da diferenciação celular de uma extremidade do testículo para a outra, incluindo espermatogonia, espermatocitos e espermatides haplóides é visível. GFP-tubbulin é um marcador útil para identificar esperm...

Discussão

Descrevemos um protocolo para a preparação de testículos de Drosophila larval ou pupal precoce, otimizados para imagens ao vivo de longo prazo da divisão celular de espermatocitos. Este é um poderoso método de análise da divisão celular no contexto fisiológico do tecido intacto. O poder deste método é ainda mais expandido quando combinado com ferramentas genéticas de Drosophila, como mutações genéticas específicas, supressão mediada por RNAi específica do tecido, e marcadores de prote?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium