通过在小鼠中缝核中立体定向注射 5,7-二羟色胺消除 5-羟色胺能神经元

摘要

该方案描述了一种中缝背核 （DRN） 损伤的小鼠模型（实验小鼠的存活率为 >90%），通过使用倾斜的方法将 5,7-二羟色胺立体定向注射到 DRN 中，以防止损伤上矢状窦，从而稳定地丢失背中缝血清素能神经元。

摘要

立体定向注射已广泛用于将化合物或病毒直接递送到啮齿动物的目标大脑区域。直接靶向中缝背核 （DRN） 中的血清素能神经元可导致出血过多和动物死亡，因为它位于矢状上窦 （SSS） 下方。该方案描述了 DRN 血清素能神经元损伤小鼠模型的产生（>90% 存活率），在 DRN 中稳定丢失 >70% 5-HT 阳性细胞。通过使用倾斜入路（前/后 30°）将选择性 5-羟色胺 5,7-二羟色胺 （5,7-DHT） 立体定向注射到 DRN 中来诱导病变，以避免损伤 SSS。DRN 血清素能神经元损伤小鼠表现出与焦虑相关的行为改变，这有助于确认 DRN 损伤手术的成功。这种方法在这里用于 DRN 病变，但也可用于其他需要角度注射以避免中线结构的立体定向注射。这种 DRN 5-羟色胺能神经元损伤小鼠模型为理解 5-羟色胺能神经元在精神疾病（如广泛性焦虑症和重度抑郁症）发病机制中的作用提供了有价值的工具。

引言

血清素或 5-羟色胺 （5-HT） 是一种重要的神经递质，主要在肠道和大脑中产生，影响多种心理功能。在中枢神经系统 （CNS） 中，血清素能系统在调节情绪和社会行为、睡眠和觉醒、食欲、记忆和方面起着核心作用。在 CNS 中，血清素由血清素能神经元合成，可分为以下两组：喙组，其上行突起几乎支配整个大脑;尾部组，主要投射到脊髓¹。喙组包含大脑中约 85% 的血清素能神经元，由尾部线性核、中缝正中核和 DRN 组成，其中大脑中血清素能神经元群最多。

通常认为 5-羟色胺能系统失调与重度抑郁症 （MDD） 和广泛性焦虑症 （GAD） 的发病机制有关²。这是因为选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂 （SSRIs） 是治疗这些精神疾病的有效药物治疗 ^3,4。此外，累积的证据表明，躁狂症⁵ （mania） 和自杀行为⁶ （suicidal behavior） 可能与 DRN 中血清素功能水平较低有关。另据报道，Pet1-Cre;Lmx1b^flox/flox 小鼠和 hTM-DTA^iPet1 小鼠 （遗传小鼠模型分别来自胚胎晚期⁷ 和成年期⁸ 缺乏大多数中枢血清素能神经元）显示出增强的情境恐惧记忆。然而，尽管进行了广泛的研究，DRN 5-羟色胺能神经元在这些精神疾病中的确切参与仍有待阐明。

为了探索 DRN 5-羟色胺能神经元调节 5-羟色胺相关精神疾病发病机制的机制，已经生成了动物模型。光遗传学工具已被用于抑制大鼠 DRN 中的 5-羟色胺能神经元，这些动物表现出增加的焦虑样行为⁹。然而，光遗传学有局限性。例如，必须将光传输装置植入大脑深处的目标区域，并且在植入手术过程中或光装置发出的热量可能会损伤周围组织。即使温度变化可能不会造成可检测到的脑组织损伤，它仍然会引起显着的生理和行为影响¹⁰。

药理学作可能是创建 DRN 血清素能神经元损伤动物模型的更简单方法。一些小组通过在 DRN 中立体定向显微注射血清素神经毒素 5,7-DHT 产生了 DRN 血清素能神经元损伤大鼠。然而，这些大鼠模型表现出不同的行为改变，例如焦虑行为¹¹ 、焦虑样行为增加¹² 和物体记忆受损¹³。尽管在大鼠中进行了许多研究，但关于 5,7-DHT 对小鼠影响的研究较少。一组报告了在 DRN¹⁴ 中接受 5,7-DHT 立体定向显微注射的实验小鼠死亡率过高 （>50%） 和血清素消耗有限。另一组报告说，不可预测的慢性轻度应激 （UCMS） 可在 5,7-DHT 诱导的 DRN 损伤小鼠中诱导显着的攻击潜伏期改变。然而，没有提供组织学结果来证实 DRN¹⁵ 中确切的 5-羟色胺能神经元丢失。鉴于 DRN 的解剖位置低于 SSS¹⁶，使用标准程序在 DRN 中立体定向注射可能会导致小鼠大量出血和高死亡率。

该方案描述了通过立体定向注射 5,7-DHT 生成 DRN 血清素能神经元损伤小鼠模型（实验小鼠的 >90% 存活率）的方案，DRN 血清素能神经元稳定丢失。DRN 中的注射使用倾斜的方法来防止对 SSS 造成伤害。这种手术始终导致小鼠 DRN 中 5-羟色胺能神经元损失 >70%，并产生与焦虑相关的行为改变。这里使用的方案用于诱导 DRN 病变，但它对于想要在其他中线结构中进行立体定向注射的研究人员也很有用。此外，这种 DRN 5-羟色胺能神经元损伤小鼠模型为了解血清素能神经元在精神疾病（即 MDD 和 GAD）中的作用以及评估这些疾病的潜在神经保护剂或治疗策略提供了有价值的工具。

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研究方案

所有外科手术和动物护理程序均已获得中国上海同济大学生命科学与技术学院动物委员会的批准。

1. 动物的饲养

1. 在 12 小时/12 小时的光照/黑暗循环下，将雄性 C57BL/6NCrl 小鼠（10 周龄，25 g，n = 21）维持在标准条件（24°C 温度;55% 湿度）中。
2. 随意提供食物和水。
   注意：在这里，其中三只鼠标用于确认针迹。

2. 试剂的制备

注：所有药物制备步骤必须在层流罩中进行，以避免污染。所有制备的溶液均储存在 -80 °C 冰箱中。建议一次使用一份等分试样，完全解冻，使用前充分混合，将管内剩余部分丢弃，避免反复冻融。

1. 将 0.25 g 盐酸地昔帕明溶于 100 mL 0.9% 盐水中，得到 2.5 mg/mL 溶液。使用具有 0.22 μm 孔径亲水性 PES 膜的注射器过滤器对溶液进行消毒。然后，将溶液（1.8 mL/管）分装在 2 mL 微量离心机 （EP） 管中。标记、日期并立即储存在 -80 °C 冰箱中。动物用的推荐剂量为 25 mg/kg。
2. 将 5 mg 5,7-DHT 溶于 1.67 mL 含 0.1% 抗坏血酸的 0.9% 盐水中，得到 3 μg/μL 溶液。轻轻涡旋混合，使用注射器过滤器（孔径 0.22 μm）对溶液进行消毒，并将溶液（10 μL/管）分装在 0.5 mL EP 管中。标记、日期并立即在 -80 °C 下冷冻。动物用的推荐剂量为 2 μL/小鼠。
3. 按照前面描述的方法溶解酮洛芬（镇痛药）¹⁷。将 250 mg 酮洛芬溶于 15 mL 水和 1 mL 1 M NaOH 中，将 pH 值调节至 7.3 并将最终体积补足至 125 mL，最终浓度为 2 mg/mL。使用 0.22 μm 注射器过滤器对溶液进行消毒，并将溶液（0.4 mL/管）分装在 1.5 mL EP 管中。标记、注明日期并在 -80 °C 下冷冻直至使用。动物用的推荐剂量为 5 mg/kg。

3. 仪器和小鼠的制备

1. 准备一个手术包（包括一把手术刀、一对组织镊子、一把剪刀、持针器、3-0 缝合线、耳标和耳标涂抹器），事先在高温高压灭菌器中消毒。使用带有 32 G 针头和 1 cc 注射器的汉密尔顿注射器，将 75% 乙醇、聚维酮碘、3% 过氧化氢、载体溶液（0.1% 抗坏血酸溶于 0.9% 盐水）、棉签、氧氟沙星眼膏和小鼠恢复笼放在加热垫顶部。
2. h 在 5,7-DHT 注射之前，称重并记录小鼠的体重，然后让它们腹膜内 （ip） 注射地昔帕明 （2.5 mg/mL，10 μL/g 重量）。
   注意：在 5,7-DHT 注射前 1 小时施用地昔帕明的目的是防止脱氢胆胺能细胞丢失¹⁸。
3. 使用异氟醚吸入麻醉麻醉小鼠（诱导期间为 3%，维持期间为 1.5%，流速 = 2 L/min）。通过皮下 （sc） 注射给予酮洛芬（2 mg/mL，2.5 μL/g 重量）。通过没有尾部捏合反应来确认足够的麻醉深度。

4. 立体定向注射

1. 将麻醉的鼠标放在立体定位平台上，然后用立体定位器的耳杆和门牙杆固定其头部。
2. 剃掉老鼠的头，然后用 75% 乙醇擦洗一次清洁裸露的头皮，然后用聚维酮碘擦洗一次。
3. 使用棉签将利多卡因软膏涂抹在头皮上，以提供局部镇痛。将氧氟沙星眼膏涂在眼睛上，以保护角膜。
4. 使用手术刀从眼睛后 1 毫米到耳间线沿中线在头皮上切开。
5. 使用浸有 3% 过氧化氢的棉签去除骨膜，然后擦干颅骨并露出颅缝。标记前囟和 lambda 的位置。
6. 使用切牙杆调整头部位置，直到前囟和 lambda 位于同一水平面上。调整针尖接触前囟或 lamb，记录内侧/外侧 （ML） 和背侧/腹侧 （DV） 坐标，调整门牙杆，使前囟和 lambda 的 DV 和 ML 坐标分别相等。
7. 解锁垂直定位按钮并锁定螺钉，然后将机械手臂（z 轴）在前/后 （AP） 方向上设置为 30°，如图 1A、B。锁定按钮。
8. 将装有 2 μL 5,7-DHT （3 μg/μL） 的 Hamilton 注射器固定在支架上（对于假手术组，小鼠注射含有 0.1% 抗坏血酸的 0.9% 盐水）。调整针尖以接触前囟标志，然后使用数字显示模块将 ML、AP 和 DV 值归零。
   注：5,7-DHT 溶液为棕色液体，便于确定 Hamilton 注射器是否正确填充。如果无法访问数字显示模块，则记录针尖接触囟时在三个轴上显示的数字，最终坐标代表“记录的数字加上本协议中提供的坐标”。例如，如果 y 轴（A/P 方向）机械臂上记录的数字为“a”，则 A/P 方向的最终坐标应为“a - 6.27”。
9. 移动机械手臂以将针尖调整到注射位置（APa = -6.27，ML = 0;计算最终坐标的公式列于 图 1B 中）。使用记号笔标记目标位置。
10. 使用便携式微电机高速钻头钻出毛刺孔，然后移动机械臂，将针尖降低到目标 （DVa = -4.04）。将 2 μL 溶液缓慢（0.5 μL/3 分钟）注入大脑，将针头保持在原位再 5 分钟以防止溶液泄漏。注射后轻轻取下针头。
11. 使用 3-0 缝合线在切口上缝合。用浸泡在聚维酮碘中的棉签包裹缝合的切口，以避免感染。
12. 用聚维酮碘棉签清洁右耳，然后将消毒过的耳标贴在耳根进行识别。
13. 从立体定位装置中取出实验小鼠，并放入加热垫顶部的小鼠恢复笼中，直到观察到从麻醉中完全恢复。

5. 小鼠的术后护理

1. 让小鼠皮下注射酮洛芬 1 次/天，直至手术后 2 天。
2. 手术后 7 天内每天检查小鼠。

6. 高架 T 型迷宫试验

注意： 按照前面的^19,20 说明执行测试。

1. 确保高架 T 迷宫 （ETM） 测试由两个张开的手臂 （30 cm x 5 cm x 0.5 cm） 垂直于两个封闭的手臂 （30 cm x 5 cm x 16 cm x 0.5 cm） 组成，并带有一个中心平台 （5.0 cm x 5.0 cm x 0.5 cm）。其中一个封闭的臂被不透明的塑料片挡住，形成 T 形（图 2A）。
2. 在 ETM 测试前三天，通过每天处理 5 分钟来使动物适应。
3. 手术后第 30 天，进行 ETM 测试。
4. 在行为测试当天，将小鼠暴露于其中一个张开的手臂中 10 分钟。
5. 对于抑制回避测试，将每只小鼠放在封闭手臂的远端，并记录在三次试验中用四个爪子离开该手臂所需的时间。第一次试验是基线回避，第二次试验是回避 1，第三次试验是回避 2。
6. 在两次试验之间将小鼠放在笼子里 30 秒，并建立截止时间（这里，每次试验使用 300 秒）。

7. 灌注、固定、免疫组化染色和定量

1. 在研究结束时（手术后 35 天，行为测试后），一旦小鼠处于全身麻醉状态，进行全身灌注和固定。
   1. 按照步骤 3.3 中的说明麻醉鼠标。将深度麻醉的小鼠置于背卧。
   2. 用 75% 的酒精润湿整个腹侧区域的皮毛。
   3. 在胸骨下方切开一个，然后在胸腔上做一个 V 形切口。使用夹子抓住肋骨，露出心脏。
   4. 将静脉输液针插入左心室，然后立即用剪刀剪断心耳，让血液流出。
   5. 打开蠕动泵，通过循环系统将生理盐水灌注到全身。当流出右心房的液体变得清澈，并且肝脏颜色从红色变为淡红色时，从盐水切换到 4% 多聚甲醛 （PFA）。当小鼠尾巴移动时，再灌注 5 mL 4% PFA，身体僵硬。
      注意：小鼠尾巴摆动是充分灌注的标志。
2. 4% PFA 心内灌注后脑分离
   1. 用大剪刀将老鼠斩首，然后切开皮肤以露出头骨。
   2. 在颅骨底部（连接到颈部）做两个切口，沿着连接眼睛的线切一个，然后沿着矢状缝合线切开颅骨。用镊子抓住并向外剥离每个半球的头骨，露出大脑。
      注意：沿矢状缝线切割颅骨必须小心进行，否则大脑可能会受损并分成几部分。
   3. 取出大脑并将其置于 4% PFA 中，在 4°C 下过夜进行后固定，然后将大脑转移到 30% 蔗糖中，直到它沉到底部。
      注意：如果用振动切片机切割切片，则无需使用 30% 蔗糖脱水。
3. 包埋前，用纸巾吸收组织周围的多余液体。将脑组织嵌入 OCT 中，喙面位于卡盘上。
   注意：样品的方向很重要。大脑的喙面必须连接到卡盘上，以确保切削刃是尾部。
4. 使用低温恒温器以 30 μm 的厚度（四段间隔）切割 DRN 的冠状切片（前囟后 4.0-4.8 mm），并在 PBS 中收集切片。储存在 -20 °C 的脑切片冷冻保存溶液 （SCS） 中。
   注意：DRN 的识别非常重要。连续的解剖结构如图 3A-H 所示。特征结构如下：第四脑室的外侧凹陷（LR4V，图 3A、E 中的红色虚线）、第四脑室（4V，图 3B、F 中的红色虚线三角形）、第二小脑小叶（2Cb，图 3C/G 中的红色虚线菱形结构）和导水管（Aq，图 3D、H 中的红色虚线孔）。如图 3D、H 所示，当观察到结构时开始收集组织，然后切成 30 μm 厚的切片（四截面间隔）以产生总共 24 个冠状切片。切片的 H&E 染色如（图 3E-H）所示。将选择四个部分中每个部分的第四部分进行免疫荧光染色。其余部分存储在 SCS 中。如果难以识别结构，则在滑轨上安装一块截面会很有帮助。
5. 如前所述进行免疫组织化学测定^21,22。
6. 使用 ImageJ 对整个 DRN 中不同切片水平的 5-HT 阳性细胞进行计数。

8. 统计分析

1. 使用统计软件进行数据分析。将结果表示为 SEM ±平均值。
2. 通过双向方差分析或未配对 t 检验处理统计分析的值，并考虑 **p < 0.01 的显著差异。

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结果

在冠状切片中，DRN 的位置就在 SSS 和渡槽的下方（图 1B、C）;因此，使用标准程序靶向 DRN 会导致小鼠大量出血和高死亡率¹⁶。因此，这里使用倾斜方法而不是标准垂直方法进行立体定位注射，以避免损坏 SSS（图 1A、B）。为了确认针头进入大脑的位置，手术后立即处死接受立体定向注...

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讨论

该方案成功地描述了可靠的 DRN 血清素能神经元损伤小鼠模型的生产，该模型具有高病变重现性和低死亡率。以 DRN 为目标是一项复杂的任务，因为它会损坏位于 DRN¹⁶ 正上方的 SSS，并导致出血过多甚至死亡¹⁴。因此，通过将作臂在 AP 方向上设置为 30° 来进行立体定位注射，以避免损伤 SSS（图 1A、B）?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22micron syringe filter	Millipore	SLGPRB
3% hydrogen peroxide	Caoshanhu Co.,Ltd, Jiangxi, China
5,7-Dihydroxytryptamine	Sigma-Aldrich	SML2058	3ug/ul, 2ul
Compact small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd	R500 series
Cryostat	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	1:2,000
dapi	Sigma-Aldrich	D8417
desipramine hydrochloride	Sigma-Aldrich	PHR1723	25mg/kg
Eppendorf tube	Quality Scientific Plastics	509-GRD-Q
goat anti-5-HT antibody	Abcam	ab66047	1:800
GraphPad Prism	Graphpad Software Inc, CA, US
Hamilton Microliter syringe	Hamilton	87943
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	5mg/kg
L-ascorbic acid	BBI Life Sciences	A610021-0500	0.10%
lidocaine ointment	Tsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. Ltd	H20063466
ofloxacin eye ointment	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, China	H10940177
peristaltic pump	Huxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, China	HL-1D
stereotaxic apparatus	RWD Life Science Co., Ltd	68018
ultra-low temperature freezer	Haier	DW-86L388
Vortex	Kylin-bell	VORTEX-5