Eliminazione dei neuroni serotoninergici mediante iniezione stereotassica di 5,7-diidrossitriptamina nei nuclei dorsali del rafe dei topi

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modello murino lesionato dal nucleo del rafe dorsale (DRN) (tasso di sopravvivenza del >90% nei topi sperimentali) con perdita stabile di neuroni serotoninergici del rafe dorsale mediante iniezione stereotassica di 5,7-diidrossitriptamina nel DRN utilizzando un approccio angolato per prevenire lesioni al seno sagittale superiore.

Abstract

L'iniezione stereotassica è stata ampiamente utilizzata per la somministrazione diretta di composti o virus ad aree cerebrali mirate nei roditori. Il targeting diretto dei neuroni serotoninergici nel nucleo del rafe dorsale (DRN) può causare sanguinamento eccessivo e morte degli animali, a causa della sua posizione al di sotto del seno sagittale superiore (SSS). Questo protocollo descrive la generazione di un modello murino DRN serotoninergico con lesione neuronica (tasso di sopravvivenza del >90%) con perdita stabile del >70% di cellule 5-HT-positive nel DRN. La lesione è indotta dall'iniezione stereotassica di una neurotossina serotoninergica selettiva 5,7-diidrossitriptamina (5,7-DHT) nel DRN utilizzando un approccio angolato (30° in direzione anteriore/posteriore) per evitare lesioni all'SSS. I topi con lesione neuronica serotoninergica DRN mostrano alterazioni del comportamento associate all'ansia, il che aiuta a confermare il successo della chirurgia della lesione DRN. Questo metodo viene utilizzato qui per le lesioni DRN, ma può essere utilizzato anche per altre iniezioni stereotassiche che richiedono iniezioni angolari per evitare le strutture della linea mediana. Questo modello murino serotoninergico con lesione neuronica DRN fornisce uno strumento prezioso per comprendere il ruolo dei neuroni serotoninergici nella patogenesi dei disturbi psichiatrici, come il disturbo d'ansia generalizzato e il disturbo depressivo maggiore.

Introduzione

La serotonina, o 5-idrossitriptamina (5-HT), è un importante neurotrasmettitore prodotto principalmente nell'intestino e nel cervello e influisce su una varietà di funzioni psicologiche. Nel sistema nervoso centrale (SNC), il sistema serotoninergico svolge un ruolo centrale nella regolazione dell'umore e del comportamento sociale, del sonno e della veglia, dell'appetito, della memoria e del desiderio sessuale. Nel SNC, la serotonina è sintetizzata dai neuroni serotoninergici, che possono essere separati nei seguenti due gruppi: il gruppo rostrale, che ha proiezioni ascendenti che innervano praticamente tutto il cervello; e il gruppo caudale, che proietta principalmente al midollo spinale¹. Il gruppo rostrale, che contiene circa l'85% dei neuroni serotoninergici nel cervello, è composto dal nucleo lineare caudale, dal nucleo del rafe mediano e dal DRN, in cui si trova la più grande popolazione di neuroni serotoninergici nel cervello.

Si ritiene generalmente che la disregolazione del sistema serotoninergico sia collegata alla patogenesi del disturbo depressivo maggiore (MDD) e dei disturbi d'ansia generalizzati (GAD)². Ciò è dovuto al fatto che gli inibitori selettivi della ricaptazione della serotonina (SSRI) sono un trattamento farmacologico efficace per questi disturbi psichiatrici ^3,4. Inoltre, evidenze cumulative suggeriscono che la mania⁵ e il comportamento suicidario⁶ possono essere associati a livelli più bassi di serotonina nel DRN. È stato anche riportato che Pet1-Cre; I topi Lmx1b^flox/flox e i topi hTM-DTA^iPet1 (modelli genetici murini privi della maggior parte dei neuroni serotoninergici centrali rispettivamente^{dallo stadio} embrionale 7 avanzato e dall'età adulta⁸) mostrano una maggiore memoria contestuale della paura. Tuttavia, nonostante le ricerche approfondite, l'esatto coinvolgimento dei neuroni serotoninergici DRN in questi disturbi psichiatrici rimane da chiarire.

Al fine di esplorare i meccanismi attraverso i quali i neuroni serotoninergici DRN regolano la patogenesi dei disturbi psichiatrici associati alla serotonina, sono stati generati modelli animali. Gli strumenti optogenetici sono stati applicati per inibire i neuroni serotoninergici nella DRN di ratto e questi animali mostrano un aumento dei comportamenti ansiosi⁹. Tuttavia, l'optogenetica ha dei limiti. Ad esempio, un dispositivo di erogazione della luce deve essere impiantato nella regione mirata in profondità all'interno del cervello e il tessuto circostante può essere danneggiato durante l'intervento chirurgico di impianto o dal calore emesso dal dispositivo luminoso. Anche se l'alterazione della temperatura può non causare danni rilevabili al tessuto cerebrale, può comunque indurre notevoli effetti fisiologici e comportamentali¹⁰.

La manipolazione farmacologica può essere un approccio più semplice per creare modelli animali con lesioni neuronali serotoninergiche DRN. Alcuni gruppi hanno generato DRN ratti con lesioni neuronali serotoninergiche mediante microiniezione stereotassica di serotonina neurotossina 5,7-DHT nel DRN. Tuttavia, questi modelli di ratto mostrano diverse alterazioni comportamentali, come il comportamento ansiolitico¹¹, l'aumento del comportamento ansioso¹² e la compromissione della memoria oggettuale¹³. Nonostante molti studi sui ratti, sono stati condotti meno studi sulle influenze del 5,7-DHT sui topi. Un gruppo ha riportato un'eccessiva mortalità (>50%) e una limitata deplezione di serotonina nei topi sperimentali che hanno ricevuto microiniezioni stereotassiche di 5,7-DHT nel DRN¹⁴. Un altro gruppo ha riportato che lo stress cronico lieve imprevedibile (UCMS) può indurre una significativa alterazione della latenza di attacco nei topi con lesione DRN indotta da 5,7-DHT. Tuttavia, non sono stati forniti risultati istologici per confermare l'esatta perdita di neuroni serotoninergici nel DRN¹⁵. L'iniezione stereotassica nel DRN utilizzando procedure standard può portare a sanguinamento massiccio e ad un'elevata mortalità per i topi, dato che la posizione anatomica del DRN è inferiore all'SSS¹⁶.

Questo protocollo descrive il protocollo per generare un modello murino DRN serotoninergico con lesione neuronica (tasso di sopravvivenza del >90% dei topi sperimentali) con perdita stabile di neuroni serotoninergici DRN mediante iniezione stereotassica di 5,7-DHT. L'iniezione in DRN utilizza un approccio angolato per prevenire la lesione dell'SSS. Questo intervento chirurgico causa costantemente una perdita del >70% di neuroni serotoninergici nel DRN dei topi e produce alterazioni del comportamento associate all'ansia. Il protocollo utilizzato qui è per indurre lesioni DRN, ma può anche essere utile ai ricercatori che desiderano eseguire iniezioni stereotassiche in altre strutture della linea mediana. Inoltre, questo modello murino con lesione neuronale serotoninergica DRN fornisce uno strumento prezioso per comprendere il ruolo dei neuroni serotoninergici nei disturbi psichiatrici (ad esempio, MDD e GAD) e valutare potenziali agenti neuroprotettivi o strategie terapeutiche per queste condizioni.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutti gli interventi chirurgici e le procedure di cura degli animali sono stati approvati dal Comitato per gli animali della School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai, Cina.

1. Stabulazione degli animali

1. Mantenere i topi maschi C57BL/6NCrl (10 settimane di età, 25 g, n = 21) in condizioni standard (temperatura 24 °C; 55% di umidità) con un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore.
2. Fornire cibo e acqua ad libitum.
   NOTA: Qui, tre dei mouse vengono utilizzati per confermare la traccia dell'ago.

2. Preparazione dei reagenti

NOTA: Tutte le fasi di preparazione del farmaco devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Tutte le soluzioni preparate sono conservate in un congelatore a -80 °C. Si consiglia di utilizzare un'aliquota alla volta, scongelare completamente, mescolare bene prima dell'uso, scartare gli avanzi nel tubo ed evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.

1. Sciogliere 0,25 g di desipramina cloridrato in 100 mL di soluzione fisiologica allo 0,9% per ottenere una soluzione di 2,5 mg/mL. Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro per siringa con membrana in PES idrofila di 0,22 μm. Quindi, aliquotare la soluzione (1,8 mL/provetta) in provette da microcentrifuga (EP) da 2 mL. Etichettare, datare e conservare immediatamente in congelatore a -80 °C. Il dosaggio raccomandato per uso animale è di 25 mg/kg.
2. Sciogliere 5 mg di 5,7-DHT in 1,67 mL di soluzione fisiologica allo 0,9% contenente acido ascorbico allo 0,1% per ottenere una soluzione da 3 μg/μL. Agitare delicatamente per mescolare, sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro per siringa (dimensione dei pori di 0,22 μm) e aliquotare la soluzione (10 μL/provetta) in provette EP da 0,5 mL. Etichettare, datare e congelare immediatamente a -80 °C. Il dosaggio raccomandato per l'uso animale è di 2 μL/topo.
3. Sciogliere il ketoprofene (analgesico) seguendo il metodo¹⁷ precedentemente descritto. Sciogliere 250 mg di ketoprofene in 15 mL di acqua e 1 mL di 1 M NaOH, regolare il pH a 7,3 e portare il volume finale a 125 mL, che si tradurrà in una concentrazione finale di 2 mg/mL. Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,22 μm e aliquotare la soluzione (0,4 mL/provetta) in provette EP da 1,5 mL. Etichettare, datare e congelare a -80 °C fino al momento dell'uso. Il dosaggio raccomandato per uso animale è di 5 mg/kg.

3. Preparazione di strumenti e mouse

1. Preparare un pacchetto chirurgico (contenente un bisturi, un paio di pinze per tessuti, un paio di forbici, porta aghi, punti di sutura 3-0, marchi auricolari e applicatore di marchi auricolari) precedentemente sterilizzato in autoclavi ad alta temperatura. Posizionare il 75% di etanolo, lo iodio povidone, il 3% di perossido di idrogeno, la soluzione del veicolo (0,1% di acido ascorbico in soluzione fisiologica allo 0,9%), un batuffolo di cotone, un unguento per gli occhi di ofloxacina e una gabbia di recupero per topi sopra un termoforo, utilizzando una siringa Hamilton con un ago da 32 G e una siringa da 1 cc.
2. h prima dell'iniezione di 5,7-DHT, pesare e registrare il peso corporeo dei topi, quindi sottoporli a iniezioni intraperitoneali (i.p.) di desipramina (2,5 mg/mL, 10 μL/g di peso).
   NOTA: Lo scopo della somministrazione di desipramina 1 ora prima dell'iniezione di 5,7-DHT è prevenire la perdita di cellule catacolaminergiche¹⁸.
3. Anestetizzare i topi utilizzando l'anestesia per inalazione con isoflurano (3% durante l'induzione, 1,5% durante il mantenimento, portata = 2 L/min). Somministrare ketoprofene (2 mg/mL, 2,5 μL/g di peso) tramite iniezione sottocutanea (s.c.). Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia dall'assenza di risposta al pizzicamento della coda.

4. Iniezione stereotassica

1. Posizionare il topo anestetizzato sulla piattaforma stereotassica, quindi fissare la testa con le barre auricolari e la barra incisiva dell'apparato stereotassico.
2. Radere la testa del topo, quindi pulire il cuoio capelluto esposto con uno scrub di etanolo al 75% seguito da uno scrub di iodio povidone.
3. Applicare l'unguento alla lidocaina sul cuoio capelluto utilizzando un batuffolo di cotone per fornire analgesia locale. Metti l'unguento per gli occhi di ofloxacina sugli occhi per proteggere la cornea.
4. Praticare un'incisione sul cuoio capelluto lungo la linea mediana utilizzando un bisturi da 1 mm posteriormente agli occhi fino alla linea interaurale.
5. Utilizzare un tampone imbevuto di perossido di idrogeno al 3% per rimuovere il periostio, quindi asciugare il cranio ed esporre le suture craniche. Segna la posizione della bregma e della lambda.
6. Regolare la posizione della testa utilizzando la barra incisiva fino a quando la bregma e la lambda non si trovano sullo stesso piano orizzontale. Regolare la punta dell'ago in modo che tocchi la bregma o la lambda, registrare le coordinate mediale/laterale (ML) e dorsale/ventrale (DV) e regolare la barra degli incisivi in modo che le coordinate DV e ML di bregma e lambda siano uguali, rispettivamente.
7. Sbloccare il pulsante di posizionamento perpendicolare e la vite di bloccaggio, quindi impostare il braccio del manipolatore (asse z) su 30° nella direzione anteriore/posteriore (AP) come mostrato nella Figura 1A, B. Blocca il pulsante.
8. Fissare la siringa Hamilton riempita con 2 μL di 5,7-DHT (3 μg/μL) sul supporto (per il gruppo sham, i topi vengono iniettati con soluzione fisiologica allo 0,9% contenente acido ascorbico allo 0,1%). Regolare la punta dell'ago in modo che tocchi il punto di riferimento bregma, quindi azzerare i valori ML, AP e DV utilizzando il modulo display digitale.
   NOTA: La soluzione di 5,7-DHT è un liquido di colore marrone, il che rende facile determinare se la siringa Hamilton è riempita correttamente. Se non è possibile accedere a un modulo di visualizzazione digitale, registrare il numero visualizzato su tre assi quando la punta dell'ago tocca il bregma e le coordinate finali rappresentano "il numero registrato più le coordinate fornite in questo protocollo". Ad esempio, se il numero registrato sul braccio del manipolatore dell'asse y (direzione A/P) è "a", la coordinata finale nella direzione A/P dovrebbe essere "a - 6,27".
9. Spostare il braccio del manipolatore per regolare la punta dell'ago nella posizione di iniezione (APa = -6,27, ML = 0; la formula per il calcolo delle coordinate finali è elencata nella Figura 1B). Segnare la posizione di destinazione utilizzando un pennarello.
10. Praticare il foro di fresatura utilizzando un trapano portatile ad alta velocità con micromotore, quindi spostare il braccio del manipolatore per abbassare la punta dell'ago sul bersaglio (DVa = -4,04). Iniettare lentamente 2 μL di soluzione nel cervello (0,5 μL/3 min), mantenendo l'ago in situ per altri 5 minuti per evitare perdite di soluzione. Rimuovere delicatamente l'ago dopo l'iniezione.
11. Applicare le suture interrotte sull'incisione utilizzando le suture 3-0. Avvolgere l'incisione suturata con un batuffolo di cotone imbevuto di iodio povidone per evitare infezioni.
12. Pulire l'orecchio destro con un batuffolo di cotone povidone-iodio, quindi applicare il marchio auricolare sterilizzato alla base dell'orecchio per l'identificazione.
13. Rimuovere i topi sperimentali dall'apparato stereotassico e metterli in una gabbia di recupero per topi sopra un termoforo fino a quando non si osserva il completo recupero dall'anestesia.

5. Cura postoperatoria dei topi

1. Sottoporre i topi a iniezioni s.c. di ketoprofene 1 volta/die fino a 2 giorni dopo l'intervento chirurgico.
2. Ispezionare i topi ogni giorno fino a 7 giorni dopo l'intervento.

6. Test del labirinto a T elevato

NOTA: Eseguire il test come descritto in precedenza ^19,20.

1. Assicurarsi che il test del labirinto a T rialzato (ETM) sia composto da due braccia aperte (30 cm x 5 cm x 0,5 cm) perpendicolari a due braccia chiuse (30 cm x 5 cm x 16 cm x 0,5 cm) con una piattaforma centrale (5,0 cm x 5,0 cm x 0,5 cm). Uno dei bracci chiusi è bloccato da un foglio di plastica opaca per formare una forma a T (Figura 2A).
2. Tre giorni prima del test ETM, abituare gli animali maneggiandoli quotidianamente per 5 minuti.
3. Il giorno 30 dopo l'intervento, eseguire il test ETM.
4. Il giorno del test comportamentale, esporre i topi a una delle braccia aperte per 10 minuti.
5. Per il test di evitamento inibitorio, posizionare ciascun topo nell'estremità distale del braccio chiuso e registrare il tempo impiegato per lasciare questo braccio con quattro zampe in tre prove. Il primo processo è l'evitamento di base, il secondo processo è l'evitamento 1 e il terzo processo è l'evitamento 2.
6. Tenere i topi nelle loro gabbie per 30 secondi tra un percorso e l'altro e stabilire un tempo limite (qui, 300 secondi vengono utilizzati per ogni prova).

7. Perfusione, fissazione, colorazione immunoistochimica e quantificazione

1. Alla fine dello studio (35 giorni dopo l'intervento chirurgico, dopo il test comportamentale), eseguire la perfusione e la fissazione di tutto il corpo una volta che il topo è in anestesia generale.
   1. Anestetizzare il mouse come descritto al punto 3.3. Posizionare il topo profondamente anestetizzato in decubito dorsale.
   2. Bagnare il pelo con alcool al 75% su tutta la zona ventrale.
   3. Fai un taglio sotto lo sterno seguito da un'incisione a forma di V nella gabbia toracica. Afferrare la gabbia toracica usando il morsetto per esporre il cuore.
   4. Inserire l'ago per infusione venosa nel ventricolo sinistro, quindi tagliare immediatamente l'appendice atriale con le forbici per far defluire il sangue.
   5. Accendere la pompa peristaltica per perfondere soluzione salina in tutto il corpo attraverso il sistema circolatorio. Passa dalla soluzione salina alla paraformaldeide al 4% (PFA) quando il liquido che esce dall'atrio destro diventa limpido e quando il fegato cambia da rosso a rosso pallido. Perfondere altri 5 ml di PFA al 4% quando la coda del topo si muove e il corpo è rigido.
      NOTA: L'ondeggiare della coda del topo è il segno di un'adeguata perfusione.
2. Isolamento del cervello dopo perfusione intracardiaca con PFA al 4%
   1. Decapita il topo usando grandi forbici, quindi taglia la pelle per esporre il cranio.
   2. Fai due tagli alla base del cranio (collegati al collo), fai un taglio lungo la linea che collega gli occhi, quindi taglia il cranio lungo la sutura sagittale. Afferra e stacca il cranio di ciascun emisfero verso l'esterno per esporre il cervello usando una pinza.
      NOTA: Il taglio del cranio lungo la sutura sagittale deve essere eseguito con attenzione, altrimenti il cervello potrebbe essere danneggiato e separato in parti.
   3. Rimuovere il cervello e metterlo in PFA al 4% a 4 °C durante la notte per la post-fissazione, quindi trasferire il cervello in saccarosio al 30% fino a quando non affonda sul fondo.
      NOTA: La disidratazione con saccarosio al 30% non è necessaria se le sezioni vengono tagliate con un vibratomo.
3. Assorbire il liquido in eccesso intorno al fazzoletto utilizzando un tovagliolo di carta prima dell'inclusione. Incorporare il tessuto cerebrale nell'OCT con la faccia rostrale sul mandrino.
   NOTA: L'orientamento del campione è importante. La faccia rostrale del cervello deve essere attaccata al mandrino per assicurarsi che il tagliente sia la parte caudale.
4. Tagliare una sezione coronale del DRN (4,0-4,8 mm posteriormente da bregma) a uno spessore di 30 μm (intervalli di quattro sezioni) utilizzando un criostato e raccogliere le sezioni in PBS. Conservare nella soluzione di crioconservazione (SCS) della sezione cerebrale a -20 °C.
   NOTA: L'identificazione del DRN è molto importante. Le strutture anatomiche consecutive sono mostrate come Figura 3A-H. Le strutture caratteristiche sono le seguenti: recesso laterale del quarto ventricolo (LR4V, linea del trattino rosso nella Figura 3A,E), quarto ventricolo (4V, triangolo del trattino rosso nella Figura 3B,F), secondo lobulo cerebellare (2Cb, struttura a forma di diamante del trattino rosso nella Figura 3C/G) e acquedotto (Aq, foro del trattino rosso nella Figura 3D,H). Iniziare a raccogliere i tessuti quando si osservano le strutture, come mostrato nella Figura 3D,H, quindi tagliare in sezioni spesse 30 μm (intervalli di quattro sezioni) per ottenere 24 sezioni coronali totali. La colorazione H&E delle sezioni è mostrata in (Figura 3E–H). La quarta sezione di ciascuna delle quattro sezioni sarà selezionata per eseguire la colorazione in immunofluorescenza. Le sezioni rimanenti vengono memorizzate nel SCS. Se è difficile riconoscere le strutture, è utile montare un pezzo delle sezioni sulla guida.
5. Eseguire il test immunoistochimico come descritto in precedenza^21,22.
6. Conta le cellule 5-HT-positive a diversi livelli di sezione nell'intero DRN utilizzando ImageJ.

8. Analisi statistica

1. Utilizzare software statistici per l'analisi dei dati. Esprimi i risultati come mezzi ± SEM.
2. Elaborare i valori per l'analisi statistica mediante ANOVA a due vie o t-test non accoppiato e considerare le differenze significative a **p < 0,01.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

In una sezione coronale, la posizione del DRN è appena sotto l'SSS e l'acquedotto (Figura 1B,C); pertanto, il targeting del DRN utilizzando procedure standard può portare a sanguinamento massiccio e ad un'elevata mortalità nei topi¹⁶. Pertanto, le iniezioni stereotassiche sono state eseguite utilizzando un approccio angolato invece dell'approccio verticale standard per evitare danni all'SSS (Fi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Questo protocollo descrive con successo la produzione di un modello murino affidabile DRN con lesione neuronica serotoninergica con elevata riproducibilità delle lesioni e basso tasso di mortalità. Prendere di mira il DRN è un compito complesso, poiché può danneggiare l'SSS situato appena sopra il DRN¹⁶ e portare a sanguinamento eccessivo e persino alla morte¹⁴. Pertanto, le iniezioni stereotassiche sono state eseguite impostando il br...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22micron syringe filter	Millipore	SLGPRB
3% hydrogen peroxide	Caoshanhu Co.,Ltd, Jiangxi, China
5,7-Dihydroxytryptamine	Sigma-Aldrich	SML2058	3ug/ul, 2ul
Compact small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd	R500 series
Cryostat	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	1:2,000
dapi	Sigma-Aldrich	D8417
desipramine hydrochloride	Sigma-Aldrich	PHR1723	25mg/kg
Eppendorf tube	Quality Scientific Plastics	509-GRD-Q
goat anti-5-HT antibody	Abcam	ab66047	1:800
GraphPad Prism	Graphpad Software Inc, CA, US
Hamilton Microliter syringe	Hamilton	87943
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	5mg/kg
L-ascorbic acid	BBI Life Sciences	A610021-0500	0.10%
lidocaine ointment	Tsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. Ltd	H20063466
ofloxacin eye ointment	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, China	H10940177
peristaltic pump	Huxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, China	HL-1D
stereotaxic apparatus	RWD Life Science Co., Ltd	68018
ultra-low temperature freezer	Haier	DW-86L388
Vortex	Kylin-bell	VORTEX-5