マウス背側縫線核における5,7-ジヒドロキシトリプタミンの定位注射によるセロトニン作動性ニューロンの排除

要約

このプロトコルは、背側縫線核 (DRN) 病変マウス モデル (実験マウスで >90% の生存率) を安定して失う 5,7-ジヒドロキシトリプタミンを DRN に定位注射することにより、上矢状洞の損傷を防ぐための角度付きアプローチを使用して、背側縫線セロトニン作動性ニューロンを安定して失うマウス モデルについて説明します。

要約

定位固定剤注射は、げっ歯類の標的脳領域に化合物やウイルスを直接送達するために広く使用されています。背側縫線核(DRN)のセロトニン作動性ニューロンを直接標的とすると、上矢状静脈洞(SSS)の下に位置しているため、過度の出血や動物の死を引き起こす可能性があります。このプロトコルは、DRN の >70% 5-HT 陽性細胞が安定して失われる DRN セロトニン作動性ニューロン病変マウス モデル (>90% 生存率) の生成について説明しています。病変は、SSS の損傷を避けるために、角度付きアプローチ (前後方向に 30°) を使用して、選択的セロトニン作動性神経毒 5,7-ジヒドロキシトリプタミン (5,7-DHT) を DRN に定位固定装置で注入することによって誘発されます。DRNセロトニン作動性ニューロン損傷マウスは、不安に関連する行動変化を示し、DRN病変手術の成功を確認するのに役立ちます。この方法はここではDRN病変に使用されますが、正中線構造を避けるために角注射を必要とする他の脳定位注射にも使用できます。このDRNセロトニン作動性ニューロン病変マウスモデルは、全般性不安障害や大うつ病性障害などの精神疾患の病因におけるセロトニン作動性ニューロンの役割を理解するための貴重なツールを提供します。

概要

セロトニン、または5-ヒドロキシトリプタミン(5-HT)は、主に腸と脳で産生される重要な神経伝達物質であり、さまざまな心理的機能に影響を与えます。中枢神経系(CNS)では、セロトニン作動系が気分や社会行動、睡眠と覚醒、食欲、記憶、性欲の調節に中心的な役割を果たしています。中枢神経系では、セロトニンはセロトニン作動性ニューロンによって合成され、セロトニン作動性ニューロンは次の2つのグループに分けることができます。尾側グループは、主に脊髄に突出しています¹。脳内のセロトニン作動性ニューロンの約85%を含む吻側グループは、尾側線状核、正中縫線核、および脳内のセロトニン作動性ニューロンの最大の集団が位置するDRNで構成されています。

セロトニン作動系の調節不全は、一般に、大うつ病性障害(MDD)および全般性不安障害(GAD)²の病因と関連していると考えられています。これは、選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)がこれらの精神疾患に対する有効な薬理学的治療であるという事実によるものです^3,4。さらに、蓄積された証拠は、躁病⁵および自殺行動⁶がDRNにおけるセロトニン機能の低下と関連している可能性があることを示唆している。また、Pet1-Cre;Lmx1b^flox/floxマウスおよびhTM-DTA^iPet1マウス(それぞれ後期胚期⁷および成人期⁸からの中心的なセロトニン作動性ニューロンをほとんど欠く遺伝マウスモデル)は、文脈上の恐怖記憶の増強を示す。しかし、広範な研究にもかかわらず、これらの精神障害におけるDRNセロトニン作動性ニューロンの正確な関与はまだ解明されていません。

DRNセロトニン作動性ニューロンがセロトニン関連精神疾患の病因を制御するメカニズムを探るために、動物モデルが作成されました。光遺伝学的ツールは、ラットDRNのセロトニン作動性ニューロンを阻害するために適用されており、これらの動物は不安様行動の増加を示します⁹。ただし、オプトジェネティクスには限界があります。例えば、脳の深部にある標的領域に光送達装置を埋め込む必要があり、移植手術中や光装置から放出される熱によって周囲の組織が損傷を受ける可能性があります。温度変化が検出可能な脳組織の損傷を引き起こさない場合でも、顕著な生理学的および行動的影響を誘発する可能性があります¹⁰。

薬理学的操作は、DRNセロトニン作動性ニューロン損傷動物モデルを作成するためのより簡単なアプローチである可能性があります。一部のグループは、DRN中のセロトニン神経毒5,7-DHTの定位マイクロインジェクションにより、DRNセロトニン作動性ニューロン損傷ラットを作製しました。しかし、これらのラットモデルは、抗不安行動¹¹、不安様行動の増加¹²、物体記憶^障害13など、異なる行動変化を示す。ラットでの多くの研究にもかかわらず、マウスに対する5,7-DHTの影響について行われた研究は少ないです。1つのグループは、^DRN14で5,7-DHTの定位固定マイクロインジェクションを受けた実験マウスで過剰な死亡率(>50%)と限られたセロトニン枯渇を報告しました。別のグループは、予測不可能な慢性軽度ストレス (UCMS) が、5,7-DHT 誘発性 DRN 病変マウスに重大な攻撃潜伏時間の変化を誘発する可能性があることを報告しました。しかし、DRN¹⁵における正確なセロトニン作動性ニューロンの喪失を確認するための組織学的結果は提供されなかった。標準的な手順を使用したDRNへの定位固定装置注射は、DRNの解剖学的位置がSSS¹⁶より下にあるという事実を考えると、マウスに大量の出血と高い死亡率をもたらす可能性があります。

このプロトコルは、5,7-DHTの定位固定注射によってDRNセロトニン作動性ニューロンの安定した損失を伴うDRNセロトニン作動性ニューロン損傷マウスモデル(実験マウスの>90%の生存率)を生成するためのプロトコルを説明しています。DRNへの注入は、SSSの損傷を防ぐために角度付きアプローチを使用します。この手術は、マウスのDRNでセロトニン作動性ニューロンの>70%の喪失を一貫して引き起こし、不安に関連する行動の変化を引き起こします。ここで使用されるプロトコルは、DRN病変を誘発するためのものですが、他の正中線構造で定位固定装置注射を行いたい研究者にとっても有用です。さらに、このDRNセロトニン作動性ニューロン病変マウスモデルは、精神疾患(すなわち、MDDおよびGAD)におけるセロトニン作動性ニューロンの役割を理解し、これらの疾患に対する潜在的な神経保護剤または治療戦略を評価するための貴重なツールを提供します。

プロトコル

すべての外科的介入と動物の世話の手順は、中国上海の同済大学生命科学技術学部の動物委員会によって承認されています。

1.動物の飼育

1. 雄のC57BL/6NCrlマウス(10週齢、25g、n = 21)を標準条件(温度24°C、湿度55%)で12時間/12時間の明暗サイクルで維持します。
2. 食べ物 と水を自由に提供します。
   注:ここでは、針の軌跡を確認するために3匹のマウスを使用しています。

2. 試薬の調製

注:すべての薬物調製ステップは、汚染を避けるために層流フードで実行する必要があります。調製した溶液はすべて-80°Cの冷凍庫で保存します。一度に1つのアリコートを使用し、完全に解凍し、使用前によく混合し、チューブ内の残り物を廃棄し、凍結と解凍の繰り返しを避けることをお勧めします。

1. 0.25 gの塩酸デシプラミンを100 mLの0.9%生理食塩水に溶解して、2.5 mg / mL溶液を生成します。.0.22 μmの孔径の親水性PESメンブレンを備えたシリンジフィルターを使用して溶液を滅菌します。次に、溶液(1.8 mL/チューブ)を2 mLの微量遠心分離機(EP)チューブに分注します。ラベルを貼り、日付を記入し、すぐに-80°Cの冷凍庫に保管してください。動物用として推奨される用量は25 mg / kgです。.
2. 5 mgの5,7-DHTを0.1%アスコルビン酸を含む0.9%生理食塩水1.67 mLに溶解して、3 μg/μL溶液を生成します。穏やかにボルテックスして混合し、シリンジフィルター(0.22 μmの孔径)を使用して溶液を滅菌し、0.5 mL EPチューブに溶液(10 μL/チューブ)を分注します。ラベルを貼り、日付を記入し、すぐに-80°Cで凍結します。動物用として推奨される投与量は、2μL/マウスです。
3. ケトプロフェン(鎮痛剤)を前述の方法¹⁷に従って溶解する。250 mgのケトプロフェンを15 mLの水と1 mLの1 M NaOHに溶解し、pHを7.3に調整し、最終容量を125 mLにすると、最終濃度は2 mg / mLになります。.0.22 μmシリンジフィルターを使用して溶液を滅菌し、溶液(0.4 mL/チューブ)を1.5 mL EPチューブに分注します。ラベルを貼り、日付を記入し、使用するまで-80°Cで凍結します。動物用として推奨される投与量は5mg/kgです。

3. 器具・マウスの調製

1. 高温オートクレーブで滅菌したサージカルパック(メス、組織鉗子一対、ハサミ一対、ニードルホルダー、3-0縫合糸、イヤータグ、イヤータグアプリケーター)を準備します。75%エタノール、ポビドンヨード、3%過酸化水素、ビヒクル溶液(0.9%生理食塩水に0.1%アスコルビン酸)、綿棒、オフロキサシン眼軟膏、マウス回復ケージを加熱パッドの上に置きます、32G針と1ccの注射器を備えたハミルトン注射器を使用します。
2. h5,7-DHT注射の前に、マウスの体重を量って記録し、次にマウスを腹腔内(i.p.)注射にかけますデシプラミン(2.5 mg / mL、10 μL / g重量)。.
   注:5,7-DHT注射の1時間前にデシプラミンを投与する目的は、カタコラミン作動性細胞の損失を防ぐことです¹⁸。
3. イソフルラン吸入麻酔を使用してマウスに麻酔をかけます(導入時3%、メンテナンス時1.5%、流量= 2 L / min)。ケトプロフェン(2 mg / mL、2.5 μL / g重量)を皮下(皮下)注射で投与します。.テールピンチ反応がないことで、適切な麻酔深度を確認します。

4. 脳定位固定装置注射

1. 麻酔をかけたマウスを定位固定装置プラットフォームに置き、その頭を定位固定装置の耳棒と切歯棒に固定します。
2. マウスの頭を剃り、露出した頭皮を75%エタノールのスクラブ1回とそれに続くポビドンヨードのスクラブで清掃します。
3. 綿棒を使用して頭皮にリドカイン軟膏を塗布し、局所鎮痛剤を提供します。.角膜を保護するために、オフロキサシン眼軟膏を目に塗ります。
4. メスを使用して、目から目と耳間線まで1mm後方からメスを使用して、正中線に沿って頭皮を切開します。
5. 3%過酸化水素に浸した綿棒を使用して骨膜を切除し、頭蓋骨を乾燥させて頭蓋縫合糸を露出させます。ブレグマとラムダの位置をマークします。
6. 切歯バーを使用して、ブレグマとラムダが同じ水平面に配置されるまでヘッドの位置を調整します。針先をブレグマまたはラムダに接触するように調整し、内側/外側(ML)と背/腹(DV)の座標を記録し、ブレグマとラムダのDVとMLの座標がそれぞれ等しくなるように切歯バーを調整します。
7. 垂直位置決めボタンのロックを解除してネジをロックし、 図1A、Bに示すように、マニピュレーターアーム(z軸)を前後(AP)方向に30°に設定します。ボタンをロックします。
8. 2 μL の 5,7-DHT (3 μg/μL) を充填したハミルトンシリンジをホルダーに固定します (偽グループの場合、マウスに 0.1% アスコルビン酸を含む 0.9% 生理食塩水を注入します)。針先をブレグマランドマークに接触するように調整し、デジタルディスプレイモジュールを使用してML、AP、およびDVの値をゼロにします。
   注:5,7-DHT溶液は茶色の液体であるため、ハミルトンシリンジが適切に充填されているかどうかを簡単に判断できます。デジタル表示モジュールにアクセスできない場合は、針先がブレグマに触れたときに3軸に表示される数字を記録し、最終的な座標は「記録された数字にこのプロトコルで提供される座標を加えたもの」を表します。例えば、y軸(A/P方向)のマニピュレータアームに記録された数字が「a」の場合、A/P方向の最終的な座標は「a-6.27」となります。
9. マニピュレーターアームを動かして、針先を射出位置に調整します(APa = -6.27、ML = 0、最終座標の計算式を 図1Bに示します)。マーカーペンで目標の位置をマークします。
10. ポータブルマイクロモーター高速ドリルでバリ穴をあけ、マニピュレーターアームを動かして針先をターゲットまで下げます(DVa=-4.04)。2 μLの溶液をゆっくりと脳に注入し(0.5 μL / 3分)、針をさらに5分間その場に保ち、溶液の漏れを防ぎます。注射後は針をやさしく取り外してください。
11. 3-0縫合糸を使用して、切開部に中断された縫合糸を適用します。縫合した切開部をポビドンヨードに浸した綿棒で包み、感染を防ぎます。
12. ポビドンヨード綿棒で右耳をきれいにし、滅菌したイヤータグを耳の付け根に貼り付けて識別します。
13. 実験マウスを定位固定装置から取り出し、麻酔からの完全な回復が観察されるまで、加熱パッドの上のマウス回復ケージに入れます。

5. マウスの術後ケア

1. 手術後 2 日まで、マウスにケトプロフェンの 1 回/日 1 回注射を投与します。
2. 手術後7日まで毎日マウスを検査します。

6.高架T迷路テスト

注:前述の^19,20で説明したようにテストを実行します。

1. 高架式T迷路(ETM)テストが、中央のプラットフォーム(5.0 cm x 5.0 cm x 0.5 cm)を備えた2つの密閉アーム(30 cm x 5 cm x 16 cm x 0.5 cm)に対して垂直な2つのオープンアーム(30 cm x 5 cm x 0.5 cm)で構成されていることを確認します。囲まれたアームの1つは、不透明なプラスチックシートでブロックされてT字型を形成します(図2A)。
2. ETMテストの3日前に、毎日5分間取り扱い、動物を慣れさせます。
3. 手術後30日目に、ETMテストを実施します。
4. 行動試験の日には、マウスを開いた腕の1つに10分間さらします。
5. 抑制性回避試験では、各マウスを囲まれた腕の遠位端に配置し、3回の試行で4つの前足でこの腕を離れるのにかかった時間を記録します。最初の試行はベースライン回避、2 番目の試行は回避 1、3 番目の試行は回避 2 です。
6. マウスをトレイル間で30秒間ケージに入れ、カットオフ時間を設定します(ここでは、各試行に300秒を使用します)。

7. 灌流、固定、免疫組織化学染色、定量

1. 研究の終了時 (手術の 35 日後、行動試験後) に、マウスが全身麻酔下に入ったら、全身灌流と固定を行います。
   1. ステップ3.3の説明に従ってマウスに麻酔をかけます。深く麻酔をかけたマウスを背側横臥位に置きます。
   2. 腹側全体にわたって75%のアルコールで毛皮を濡らします。
   3. 胸骨の下に切り込みを入れ、続いて胸郭をV字型に切開します。クランプを使用して胸郭をつかみ、心臓を露出させます。
   4. 静脈注入針を左心室に挿入し、すぐにハサミで心房付属器を切って血液を流出させます。
   5. 蠕動ポンプをオンにして、循環器系を通じて生理食塩水を全身に灌流します。右心房から出る体液が透明になり、肝臓の色が赤から淡い赤に変わったら、生理食塩水から4%パラホルムアルデヒド(PFA)に切り替えます。マウスの尾が動き、体が硬くなったら、さらに5mLの4%PFAを灌流します。
      注:マウスの尾の揺れは、適切な灌流の兆候です。
2. 4% PFAによる心臓内灌流後の脳の分離
   1. 大きなハサミでネズミの首を切り落とし、皮膚を切って頭蓋骨を露出させます。
   2. 頭蓋骨の付け根(首に接続されている)に2つの切り込みを入れ、目をつなぐ線に沿って1回切り込みを入れ、次に矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を切り込みます。各半球の頭蓋骨をつかんで外側に剥がし、鉗子を使用して脳を露出させます。
      注:矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を切断することは慎重に行わなければならず、そうしないと脳が損傷して部分に分離する可能性があります。
   3. 脳を取り出し、4°Cで4%PFAに一晩置いて固定後、脳を30%ショ糖に移し、底に沈みます。
      注:30%ショ糖を使用した脱水は、セクションがビブラートでカットされている場合は必要ありません。
3. 埋め込む前に、ペーパータオルを使用してティッシュの周りの余分な液体を吸収します。吻側面をチャックに乗せて脳組織をOCTに埋め込みます。
   注:サンプルの向きは重要です。脳の吻側面をチャックに取り付けて、刃先が尾側部分であることを確認する必要があります。
4. クライオスタットを使用して、DRN の冠状切片 (ブレグマから 4.0–4.8 mm) を厚さ 30 μm (4 セクション間隔) で切断し、切片を PBS に収集します。脳切片凍結保存溶液(SCS)に-20°Cで保存します。
   注:DRNの識別は非常に重要です。連続した解剖学的構造を図3A〜Hに示します。特徴的な構造は、第4脳室の外側くぼみ(LR4V、図3A,Eの赤破線)、第4脳室(4V、図3B,Fの赤破線)、第2小脳小葉(2Cb、図3C/Gの赤破線の菱形構造)、水道管(Aq、図3D,Hの赤破線構造)です。図3D,Hに示すように、構造が観察されたら組織の採取を開始し、その後、厚さ30μmの切片(4分割間隔)に切断して、合計24個の冠状切片を生成します。切片のH&E染色を(図3E-H)に示します。4 つのセクションのそれぞれの 4 番目のセクションは、免疫蛍光染色を行うために選択されます。残りのセクションは SCS に格納されます。構造がわかりにくい場合は、スライドにセクションの一部を取り付けると便利です。
5. 前述のように免疫組織化学アッセイを実施する^21,22。
6. ImageJを使用して、DRN全体のさまざまなセクションレベルで5-HT陽性細胞をカウントします。

8. 統計分析

1. データ分析には統計ソフトウェアを使用します。結果をSEM±手段として表します。
2. 統計分析の値を二元配置分散分析または対応のない t検定で処理し、**p < 0.01で有意な差を考慮します。

結果

冠状断面では、DRN の位置は SSS と水道橋のすぐ下にあります (図 1B、C)。したがって、標準的な手順を使用してDRNを標的とすると、マウス¹⁶の大量出血と高い死亡率につながる可能性があります。したがって、ここでは、SSSの損傷を避けるために、標準的な垂直アプローチではなく角度付きアプローチを使用して定?...

ディスカッション

このプロトコルは、高い病変再現性と低い死亡率を備えた信頼性の高いDRNセロトニン作動性ニューロン病変マウスモデルの作製を成功裏に説明しています。DRNを標的とすることは、DRNのすぐ上にあるSSS^を 損傷し、過度の出血や死に至る可能性¹⁴をもたらす可能性があるため、複雑な作業である。そのため、SSSの損傷を避けるために...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22micron syringe filter	Millipore	SLGPRB
3% hydrogen peroxide	Caoshanhu Co.,Ltd, Jiangxi, China
5,7-Dihydroxytryptamine	Sigma-Aldrich	SML2058	3ug/ul, 2ul
Compact small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd	R500 series
Cryostat	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	1:2,000
dapi	Sigma-Aldrich	D8417
desipramine hydrochloride	Sigma-Aldrich	PHR1723	25mg/kg
Eppendorf tube	Quality Scientific Plastics	509-GRD-Q
goat anti-5-HT antibody	Abcam	ab66047	1:800
GraphPad Prism	Graphpad Software Inc, CA, US
Hamilton Microliter syringe	Hamilton	87943
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	5mg/kg
L-ascorbic acid	BBI Life Sciences	A610021-0500	0.10%
lidocaine ointment	Tsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. Ltd	H20063466
ofloxacin eye ointment	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, China	H10940177
peristaltic pump	Huxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, China	HL-1D
stereotaxic apparatus	RWD Life Science Co., Ltd	68018
ultra-low temperature freezer	Haier	DW-86L388
Vortex	Kylin-bell	VORTEX-5