생쥐의 등쪽 raphe 핵에서 5,7-디하이드록시트립타민의 입체주사에 의한 세로토닌성 뉴런의 제거

요약

이 프로토콜은 상시상동(superior sagittal sinus)의 손상을 방지하기 위해 각진 접근법을 사용하여 DRN에 5,7-디하이드록시트립타민을 입체택시 주입하여 배쪽 강피핵(DRN)-병변 마우스 모델(실험 마우스에서 생존율 >90%)을 설명합니다.

초록

입체주사는 설치류의 표적 뇌 영역에 화합물 또는 바이러스를 직접 전달하는 데 널리 사용되었습니다. 등쪽 강간 핵(dorsal raphe nucleus, DRN)에 있는 세로토닌 뉴런을 직접 표적으로 삼는 것은 상시상동(superior sagittal sinus, SSS) 아래에 위치하기 때문에 과도한 출혈과 동물의 죽음을 유발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 DRN에서 >70% 5-HT 양성 세포의 안정적인 손실과 함께 DRN 세로토닌성 뉴런 병변 마우스 모델(>90% 생존율)의 생성을 설명합니다. 병변은 SSS의 손상을 방지하기 위해 각진 접근 방식(전방/후방 방향 30°)을 사용하여 선택적 세로토닌성 신경독 5,7-디하이드록시트립타민(5,7-DHT)을 DRN에 입체 주입하여 유도됩니다. DRN 세로토닌성 뉴런 병변 마우스는 불안 관련 행동 변화를 나타내며, 이는 DRN 병변 수술의 성공을 확인하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 DRN 병변에 사용되지만, 정중선 구조를 피하기 위해 각도 주입이 필요한 다른 입체 주사에도 사용할 수 있습니다. 이 DRN 세로토닌성 뉴런 병변 마우스 모델은 범불안 장애 및 주요 우울 장애와 같은 정신 장애의 발병기전에서 세로토닌 뉴런의 역할을 이해하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서문

세로토닌 또는 5-하이드록시트립타민(5-HT)은 주로 장과 뇌에서 생성되는 중요한 신경 전달 물질이며 다양한 심리적 기능에 영향을 미칩니다. 중추신경계(CNS)에서 세로토닌계는 기분과 사회적 행동, 수면과 각성, 식욕, 기억력, 성적 욕구를 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. 중추신경계에서 세로토닌은 세로토닌 뉴런에 의해 합성되며, 이는 다음 두 그룹으로 분리될 수 있습니다. 로스트랄 그룹(rostral group)은 사실상 전체 뇌에 신경 분포하는 상승 돌기를 가지고 있습니다. 그리고 주로 척수에 돌출된 꼬리 그룹¹. 뇌에 있는 세로토닌성 뉴런의 약 85%를 포함하는 상부군은 꼬리 선형 핵(caudal linear nucleus), 정중유핵(median raphe nucleus), 그리고 뇌에서 세로토닌성 뉴런이 가장 많이 모여 있는 DRN으로 구성되어 있습니다.

세로토닌 시스템의 조절 장애는 일반적으로 주요 우울 장애(MDD) 및 범불안 장애(GAD)의 발병기전과 관련이 있는 것으로 여겨집니다². 이는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI)가 이러한 정신 질환에 효과적인 약리학적 치료법이라는 사실 때문이다 ^3,4. 또한, 축적된 증거에 따르면 조증⁵과 자살 행동⁶은 DRN의 세로토닌 기능 저하와 관련이 있을 수 있습니다. 또한 Pet1-Cre; Lmx1b^flox/flox 마우스 및 hTM-DTA^iPet1 마우스(각각 후기 배아⁷기 및 성인기⁸기의 대부분의 중심 세로토닌 뉴런이 없는 유전적 마우스 모델)는 향상된 상황별 공포 기억을 보여줍니다. 그러나 광범위한 연구에도 불구하고 이러한 정신 질환에 DRN 세로토닌 뉴런이 정확히 관여하는지는 아직 밝혀지지 않았습니다.

DRN 세로토닌 뉴런이 세로토닌 관련 정신 질환의 발병기전을 조절하는 메커니즘을 탐구하기 위해 동물 모델을 생성했습니다. 쥐 DRN의 세로토닌 뉴런을 억제하기 위해 광유전학 도구가 적용되었으며, 이러한 동물은 증가된 불안과 유사한 행동을 보입니다⁹. 그러나 광유전학에는 한계가 있습니다. 예를 들어, 광 전달 장치는 뇌 깊숙한 곳의 대상 영역에 이식되어야 하며, 이식 수술 중 또는 광 장치에서 방출되는 열에 의해 주변 조직이 손상될 수 있습니다. 체온 변화가 감지할 수 있는 뇌 조직 손상을 일으키지 않더라도 여전히 놀라운 생리적, 행동적 영향을 유발할 수 있다¹⁰.

약리학적 조작은 DRN 세로토닌성 뉴런 병변 동물 모델을 만드는 더 쉬운 방법일 수 있습니다. 일부 그룹은 DRN에서 세로토닌 신경독 5,7-DHT의 입체택시 미량 주입에 의해 DRN 세로토닌성 뉴런 병변 쥐를 생성했습니다. 그러나 이러한 쥐 모델은 불안 완화 행동(anxiolytic behavior)¹¹, 불안 유사 행동(anxiety-like behavior^{) 증가12}, 객체 기억 장애(impaired object memory)¹³와 같은 다양한 행동 변화를 보인다. 쥐에 대한 많은 연구에도 불구하고, 쥐에 대한 5,7-DHT의 영향에 대한 연구는 더 적었습니다. 한 그룹은 DRN에서 5,7-DHT의 입체택시 미세주사를 받은 실험용 마우스에서 과도한 폐사율(>50%)과 제한된 세로토닌 고갈을 보고했습니다¹⁴. 또 다른 그룹은 예측할 수 없는 만성 경미한 스트레스(UCMS)가 5,7-DHT 유발 DRN 병변 마우스에서 상당한 공격 대기 시간 변경을 유발할 수 있다고 보고했습니다. 그러나 DRN¹⁵에서 정확한 세로토닌성 뉴런 소실을 확인하기 위한 조직학적 결과는 제공되지 않았다. 표준 절차를 사용하여 DRN에서 입위 주사는 DRN의 해부학적 위치가 SSS¹⁶ 미만이라는 사실을 감안할 때 마우스에 대한 대량 출혈과 높은 폐사율을 초래할 수 있습니다.

이 프로토콜은 5,7-DHT의 입체택시 주입에 의해 DRN 세로토닌성 뉴런의 안정적인 손실이 있는 DRN 세로토닌 병변 마우스 모델(실험 마우스의 >90% 생존율)을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. DRN의 주입은 SSS의 부상을 방지하기 위해 각진 접근 방식을 사용합니다. 이 수술은 생쥐의 DRN에서 세로토닌 뉴런의 >70% 손실을 지속적으로 유발하며, 불안과 관련된 행동 변화를 일으킵니다. 여기에 사용된 프로토콜은 DRN 병변을 유도하기 위한 것이지만 다른 정중선 구조에서 입체 주사를 수행하려는 연구자에게도 유용할 수 있습니다. 또한, 이 DRN 세로토닌성 뉴런 병변 마우스 모델은 정신 장애(즉, MDD 및 GAD)에서 세로토닌성 뉴런의 역할을 이해하고 이러한 상태에 대한 잠재적인 신경 보호제 또는 치료 전략을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

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프로토콜

모든 외과적 개입 및 동물 관리 절차는 중국 상하이 퉁지대학교 생명과학기술대학 동물위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동물의 사육

1. 수컷 C57BL/6NCrl 마우스(10주령, 25g, n = 21)를 12시간/12시간 라이트/다크 주기에서 표준 조건(24°C 온도, 55% 습도)으로 유지합니다.
2. 음식과 물을 자유자재로 제공하십시오.
   참고: 여기에서 3개의 마우스가 바늘 트랙을 확인하는 데 사용됩니다.

2. 시약의 준비

알림: 모든 약물 준비 단계는 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 수행해야 합니다. 준비된 모든 용액은 -80°C 냉동고에 보관됩니다. 한 번에 하나의 부분 표본을 사용하고, 완전히 해동하고, 사용하기 전에 잘 섞고, 튜브에 남은 음식은 버리고, 냉동 및 해동을 반복하지 않는 것이 좋습니다.

1. 0.9% 식염수 100mL에 0.25g의 데시프라민 염산염을 용해시켜 2.5mg/mL 용액을 생성합니다. 0.22μm 공극 크기의 친수성 PES 멤브레인이 있는 주사기 필터를 사용하여 용액을 살균합니다. 그런 다음 2mL 마이크로 원심분리기(EP) 튜브에 용액(1.8mL/튜브)을 분취합니다. 라벨을 붙이고 날짜를 표시한 후 즉시 -80°C 냉동고에 보관하십시오. 동물용 권장 복용량은 25mg/kg입니다.
2. 0.1% 아스코르브산을 함유한 0.67mL의 0.9% 식염수에 5mg의 5,7-DHT를 용해시켜 3μg/μL 용액을 생성합니다. Vortex를 부드럽게 혼합하고 주사기 필터(0.22μm 공극 크기)를 사용하여 용액을 멸균하고 0.5mL EP 튜브에서 용액(10μL/튜브)을 분취합니다. 라벨을 붙이고, 날짜를 표시하고, 즉시 -80 °C에서 동결합니다. 동물용 권장 용량은 2μL/마우스입니다.
3. 앞서 설명한 방법¹⁷에 따라 케토프로펜(진통제)을 용해합니다. 물 15mL와 1M NaOH 1mL에 케토프로펜 250mg을 용해하고 pH를 7.3으로 조정하고 최종 부피를 125mL로 구성하면 최종 농도는 2mg/mL가 됩니다. 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 1.5mL EP 튜브에 용액(0.4mL/튜브)을 분취합니다. 라벨, 날짜를 지정하고 사용할 때까지 -80 °C에서 동결하십시오. 동물용 권장 복용량은 5mg/kg입니다.

3. 악기 및 마우스 준비

1. 이전에 고온 오토클레이브에서 멸균한 수술 팩(메스, 조직 겸자 한 쌍, 가위 한 쌍, 바늘 홀더, 3-0 봉합사, 귀 태그 및 귀표 어플리케이터 포함)을 준비합니다. 32G 바늘과 1cc 주사기가 있는 해밀턴 주사기를 사용하여 75% 에탄올, 포비돈-요오드, 3% 과산화수소, 차량 용액(0.9% 식염수 중 0.1% 아스코르브산), 면봉, 오플록사신 안연고, 마우스 회수 케이지를 가열 패드 위에 놓습니다.
2. h 5,7-DHT 주사 전에 마우스의 체중을 측정하고 기록한 다음 desipramine (2.5 mg / mL, 10 μL / g 무게)의 복강 내 (IP) 주사를 실시합니다.
   참고: 5,7-DHT 주사 1시간 전에 데시프라민을 투여하는 목적은 카타콜라민성 세포 손실을 예방하는 것입니다¹⁸.
3. 이소플루란 흡입 마취를 사용하여 마우스를 마취합니다(유도 중 3%, 유지 중 1.5%, 유속 = 2L/min). 피하주사를 통해 케토프로펜(2mg/mL, 2.5μL/g 중량)을 투여합니다. 꼬리 꼬집음 반응이 없는 경우 적절한 마취 깊이를 확인합니다.

4. 입체주사

1. 마취된 마우스를 정위 플랫폼에 놓고 정위 장치의 이어바와 앞니 막대로 머리를 고정합니다.
2. 마우스의 머리를 면도한 다음 75% 에탄올을 한 번 스크럽한 다음 포비돈 요오드를 한 번 스크럽하여 노출된 두피를 청소합니다.
3. 면봉을 사용하여 두피에 리도카인 연고를 바르면 국소 진통제를 제공할 수 있습니다. 각막을 보호하기 위해 눈에 플록사신 안연고를 바르십시오.
4. 메스를 사용하여 1mm 후방에서 눈, 귀 내측선을 따라 두피를 절개합니다.
5. 과산화수소에 적신 3% 면봉을 사용하여 골막을 제거한 다음 두개골을 건조시키고 두개골 봉합사를 노출시킵니다. 브레그마와 람다의 위치를 표시합니다.
6. 브레그마와 람다가 같은 수평면에 놓일 때까지 앞니 막대를 사용하여 머리 위치를 조정합니다. 브레그마 또는 람다에 닿도록 바늘 끝을 조정하고, 내측/외측(ML) 및 등쪽/복부(DV) 좌표를 기록하고, 브레그마와 람다의 DV 및 ML 좌표가 각각 같도록 앞니 막대를 조정합니다.
7. 수직 위치 지정 버튼과 잠금 나사를 잠금 해제한 다음 그림 30A, B와 같이 매니퓰레이터 암(z축)을 전방/후방(AP) 방향으로 1°로 설정합니다. 버튼을 잠급니다.
8. 2μL의 5,7-DHT(3μg/μL)로 채워진 Hamilton 주사기를 홀더에 고정합니다(가짜 그룹의 경우 마우스에 0.1% 아스코르브산이 포함된 0.9% 식염수를 주입합니다). 바늘 끝을 조정하여 브레그마 랜드마크에 닿게 한 다음 디지털 디스플레이 모듈을 사용하여 ML, AP 및 DV 값을 0으로 만듭니다.
   참고: 5,7-DHT 용액은 갈색 액체이므로 Hamilton 주사기가 제대로 채워졌는지 쉽게 확인할 수 있습니다. 디지털 디스플레이 모듈에 액세스할 수 없는 경우 바늘 끝이 브레그마에 닿을 때 세 축에 표시된 숫자를 기록하고 최종 좌표는 "기록된 숫자와 이 프로토콜에 제공된 좌표"를 나타냅니다. 예를 들어, y축(A/P 방향) 매니퓰레이터 암에 기록된 숫자가 "a"인 경우 A/P 방향의 최종 좌표는 "a - 6.27"이어야 합니다.
9. 매니퓰레이터 암을 이동하여 바늘 끝을 사출 위치로 조정합니다(APa = -6.27, ML = 0, 최종 좌표 계산 공식은 그림 1B에 나열되어 있음). 마커 펜을 사용하여 대상 위치를 표시합니다.
10. 휴대용 마이크로모터 고속 드릴을 사용하여 버 구멍을 뚫은 다음 매니퓰레이터 암을 움직여 바늘 끝을 목표물(DVa = -4.04)로 내립니다. 용액 2μL를 뇌에 천천히(0.5μL/3분) 주입하고 용액 누출을 방지하기 위해 추가로 5분 동안 바늘을 제자리에 유지합니다. 주입 후 바늘을 부드럽게 제거하십시오.
11. 절개 부위에 3-0 봉합사를 사용하여 단속 봉합사를 적용합니다. 감염을 방지하기 위해 포비돈 요오드를 적신 면봉으로 봉합된 절개 부위를 감쌉니다.
12. 포비돈-요오드 면봉으로 오른쪽 귀를 청소한 다음 멸균된 귀 태그를 귀 바닥에 적용하여 식별합니다.
13. 정위 장치에서 실험용 마우스를 제거하고 마취에서 완전히 회복될 때까지 가열 패드 위의 마우스 회수 케이지에 놓습니다.

5. 마우스의 수술 후 관리

1. 수술 후 최대 2일까지 생쥐에게 케토프로펜을 하루 1회 주사합니다.
2. 수술 후 최대 7일까지 매일 생쥐를 검사하십시오.

6. 상승된 T-미로 테스트

참고: 앞에서 설명한 대로^{테스트를 수행합니다 19,20}.

1. 상승된 T-maze(ETM) 테스트는 중앙 플랫폼(5.0cm x 5.0cm x 0.5cm)이 있는 두 개의 닫힌 암(30cm x 5cm x 16cm x 0.5cm)에 수직인 두 개의 열린 암(30cm x 5cm x 0.5cm)으로 구성되는지 확인합니다. 밀폐된 암 중 하나는 불투명한 플라스틱 시트로 막혀 T자형을 형성합니다(그림 2A).
2. ETM 테스트 3일 전에 매일 5분 동안 다루어 동물을 길들입니다.
3. 수술 후 30일째에 ETM 검사를 실시합니다.
4. 행동 테스트 당일, 생쥐를 팔을 벌린 사람 중 한 명에게 10분 동안 노출시킵니다.
5. 억제 회피 테스트의 경우, 각 마우스를 밀폐된 팔의 말단부에 놓고 3번의 시도에서 4개의 발로 이 팔을 떠나는 데 걸린 시간을 기록합니다. 첫 번째 시도는 기준선 회피, 두 번째 시도는 회피 1, 세 번째 시도는 회피 2입니다.
6. 트레일 사이에 30초 동안 쥐를 케이지에 보관하고 차단 시간을 설정합니다(여기서는 각 시도에 300초가 사용됨).

7. 관류, 고정, 면역조직화학 염색 및 정량화

1. 연구가 끝날 때(수술 후 35일, 행동 테스트 후) 마우스가 전신 마취를 받으면 전신 관류 및 고정을 수행합니다.
   1. 3.3단계에서 설명한 대로 마우스를 마취합니다. 심하게 마취된 마우스를 등쪽 누운 자세로 놓습니다.
   2. 복부 전체에 75% 알코올로 털을 적십니다.
   3. 흉골 아래를 절개한 다음 흉곽을 V자 모양으로 절개합니다. 클램프를 사용하여 흉곽을 잡고 심장을 노출시킵니다.
   4. 정맥 주입 바늘을 좌심실에 삽입한 다음 즉시 가위로 심방 부속기를 잘라 혈액이 흘러나오도록 합니다.
   5. 연동 펌프를 켜서 순환계를 통해 식염수를 전신으로 관류시킵니다. 우심방에서 나오는 액체가 맑아지고 간이 빨간색에서 옅은 빨간색으로 변할 때 식염수에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 전환합니다. 쥐 꼬리가 움직이고 몸이 뻣뻣할 때 4% PFA 5mL를 더 관류합니다.
      알림: 쥐 꼬리가 흔들리는 것은 적절한 관류의 신호입니다.
2. 4% PFA를 사용한 심장 내 관류 후 뇌 분리
   1. 큰 가위를 사용하여 마우스의 목을 베고 피부를 잘라 두개골을 드러냅니다.
   2. 두개골 기저부(목에 연결됨)를 두 번 자르고, 눈을 연결하는 선을 따라 한 번 절개한 다음 시상 봉합사를 따라 두개골을 자릅니다. 각 반구의 두개골을 잡고 바깥쪽으로 벗겨 겸자를 사용하여 뇌를 노출시킵니다.
      참고: 시상 봉합사를 따라 두개골을 절단하는 것은 조심스럽게 수행해야 하며, 그렇지 않으면 뇌가 손상되어 여러 부분으로 분리될 수 있습니다.
   3. 뇌를 제거하고 고정 후 4 °C에서 하룻밤 동안 4 % PFA에 넣은 다음 뇌가 바닥으로 가라 앉을 때까지 30 % 자당으로 옮깁니다.
      알림: 30% 자당을 사용한 탈수는 비브라톰으로 섹션을 절단하는 경우 필요하지 않습니다.
3. 삽입하기 전에 종이 타월을 사용하여 조직 주변의 과도한 액체를 흡수하십시오. 척의 로스트랄 페이스와 함께 OCT에 뇌 조직을 삽입합니다.
   참고: 샘플의 방향이 중요합니다. 뇌의 배쪽 면은 절삭날이 꼬리 부분인지 확인하기 위해 척에 부착되어야 합니다.
4. 저온 유지 장치를 사용하여 DRN(브레그마에서 4.0–4.8mm 후방)의 관상 단면을 저온 유지 장치를 사용하여 30μm 두께(4절편 간격)로 절단하고 PBS에서 절편을 수집합니다. -20°C에서 뇌 절편 동결 보존 용액(SCS)에 보관하십시오.
   참고: DRN의 식별은 매우 중요합니다. 연속적인 해부학적 구조는 그림 3A-H와 같습니다. 특징적인 구조는 다음과 같다: 제4심실(LR4V, 그림 3A,E의 적색 점선), 제4심실(4V, 그림 3B,F의 적색 점선 삼각형), 제2소뇌소엽(2Cb, 그림 3C/G의 적색 대시 다이아몬드 모양 구조) 및 수로(Aq, 그림 3D,H의 적색 점선 구멍). 그림 3D,H와 같이 구조가 관찰되면 조직 수집을 시작한 다음 30μm 두께의 절편(4절편 간격)으로 절단하여 총 24개의 관상 절편을 생성합니다. 단면의 H&E 염색은 (그림 3E–H)에 나와 있습니다. 4개 섹션 각각의 네 번째 섹션은 면역형광 염색을 수행하기 위해 선택될 것입니다. 나머지 섹션은 SCS에 저장됩니다. 구조를 인식하기 어려운 경우 슬라이드에 섹션 중 하나를 장착하는 것이 도움이 됩니다.
5. 앞서 설명한 바와 같이 면역조직화학적 분석을 수행한다^21,22.
6. ImageJ를 사용하여 전체 DRN에 걸쳐 서로 다른 절편 수준에서 5-HT 양성 세포를 계수합니다.

8. 통계 분석

1. 데이터 분석을 위해 통계 소프트웨어를 사용합니다. 결과를 SEM± 평균으로 표현합니다.
2. 통계 분석을 위한 값을 이원 분산 분석(two-way ANOVA) 또는 쌍을 이루지 않은 t-검정으로 처리하고 **p < 0.01에서 차이가 유의하다고 간주합니다.

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결과

코로나 단면에서 DRN의 위치는 SSS와 수로 바로 아래에 있습니다(그림 1B, C). 따라서 표준 절차를 사용하여 DRN을 표적으로 삼으면 마우스¹⁶에서 대량 출혈과 높은 폐사율을 유발할 수 있습니다. 따라서 SSS의 손상을 방지하기 위해 표준 수직 접근 방식 대신 각진 접근 방식을 사용하여 입체 주입을 수행했습니다(

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토론

이 프로토콜은 높은 병변 재현성과 낮은 폐사율을 가진 신뢰할 수 있는 DRN 세로토닌 뉴런 병변 마우스 모델의 생산을 성공적으로 설명합니다. DRN을 표적으로 삼는 것은 DRN¹⁶ 바로 위에 위치한 SSS를 손상시키고 과도한 출혈과^{심지어 사망14}을 초래할 수 있기 때문에 복잡한 작업입니다. 따라서 SSS의 손상을 방지하기 위해 조작 암을 AP 방?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22micron syringe filter	Millipore	SLGPRB
3% hydrogen peroxide	Caoshanhu Co.,Ltd, Jiangxi, China
5,7-Dihydroxytryptamine	Sigma-Aldrich	SML2058	3ug/ul, 2ul
Compact small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd	R500 series
Cryostat	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	1:2,000
dapi	Sigma-Aldrich	D8417
desipramine hydrochloride	Sigma-Aldrich	PHR1723	25mg/kg
Eppendorf tube	Quality Scientific Plastics	509-GRD-Q
goat anti-5-HT antibody	Abcam	ab66047	1:800
GraphPad Prism	Graphpad Software Inc, CA, US
Hamilton Microliter syringe	Hamilton	87943
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	5mg/kg
L-ascorbic acid	BBI Life Sciences	A610021-0500	0.10%
lidocaine ointment	Tsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. Ltd	H20063466
ofloxacin eye ointment	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, China	H10940177
peristaltic pump	Huxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, China	HL-1D
stereotaxic apparatus	RWD Life Science Co., Ltd	68018
ultra-low temperature freezer	Haier	DW-86L388
Vortex	Kylin-bell	VORTEX-5