通过宫内注射诱导利普托门宁皮细胞修饰

摘要

我们描述了一种宫内注射，在头尖弯曲的针头可以稳定在头骨上，从而消除了对底层腹腔损伤的风险。该方法可用于脑膜蛋白酶细胞的基因命运图谱和操作，以及跟踪脑脊液运动。

摘要

此处概述的协议描述了如何通过蓄水池安全、手动注入溶液，同时消除对底层帕伦奇马的损害风险。以前发布的协议建议使用直针，应降低至从杜面表面到最大 1-2 毫米。一旦硬膜被刺穿，阻力突然下降，使得很难将针头保持在稳定的位置。相反，我们的方法使用一根针弯曲在尖端，可以稳定在头骨的骨骼上，从而防止注射器在透过杜拉膜后渗透到组织中。该过程简单明了，可重复，不会在操作的动物中引起持久的不适。我们描述了血管脑蛋白酶细胞遗传命运图的背景下的宫内注射策略。此外，同样的技术也可以用来解决广泛的研究问题，例如通过基因消融这些现象，探讨利普托明病在神经发育和细菌性脑膜炎传播中的作用。此外，该程序可与自动输注系统相结合，实现持续输送，并通过注射荧光标记分子跟踪脑脊液运动。

引言

脑皮细胞是一种类似成纤维细胞的细胞群，它们组织成一层薄薄的细胞，覆盖大脑，表达与胶原蛋白交联有关的基因（例如，Dcn和Lum），以及建立脑脑电明屏障（例如，Cldn11）1、2。^1,2脑膜细胞涉及广泛的生理功能，从严格控制脑脊液排水³到指导发育中的大脑中神经祖细胞^44、5。5最近的一项研究还提出，新生儿中的耳皮层可能含有径向胶质状细胞，这些细胞会迁移到脑皮质瘤中，并发育成功能性皮质神经元^6。

细胞体位于靠近表面星体细胞附近，并与它们共享，以及其他帕伦奇马尔星体，表达connexin-30（Cx30）7。⁷下面概述的外科手术允许通过一次性将内毒素输送到转基因小鼠的水箱中，在Cx30+ 细胞中表达tdTomato（即使用CreER-loxP系统进行命运映射）对这些脑膜炎细胞进行⁺广泛和具体的标签。Endoxifen 是塔莫西芬的活性代谢物，与塔莫西芬一样诱导克里尔表达细胞的重组。然而，它是推荐用于局部应用的解决方案，因为它溶解在5-10%的DMSO中，而不是高浓度的乙醇。此外，内氧西芬不会跨越脑脑阻隔，从而能够对脑皮质细胞进行特定的重组，而无需标记基础Cx30⁺天体胶质种群（参见代表性结果）。

此处介绍的技术旨在通过直接进入水仙子，手动安全地将化合物注入脑脊液中。与其他需要颅骨切除术的更具侵入性的程序不同，这种方法允许在不造成颅骨或脑筋皮损伤的情况下注入化合物。因此，它与由激活皮质胶质细胞触发的炎症反应的诱导无关。与^{,88、9、109}之前描述的其他注射策略类似，本办法依赖于覆盖水箱的肌酸-四面体膜的外科暴露，在钝刻颈部肌肉解剖后。¹⁰然而，与其他程序不同，我们建议在尖端弯曲针头，在给剂期间，针对骨骼可以稳定。这将防止针头穿透太深和损害潜在的小脑和髓线的风险。

此外科手术与谱系追踪调查兼容，旨在绘制细胞身份的变化和通过层形层的迁移路线。它也可以适应基因消融研究，旨在探讨利皮质细胞在健康和疾病中的作用，如它们对皮质发育⁵或细菌性脑膜炎^{的传播的贡献,3，11。}最后，当与野生动物中荧光示踪剂的传递相结合时，可用于跟踪脑脊液运动。

研究方案

特此提出的外科手术得到了斯德哥尔摩诺拉·久尔夫·德尔塞茨卡·纳姆德的批准，并符合该研究所（瑞典卡罗林斯卡研究所）提供的规格。

注:宫内注射可以灵活适应多种研究目的。我们下面介绍了一个程序，用于根据携带R26R-tdTomato12和CreER的转基因小鼠生产线注射内毒素，有效地标记蛋白酶细胞的命运映射，后者在Cx30促进¹²剂¹³下。通过使用下面概述的相同程序注入病毒结构，可以获得这种细胞群的标签。最后，这种方法可用于跟踪脑脊液流动，通过注入荧光示踪剂。

1. 注射系统的制备

注:我们建议在合适的手术室和无菌条件下进行手术。手术工具可以使用热（高压灭菌器、玻璃珠消毒器）进行消毒，或者使用高级化学消毒剂进行消毒，如果它们对热敏感。使用化学消毒时，在使用前冲洗仪器，或在用热消毒时让仪器冷却。

1. 使用钳子，将注射注射器的针头弯曲到 30°，距离尖端 3 mm。
   注:使用带有 30 G 的线针的汉密尔顿注射器。
2. 制备1mg/mL的内氧辛溶液，稀释10%DMSO，用弯曲的针头回填注射器。
   注:施用5μL的化合物，以确保在成年C57Bl/6j小鼠（约25-30克）中广泛接触脑膜炎细胞，尽管在治疗不同年龄和菌株的动物时可能需要测试不同浓度和注射量的试验性实验。
3. 调整鼠标头座，使嘴片距离手术台面约 30°。
   注:具有三点固定（即耳朵和嘴）的立体定向框架也可用于此过程。然而，在这种情况下，动物将只固定在嘴片，而耳杆可以延伸到动物的前肢，并用于支持动物的身体在手术过程中。

2. 麻醉的诱导

1. 对于注射麻醉剂，使用当地机构兽医单位推荐的浓度和管理模式。
2. 对于吸入麻醉剂（如异物），请根据制造商的规格准备管理单元。
3. 使用安福拉内，将化合物的浓度设定为4%，用于麻醉诱导。
4. 以 400 mL/min 的速度输送空气。
5. 让麻醉装置在腔室中充满麻醉剂几分钟，然后将鼠标放在室中。
   注:在本实验中，我们使用成年（>2个月大，约30克）雄性和雌性转基因小鼠携带Cx30-CreER和R26R-tdTomato，并在C57Bl/6j背景下繁殖。
6. 在麻醉过程中监测动物。当鼠标完全麻醉时，呼吸模式应减慢。
7. 将动物从腔室中取出，通过巧妙地捏住后爪，检查爪子反射是否抑制。
   注:反射可能仍然存在，但延迟了几秒钟。如果是这种情况，将动物放回室内，直到完全抑制爪反射。
8. 施用镇痛药（例如，卡普罗芬，5毫克/千克通过皮下注射），以帮助术后疼痛管理。

3. 动物在程序上的定位

1. 将动物的头固定在头架上。为提高对蓄水池的可及性，将动物的身体从桌子表面和头部置于约30°处，与身体其余部分建立120°角，并伸长颈部后部，以方便进入蓄水池（图1A）。
2. 在动物下面添加纸巾，在整个过程中支持其身体。
3. 通过口片确保麻醉，将西罗兰浓度降低至2.5%，空气输送降至200毫升/分钟。
4. 涂抹眼科药膏。

4. 《麦格纳》的曝光

1. 用70%的乙醇和贝塔丁对动物的脖子后部进行消毒。
2. 使用手术剪刀，执行中线切口（约7毫米长），从骨骼的水平开始，并后延伸。
3. 轻轻地分开表面的连接组织和颈部肌肉从中线侧拉与细尖钳。这将暴露覆盖蓄水池的膜膜，形状为倒三角形。
4. 使用无菌吸收矛或棉签来控制任何由此产生的出血。
5. 放置一个小手术分离器，以保持颈部肌肉拉到一边，并在整个过程中实现蓄水池的可视化。

5. 宫内注射

1. 要进入卡斯特纳麦格纳，确定骨骼的切口末端，并插入先前立即弯曲的针头。
   注:当杜听觉膜被刺穿时，电阻会突然下降。然而，由于针尖的钩形，它只会在脑膜炎表面的下方稍微穿透。
2. 一旦杜拉被穿孔，让针的弯曲尖端穿透下的杜听觉表面，轻轻地拉注射器向上和平行的动物的身体，以便"钩"到头骨（见图Figure 11B）。这将确保更好的稳定性，并防止针穿透更深，从而避免损害潜在的小脑或髓。
3. 缓慢注射化合物，避免干扰脑脊液的自然流动。
   注:根据实验的目的，输液率可能会有所不同。如果需要缓慢且稳定的输注率（例如，在使用该程序跟踪脑脊液运动时），建议将自动微输液系统与注射器结合使用。
4. 注射后，让针头在部位休息1分钟，并小心地取出。使用细尖钳帮助将针头从钩位置撤回。
   注:使用细针（例如 30 G）不会导致脑膜的严重损伤，并导致脑脊液流出。如果需要较大的针头尺寸，我们建议使用无菌棉尖在注射部位施加压力，从而阻止液体泄漏。

6. 结束程序和术后护理

1. 拆下分离器，让肌肉回到其原始位置，覆盖杜听觉膜。
2. 使用几滴氰丙烯酸酯粘合剂关闭皮肤切口。
   注:或者，使用可吸收缝合线（例如，5-0 维基质缝合），并关闭皮肤切口与中断的缝合。
3. 在切口部位施用局部麻醉剂（例如，100 μL 5% 利多卡因）。
4. 将动物从支架上取下，放在位于加热垫上的干净笼子中。监测动物，直到它恢复知觉。
   注:该程序预计不会在动物中引起持久的疼痛或痛苦。然而，在术后的第一天，应密切监测小鼠，必要时可根据您所在机构兽医单位的建议采取疼痛缓解措施。

结果

在在Cx30促进剂¹³下表达CreER的转基因小鼠体内注射内毒素，以及一个可诱导的荧光报告器允许对瘦蛋白细胞进行特定重组，而无需在皮层中标记邻近的Cx30表达表面和帕伦奇质的天体细胞（图1）。为了获得进入蓄水池，麻醉动物的身体和头部以大约120°的角度定位，从而允许其颈部背部被拉伸（图1A）。

讨论

此处概述的协议提供了一个简单且可重复的过程，用于标记脂肪映射的利普托明尼细胞。我们使用甲氧西芬（塔莫西芬的活性代谢物）的内腔注射，诱导Cx30-CreER中tdTomato荧光报告器的表达;R26R-tdTomato小鼠^1212，1313。

与其他用于通过气囊9获得脑脊液的规程^{相比，我们}的方法确保了安全手动管理，这要归功于使用弯曲?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia unit	Univentor 410	8323102	Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane)	Baxter Medical AB	000890
Betadine	Sigma-Aldrich	PVP1
Carprofen	Orion Pharma AB	014920	Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue	Carl Roth	0258.1	Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue	Stoelting	50479
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Endoxifen	Sigma-Aldrich	E8284
Ethanol 70%	Histolab	01370
Hamilton syringe (30 G beveled needle)	Hamilton	80300
Lidocaine	Aspen Nordic	520455
Mouse head holder	Narishige International	SGM-4	With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Shaver	Aesculap	GT420
Sterile absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator	World Precision Instrument	501897
Tweezers	Dumont	11251-35
Viscotears	Bausch&Lomb Nordic AB	541760