Induktion von Leptomeningealzellen Modifikation über intrazisternale Injektion

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine intrazisternale Injektion, die eine an der Spitze gebogene Nadel verwendet, die zum Schädel stabilisiert werden kann, wodurch das Risiko einer Schädigung des darunter liegenden Parenchyms beseitigt wird. Der Ansatz kann für die genetische Schicksalskartierung und Manipulation von Leptomeningealzellen und für die Verfolgung der Bewegung von Zerebrospinalflüssigkeit verwendet werden.

Zusammenfassung

Das hier skizzierte Protokoll beschreibt, wie man Lösungen sicher und manuell durch die Zisterne magna injiziert und gleichzeitig das Risiko einer Beschädigung des zugrunde liegenden Parenchyms eliminiert. Zuvor veröffentlichte Protokolle empfehlen die Verwendung von geraden Nadeln, die von der Duraloberfläche auf maximal 1-2 mm abgesenkt werden sollten. Der plötzliche Rückgang des Widerstands, sobald die Duralmembran durchlöchert wurde, macht es schwierig, die Nadel in einer stabilen Position zu halten. Unsere Methode verwendet stattdessen eine an der Spitze gebogene Nadel, die gegen den okzipitalen Knochen des Schädels stabilisiert werden kann, wodurch verhindert wird, dass die Spritze nach perforation der Duralmembran in das Gewebe eindringt. Das Verfahren ist einfach, reproduzierbar und verursacht keine lang anhaltenden Beschwerden bei den operierten Tieren. Wir beschreiben die intrazisternale Injektionsstrategie im Kontext der genetischen Schicksalskartierung von vaskulären Leptomeningealzellen. Die gleiche Technik kann darüber hinaus verwendet werden, um eine breite Palette von Forschungsfragen zu beantworten, wie die Untersuchung der Rolle von Leptomeningen in der Neuroentwicklung und die Verbreitung von bakteriellen Meningitis, durch genetische Ablation von Genen, die angeblich in diese Phänomene involviert sind. Darüber hinaus kann das Verfahren mit einem automatisierten Infusionssystem für eine konstante Abgabe kombiniert und zur Verfolgung der Bewegung von Zerebrospinalflüssigkeit durch Injektion fluoreszierender Moleküle verwendet werden.

Einleitung

Leptomeningeale Zellen sind eine fibroblastenartige Population von Zellen, die in einer dünnen Schicht organisiert sind, die das Gehirn überlagert und Gene exzessiiert, die in kollagenvernetzung (z. B. Dcn und Lum) und bei der Etablierung einer Hirn-Meningealbarriere (z. B. Cldn11)^1,2beteiligt sind. Leptomeningeale Zellen sind in eine breite Palette von physiologischen Funktionen involviert, von der strengen Kontrolle über die Zerebrospinalflüssigkeit Drainage^3, um Führung der neuronalen Vorläufer im sich entwickelnden Gehirn^4,5. Eine aktuelle Studie hat auch vorgeschlagen, dass Leptomeninges beim Neugeborenen radialgliaartige Zellen beherbergen können, die in das Gehirn parenchyma wandern und sich zu funktionellen kortikalen Neuronen entwickeln⁶.

Leptomeningealzellen befinden sich in unmittelbarer Nähe zu Oberflächenastrozyten und teilen sich mit ihnen, sowie andere parenchymale Astroglia, Expression von Connexin-30 (Cx30)⁷. Das unten beschriebene chirurgische Verfahren ermöglicht eine weit verbreitete und spezifische Kennzeichnung dieser Meningealzellen über eine einmalige Abgabe von Endoxifen in die Zisternenmagna von transgenen Mäusen, die tdTomato in Cx30⁺ Zellen konditionell ausdrücken (d. h. mit einem CreER-loxP-System zur Schicksalskartierung). Endoxifen ist ein aktiver Metabolit von Tamoxifen und induziert eine Rekombination von CreER-exezierenden Zellen auf die gleiche Weise wie Tamoxifen. Es ist jedoch die empfohlene Lösung für die topische Anwendung, da es sich in 5-10% DMSO auflöst, anstatt hohe Konzentrationen von Ethanol. Darüber hinaus überschreitet Endoxifen nicht die Hirn-Meningeal-Barriere und ermöglicht somit eine spezifische Rekombination von Leptomeningealzellen, ohne die zugrunde liegende Cx30⁺ astrogliale Population zu kennnieren (siehe Repräsentative Ergebnisse).

Die hier vorgestellte Technik zielt darauf ab, die Verbindung manuell und sicher in die Zerebrospinalflüssigkeit zu injizieren, über den direkten Zugang zur Zisterne magna. Im Gegensatz zu anderen, invasiveren Verfahren, die eine Kraniotomie erfordern, ermöglicht dieser Ansatz, Verbindungen zu infundieren, ohne schäden am Schädel oder am Hirnparenchym zu verursachen. Daher ist es nicht mit der Induktion von Entzündungsreaktionen verbunden, die durch die Aktivierung von parenchymalen Gliazellen ausgelöst werden. Ähnlich wie bei anderen Injektionsstrategien, die vor^8,9,10beschrieben wurden, beruht der gegenwärtige Ansatz auf der chirurgischen Exposition der atlanto-okzipitalen Duralmembran, die die Zisterne magna bedeckt, nach stumpfer Zerlegung der überlagernden Nackenmuskulatur. Im Gegensatz zu anderen Verfahren empfehlen wir jedoch die Verwendung einer an der Spitze gebogenen Nadel, die während der Verabreichung gegen den okzipitalen Knochen stabilisiert werden kann. Dadurch wird verhindert, dass die Nadel zu tief eindringt und das darunter liegende Kleinhirn und die Medulla beschädigt.

Dieses chirurgische Verfahren ist kompatibel mit Linienverfolgungsuntersuchungen, die darauf abzielen, Veränderungen in Zellidentitäten und Migrationsrouten durch parenchymale Schichten zu kartieren. Es kann auch an genetische Ablationsstudien angepasst werden, die die Rolle von Leptomeningealzellen bei Gesundheit und Krankheit untersuchen wollen, wie ihren Beitrag zur kortikalen Entwicklung⁵ oder die Verbreitung von bakterieller Meningitis^3,11. Schließlich kann es verwendet werden, um zerebrospinale Flüssigkeit Bewegung zu verfolgen, in Kombination mit der Lieferung von fluoreszierenden Tracern bei Wildtieren.

Protokoll

Die hiermit vorgestellten chirurgischen Verfahren wurden von der Stockholmerin Norra Djurförsöksetiska Nämnd genehmigt und in Übereinstimmung mit den Spezifikationen des Forschungsinstituts (Karolinska-Institut, Schweden) durchgeführt.

HINWEIS: Die intrazisternale Injektion kann flexibel für mehrere Forschungszwecke angepasst werden. Wir stellen im Folgenden ein Verfahren vor, das entwickelt wurde, um Leptomeningealzellen effizient für die Schicksalskartierung auf der Grundlage der Injektion von Endoxifen in eine transgene Mauslinie mit R26R-tdTomato¹² und CreER zu kennzeichnen, letztere unter dem Cx30-Promotor¹³. Die Kennzeichnung dieser Zellpopulation kann durch Injektion von Viruskonstrukten mit dem nachstehend beschriebenen Verfahren erreicht werden. Schließlich kann dieser Ansatz zur Verfolgung des zerebrospinalen Flüssigkeitsflusses durch Infusion von fluoreszierenden Tracern eingesetzt werden.

1. Vorbereitung des Injektionssystems

HINWEIS: Wir empfehlen, den Eingriff in einem geeigneten Operationssaal und unter aseptischen Bedingungen durchzuführen. Chirurgische Werkzeuge können mit Wärme (Autoklav, Glasperlensterilisator) sterilisiert oder mit einem hochwertigen chemischen Desinfektionsmittel desinfiziert werden, wenn sie hitzeempfindlich sind. Spülen Sie die Instrumente vor dem Einsatz bei der Verwendung chemischer Desinfektion oder lassen Sie sie abkühlen, wenn sie mit Hitze desinfiziert werden.

1. Biegen Sie die Nadel der Injektionsspritze mit Zange von der Spitze auf 30° bei 3 mm.
   HINWEIS: Verwenden Sie Hamilton Spritzen mit einer 30 G abgeschrägten Nadel.
2. Bereiten Sie 1 mg/ml Endoxifenlösung vor, verdünnt in 10% DMSO und füllen Sie die Spritze mit der gebogenen Nadel.
   ANMERKUNG: Verabreichen Sie 5 l der Verbindung, um eine weit verbreitete Exposition von Meningealzellen in der erwachsenen C57Bl/6j-Maus (ca. 25-30 g) zu gewährleisten, obwohl Pilotversuche, die unterschiedliche Konzentrationen und Injektionsvolumina testen, bei der Behandlung von Tieren unterschiedlichen Alters und unterschiedlicher Stämme erforderlich sein können.
3. Stellen Sie den Mauskopfhalter so ein, dass sich das Mundstück bei ca. 30° von der Oberfläche des OPERATIONStisches befindet.
   HINWEIS: Für dieses Verfahren kann auch ein stereotaktischer Rahmen mit Dreipunktfixierung (d.h. Ohren und Mund) verwendet werden. In diesem Fall wird das Tier jedoch nur mit dem Mundstück fixiert, während Ohrstangen unter den Vorderbeinen des Tieres verlängert werden können und zur Unterstützung des Körpers des Tieres während des Eingriffs verwendet werden können.

2. Induktion der Anästhesie

1. Für injizierbare Anästhetika, verwenden Sie Konzentrationen und Arten der Verabreichung von der Veterinäreinheit in der lokalen Einrichtung empfohlen.
2. Für inhalative Anästhetika, wie Isofluran, bereiten Sie die Verwaltungseinheit nach den Spezifikationen des Herstellers vor.
3. Bei Isofluran zur Induktion der Anästhesie die Konzentration der Verbindung auf 4% einstellen.
4. Luft mit einer Geschwindigkeit von 400 ml/min liefern.
5. Lassen Sie die Anästhesieeinheit die Kammer für ein paar Minuten mit dem Anästhetikum füllen und legen Sie die Maus anschließend in die Kammer.
   HINWEIS: Für die vorliegenden Experimente haben wir erwachsene (>2 Monate alte und ca. 30 g) männliche und weibliche transgene Mäuse verwendet, die Cx30-CreER und R26R-tdTomato tragen und auf einem C57Bl/6j-Hintergrund gezüchtet haben.
6. Überwachen Sie das Tier während der Induktion der Anästhesie. Das Atmungsmuster sollte sich verlangsamen, wenn die Maus unter Vollanästhesie ist.
7. Entfernen Sie das Tier aus der Kammer und überprüfen Sie die Unterdrückung des Pfotenreflexes, indem Sie die Hinterpfoten zart kneifen.
   HINWEIS: Der Reflex kann immer noch vorhanden sein, aber verzögert ein paar Sekunden. Wenn dies der Fall ist, legen Sie das Tier wieder in die Kammer, bis die vollständige Unterdrückung des Pfotenreflexes erreicht ist.
8. Analgetika (z. B. Carprofen, 5 mg/kg durch subkutane Injektion) verabreichen, um das postoperative Schmerzmanagement zu unterstützen.

3. Positionierung des Tieres für das Verfahren

1. Fixieren Sie den Kopf des Tieres auf den Kopfhalter. Um die Zugänglichkeit zur Zisterne magna zu verbessern, positionieren Sie den Körper des Tieres bei etwa 30° von der Oberfläche des Tisches und dem Kopf nach unten betitelt, um einen Winkel von 120° mit dem Rest des Körpers zu etablieren und die Rückseite des Halses zu verlängern, um den Zugang zur Cisterna magna zu erleichtern (Abbildung 1A).
2. Fügen Sie Papiertücher unter dem Tier hinzu, um ihren Körper während des gesamten Verfahrens zu unterstützen.
3. Sichere Anästhesie-Abgabe durch das Mundstück und Verringerung der Isoflurankonzentration auf 2,5% und Luftabgabe auf 200 ml/min.
4. Ophthalmologische Salbe auftragen.

4. Exposition der Cisterna Magna

1. Rasieren Sie den Nacken des Tieres und desinimisieren Sie den Bereich mit 70% Ethanol und Betadine.
2. Führen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Mittellinienschnitt (ca. 7 mm Länge) ab der Ebene des okzipitalen Knochens durch und verlängern ihn nachträglich.
3. Trennen Sie vorsichtig oberflächliches Bindegewebe und Nackenmuskeln, die seitlich von der Mittellinie mit feiner Spitzenpinzette ziehen. Dadurch wird die Duralmembran, die die Zisterne magna überlagert, als invertiertes Dreieck aussetzen.
4. Verwenden Sie sterile Absorptionsspeere oder Wattestäbchen, um die daraus resultierenden Blutungen zu kontrollieren.
5. Positionieren Sie einen kleinen chirurgischen Separator, um die zur Seite gezogenen Nackenmuskeln zu halten und die Visualisierung der Zisternen magna während des gesamten Eingriffs zu ermöglichen.

5. Intrazisternale Injektion

1. Um Zugang zur Zisterne magna zu erhalten, identifizieren Sie das kaudale Ende des Okzipitalknochens und setzen Sie die Nadel ein, die zuvor unmittelbar darunter gebogen war.
   HINWEIS: Es wird einen plötzlichen Rückgang des Widerstands geben, da die Duralmembran durchbrochen wird. Die Spitze der Nadel dringt jedoch dank ihrer hakenförmigen Form nur leicht unter die Meningealoberfläche ein.
2. Sobald die Dura perforiert ist, lassen Sie die gebogene Spitze der Nadel unter die Duraloberfläche eindringen, indem Sie die Spritze sanft nach oben und parallel zum Körper des Tieres ziehen, um die Nadel an den Schädel zu "hängen" (siehe Abbildung 1B). Dies wird eine bessere Stabilität gewährleisten und verhindern, dass die Nadel tiefer eindringt, wodurch das Risiko einer Beschädigung des darunter liegenden Kleinhirns oder Medulla vermieden wird.
3. Injizieren Sie die Verbindung langsam, um Interferenzen mit dem natürlichen Fluss der Zerebrospinalflüssigkeit zu vermeiden.
   HINWEIS: Je nach Zweck des Experiments kann die Infusionsrate variieren. Wenn eine langsame und stetige Infusionsrate erforderlich ist (z. B. bei Verwendung des Verfahrens zur Verfolgung der Bewegung von Zerebrospinalflüssigkeit), kann es ratsam sein, ein automatisiertes Mikroinfusionssystem in Kombination mit der Spritze zu verwenden.
4. Nach der Injektion die Nadel 1 min an der Stelle ruhen lassen und vorsichtig entfernen. Verwenden Sie feine Spitzenzange, um das Zurückziehen der Nadel aus ihrer Hakenposition zu unterstützen.
   HINWEIS: Die Verwendung einer dünnen Nadel (z.B. 30 G) führt nicht zu erheblichen Schäden an der Meningealmembran und dem daraus resultierenden Abfluss der Zerebrospinalflüssigkeit. Wenn größere Nadelgrößen erforderlich sind, empfehlen wir, das Auslaufen von Flüssigkeit durch Druck an der Injektionsstelle mit einer sterilen Baumwollspitze zu stoppen.

6. Abschluss des Verfahrens und postoperative Pflege

1. Entfernen Sie den Separator und lassen Sie die Muskeln zu ihrer ursprünglichen Position zurückkehren, die die Duralmembran überlagert.
2. Schließen Sie den Hautschnitt mit ein paar Tropfen Cyanoacrylat-Klebstoff.
   HINWEIS: Alternativ können Sie resorbierbare Nähte (z.B. 5-0 Vicryl-Nähte) verwenden und den Hautschnitt mit unterbrochenen Stichen schließen.
3. Lokalanästhetikum (z. B. 100 l 5% Lidocain) an der Einschnittstelle auftragen.
4. Entfernen Sie das Tier aus dem Halter und legen Sie es in einen sauberen Käfig, der auf einem Heizkissen positioniert ist. Überwachen Sie das Tier, bis es das Bewusstsein wiedererlangt.
   HINWEIS: Es wird nicht erwartet, dass das Verfahren lang anhaltende Schmerzen oder Schmerzen im Tier verursacht. Dennoch sollte die Maus für die ersten postoperativen Tage genau überwacht werden, und Schmerzlinderungsmaßnahmen können durchgeführt werden, wenn dies für notwendig erachtet wird, und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Veterinärabteilung Ihrer Einrichtung.

Ergebnisse

Die intrazisternale Injektion von Endoxifen bei transgenen Mäusen, die CreER unter dem Cx30-Promotor¹³ exzieren, und einem induzierbaren fluoreszierenden Reporter ermöglicht eine spezifische Rekombination von Leptomeningealzellen, ohne die benachbarte Cx30-exezierende Oberfläche und parenchymale Astrozyten im Kortex zu kennlassen (Abbildung 1). Um Zugang zur Zisterne magna zu erhalten, wird das anästhesierte Tier mit seinem Körper...

Diskussion

Das hier skizzierte Protokoll stellt ein einfaches und reproduzierbares Verfahren zur Kennzeichnung von Leptomeningealzellen für die Schicksalskartierung dar. Wir verwenden die intrazisternale Injektion von Endoxifen, einem aktiven Metaboliten von Tamoxifen, um die Expression von tdTomato fluoreszierendem Reporter in Cx30-CreER zu induzieren; R26R-tdTomatenmäuse^12,13.

Im Vergleich zu anderen Protokollen, die für den Zugang zur Zereb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia unit	Univentor 410	8323102	Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane)	Baxter Medical AB	000890
Betadine	Sigma-Aldrich	PVP1
Carprofen	Orion Pharma AB	014920	Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue	Carl Roth	0258.1	Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue	Stoelting	50479
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Endoxifen	Sigma-Aldrich	E8284
Ethanol 70%	Histolab	01370
Hamilton syringe (30 G beveled needle)	Hamilton	80300
Lidocaine	Aspen Nordic	520455
Mouse head holder	Narishige International	SGM-4	With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Shaver	Aesculap	GT420
Sterile absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator	World Precision Instrument	501897
Tweezers	Dumont	11251-35
Viscotears	Bausch&Lomb Nordic AB	541760