インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

要約

我々は、頭蓋骨に安定させることができる先端に曲がった針を採用するインタセラセナーナル注射を記述し、したがって、基礎となるパレンチマへの損傷のリスクを排除する。このアプローチは、レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングおよび操作や脳脊髄液の動きを追跡するために使用することができます。

要約

ここで概説するプロトコルは、基礎となるパンキチマへの損傷のリスクを排除しながら、水槽マグナを介して溶液を安全かつ手動で注入する方法を説明しています。以前に公開されたプロトコルは、硬膜表面から最大1〜2mmに下げる必要があるストレート針を使用することをお勧めします。硬膜が穿刺されると、抵抗の急激な低下は、針を安定した位置に維持することが困難になります。私たちの方法は、代わりに、頭蓋骨の後頭部骨に対して安定させることができる先端に曲がった針を使用し、したがって、注射器が硬膜の穿孔後に組織に浸透するのを防ぎます。手順は、簡単で再現性があり、操作された動物に長続きする不快感を引き起こすものではありません。我々は、血管レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングの文脈におけるインタセラセナーナル注射戦略について述べている。さらに、神経発達におけるレプトメニンの役割の調査や細菌性髄膜炎の蔓延など、これらの現象に関連する遺伝子の遺伝的切開を通じて、幅広い研究課題に取り組むためにも利用できる。さらに、この手順は、一定の送達のための自動注入システムと組み合わせることができ、蛍光標識された分子の注入を介して脳脊髄液の動きを追跡するために使用される。

概要

レプトメニンゲ細胞は、脳を重ねた薄層に組織化された線維芽細胞様集団であり、コラーゲン架橋に関与する遺伝子(例えばDcnおよびLum)を発現し、脳髄膜バリア(例えばCldn11)1、2の確立に^{1,含まれる}。レプトメニンゲ細胞は、脳脊髄液排液³の厳密な制御から、発達中の脳^44,55における神経前駆細胞の指導まで、幅広い生理機能に関与している。最近の研究では、新生児のレプトメニンジが脳のパレンチマに移行し、機能的皮質ニューロン⁶に発展する放射状グリア様細胞を収容する可能性が提案されている。

レプトメニンゲ細胞は、表面アストロサイトに近接して位置し、それらと共有し、ならびに他の層状アストロリア、コネキシン-30(Cx30)7の発現を共有する。⁷以下に概説する外科的処置は、Cx30+細胞中のtdTomatoを条件付きで発現するトランスジェニックマウスのシスターナマグナへのエンドキシフェンの1回の送達を介して、これらの髄膜細胞の広範かつ⁺特異的な標識を可能にする(すなわち、運命マッピングのためのCreER-loxPシステムを使用する)。エンドキシフェンはタモキシフェンの活性代謝産物であり、タモキシフェンと同じ方法でCreER発現細胞の再結合を誘導する。しかし、高濃度のエタノールの代わりに5〜10%のDMSOに溶解するため、局所適用に推奨される溶液である。さらに、エンドキシフェンは脳・髄膜バリアを越えず、それにより、基になるCx30⁺占星団集団の標識なしにレプトメニンゲザル細胞の特異的な組換えを可能にする(代表結果を参照)。

ここで提示される技術は、水槽のマグナへの直接アクセスを介して、手動で安全に脳脊髄液中の化合物を注入することを目的としています。頭蓋骨切除術を必要とする他のより侵襲的な手順とは異なり、このアプローチは、頭蓋骨または脳の気質に損傷を与えることなく化合物を注入することを可能にする。したがって、実質グリア細胞の活性化によって引き起こされる炎症反応の誘導とは関連しない。^{,88、9、109}の前に記載された他の注射戦略と同様に、本アプローチは、頸部筋肉を重ね合わせた鈍解の後、システルナマグナを覆うアトラント後頭膜の外科的暴露に依存する。¹⁰しかし、他の手順とは異なり、投与中に後頭骨に対して安定化することができる先端に曲がった針の使用をお勧めします。これは、針があまりにも深く貫通し、基礎となる小脳と髄質を損傷するリスクを防ぎます。

この外科的処置は、細胞の同一性およびペラキマル層を通る移動経路の変化をマッピングすることを目的とする系統追跡調査と互換性がある。また、皮質の発達^に寄与する細胞や細菌性髄膜炎^,3,11の広がりなど、健康や疾患におけるレプトメニンゲ細胞の役割を調査しようとする遺伝子アブレーション研究にも適応することができる。³最後に、野生動物の蛍光トレーサーの送達と組み合わせると、脳脊髄液の動きを追跡するために利用することができる。

プロトコル

ここに提示された外科的処置は、ストックホルム・ノラ・ジュルフェルセクセティスカ・ナムントによって承認され、研究所(スウェーデンのカロリンスカ研究所)が提供する仕様に同意して実施された。

注:インタシターナル注射は、複数の研究目的に柔軟に適応することができる。R26R-tdTomato¹²およびCreERを担うトランスジェニックマウスラインにおけるエンドキシフェンの注入に基づいて運命マッピング用レプトメニンゲ細胞を効率的に標識するために開発された手順を以下に提示し、後者はCx30プロモーター¹³の下で提示する。細胞のこの集団の標識は、以下に概説するのと同じ手順を用いてウイルス構築物の注入によって達成され得る。最後に、このアプローチは、蛍光トレーサーの注入によって、脳脊髄液の流れを追跡するために使用することができる。

1. インジェクションシステムの準備

注:適切な外科室と無菌状態で処置を行うことをお勧めします。手術用具は熱(オートクレーブ、ガラスビーズの殺菌器)を使用して殺菌するか、または熱に敏感であれば高レベルの化学消毒剤を使用して消毒することができる。化学消毒を使用する場合は使用前に使用する前に、機器をすすい、または熱で消毒するときに冷却することができます。

1. 鉗子を使用して、注射注射器の針を先端から3mmで30°に曲げる。
   注:30 G のベベリング針でハミルトンの注射器を使用します。
2. 1mg/mLのエンドキシフェン溶液を調製し、10%DMSOで希釈し、注射器に曲がった針を詰め戻します。
   注:化合物の5 μLを投与して、成人C57Bl/6jマウス(ca. 25-30 g)の髄膜細胞の広範囲にわたる暴露を確実にしますが、異なる年齢や株の動物を治療する際に、異なる濃度および注射量をテストするパイロット実験が必要な場合があります。
3. マウスのヘッドホルダーを調整して、口の部分が手術台の表面から約30°になるようにします。
   注:この手順では、3点固定(すなわち、耳と口)を持つ定位フレームも使用できます。しかし、この場合、動物は口の部分でのみ固定されますが、耳の棒は動物の前肢の下に拡張し、処置中に動物の体を支えるために使用することができます。

2. 麻酔の誘導

1. 注射用麻酔薬の場合は、地元の機関で獣医ユニットが推奨する濃度と投与モードを使用してください。
2. イオブルランなどの吸入麻酔薬については、メーカーの仕様に従って管理装置を用意します。
3. イオブルランを用いて、麻酔の誘導のために化合物の濃度を4%に設定した。
4. 400 mL/minの速度で空気を届ける。
5. 麻酔ユニットが数分間麻酔剤でチャンバーを満たし、その後、チャンバーにマウスを置きます。
   注:今回の実験では、Cx30-CreERおよびR26R-tdTomatoを持つ雄と雌のトランスジェニックマウスを、C57Bl/6jバックグラウンドで飼育した成人(>2ヶ月、約30g)を用いた。
6. 麻酔の誘導の間に動物を監視する。マウスが完全麻酔下にある場合、呼吸パターンは遅くなるはずです。
7. チャンバーから動物を取り除き、後足を繊細につまんで足反射の抑制を確認します。
   注:反射はまだ存在するかもしれませんが、数秒遅れます。その場合は、足反射の完全な抑制が達成されるまで、動物をチャンバーに戻します。
8. 鎮痛薬(例えば、カルプロフェン、皮下注射による5mg/kg)を投与し、術後の疼痛管理を支援する。

3. 処置のための動物の位置決め

1. 動物の頭をヘッドホルダーに固定します。水槽マグナへのアクセス性を向上させるために、動物の体を表の表面から約30°、頭を下向きに位置し、体の残りの部分と120°の角度を確立し、首の後ろを延長して水槽マグナへのアクセスを容易にする(図1A)。
2. 手順を通して体を支えるために、動物の下にペーパータオルを追加します。
3. 口の部分を通して麻酔の配達を安全にし、イオブルランの濃度を2.5%に減らし、空気送達を200 ml/minに減らす。
4. 眼科軟膏を適用します。

4. シスターナマグナの暴露

1. 動物の首の後ろを剃り、70%エタノールとベタジンで地域を消毒します。
2. 手術用ハサミを使用して、後頭部骨のレベルから始まり後部に伸長する中線切開(長さ7mm)を行う。
3. 細かい先端ピンセットで中線から横に引っ張る表面的な結合組織と首の筋肉を穏やかに分離します。これは、逆三角形として形作られたシステルナマグナを重ね合わせ、硬膜を露出します。
4. 結果として生じる出血を制御するために無菌吸収槍または綿棒を使用してください。
5. 首の筋肉を脇に引っ張って維持し、手順全体の水槽のマグナの視覚化を可能にするために小さな外科用分離器を配置します。

5. インタビシナルインジェクション

1. 水槽マグナへのアクセスを得るために、後頭部骨の尾端を識別し、以前に下に曲がっていた針を挿入する。
   注:硬膜が穿刺されると、抵抗が急激に低下します。しかし、針の先端は、そのフック形状のおかげで、髄膜表面の下にわずかに浸透します。
2. 硬膜が穿穿付されたら、針を頭蓋骨に「引っ掛ける」ために、注射器を動物の体に優しく引っ張って動物の体に平行に引っ張って、針の曲がった先端が硬膜表面の下に浸透することを許可する(図1Bを参照)。これにより、より良い安定性が確保され、針が深く貫通するのを防ぎ、基礎となる小脳や髄質を損傷するリスクを回避します。
3. 脳脊髄液の自然な流れとの干渉を避けるために、化合物をゆっくりと注入します。
   注:実験の目的に応じて、輸液速度が異なる場合があります。遅くて安定した注入速度が必要な場合(例えば、脳脊髄液の動きを追跡する手順を使用する場合)、シリンジと組み合わせて自動化されたマイクロ注入システムを使用することをお勧めします。
4. 注射後、針を1分間部位に置き、慎重に取り外します。細かい先端鉗子を使用して、針を引っ掛けた位置から引き込むのを助けます。
   注:細い針(例えば、30G)の使用は髄膜の実質的な損傷、および結果的に脳脊髄液の流出をもたらさない。より大きな針のサイズが必要な場合は、無菌綿先端を使用して注射部位に圧力をかけることによって、流体の漏れを止めることをお勧めします。

6. 手続きと術後ケアの締結

1. セパレータを取り外し、筋肉が硬膜を重ねた元の位置に戻るようにします。
2. シアノアクリル酸接着剤を数滴使用して皮膚切開を閉じます。
   注:あるいは、吸収性縫合糸(例えば、5-0ビリル縫合糸)を使用し、中断されたステッチで皮膚切開を閉じる。
3. 切開部位に局所麻酔薬(例えば、5%リドカインの100 μL)を塗布します。
4. 動物をホルダーから取り出し、暖房パッドの上に置いたきれいなケージに入れます。意識を取り戻すまで動物を監視します。
   注:この処置は、動物に長期的な痛みや苦痛を引き起こすとは考えられていない。それにもかかわらず、マウスは術後の最初の日のために注意深く監視されるべきであり、痛みの軽減措置は必要と認められるときに、そしてあなたの機関の獣医ユニットによって提供される勧告に従って行われるかもしれない。

結果

Cx30プロモーター¹³と誘導蛍光レポーターの下でCreERを発現するトランスジェニックマウスにおけるエンドキシフェンのインタシビサーナル注射は、皮質中の隣接するCx30発現表面およびパレンキカルアストロサイトに標識することなく、レプトメニンゲン細胞の特異的な組み換えを可能にする(図1)。システルナマグナへのアクセ?...

ディスカッション

ここで概説するプロトコルは、運命マッピングのためにレプトメニンゲ細胞にラベルを付ける簡単で再現可能な手順を示しています。我々は、Cx30-CreERでtdTomato蛍光レポーターの発現を誘導するために、タモキシフェンの活性代謝産物であるエンドキシフェンのインタセラシサーナル注射を使用する。R26R-tdトマトマウス^12,,13.

シ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia unit	Univentor 410	8323102	Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane)	Baxter Medical AB	000890
Betadine	Sigma-Aldrich	PVP1
Carprofen	Orion Pharma AB	014920	Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue	Carl Roth	0258.1	Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue	Stoelting	50479
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Endoxifen	Sigma-Aldrich	E8284
Ethanol 70%	Histolab	01370
Hamilton syringe (30 G beveled needle)	Hamilton	80300
Lidocaine	Aspen Nordic	520455
Mouse head holder	Narishige International	SGM-4	With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Shaver	Aesculap	GT420
Sterile absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator	World Precision Instrument	501897
Tweezers	Dumont	11251-35
Viscotears	Bausch&Lomb Nordic AB	541760