反向转录循环介导的等温放大（RT-LAMP）测定，用于对罗非鱼湖病毒进行特定和快速检测

摘要

与传统RT-PCR技术相比，我们提出了一种RT-LAMP测定方法，用于在相对较短的时间内使用简单的仪器检测罗非鱼中的TiLV。该议定书可能有助于控制TiLVD的流行传播，特别是在发展中国家。

摘要

罗非鱼湖病毒病（TiLVD）是罗非鱼湖病毒（TiLV）引起的罗非鱼病毒病，是水产养殖业的一个长期挑战，导致世界许多地区罗非鱼的大规模发病率和死亡率。因此，有必要对TiLV感染进行有效、快速和准确的诊断检测，以检测最初的感染并防止该病在水产养殖中传播。本研究提出了一种高度灵敏、实用的逆转录环介导的等温放大（RT-LAMP）方法，以检测鱼组织中的罗非鱼湖病毒。对受感染样本的RT-qPCR和RT-LAMP检测的比较显示，63（100%）有阳性结果和 51 （80.95%）样本。此外，对未感染样本的分析表明，所有63个未受感染组织均对RT-qPCR和RT-LAMP检测均产生阴性结果。使用RT-LAMP评估了罗非鱼中5种病原体的交叉反应，所有测试均显示阴性结果。从受感染的鱼获得的肝脏和粘液样本均显示使用RT-LAMP方法的可比结果，表明粘液可用于RT-LAMP作为非致命性检测，以避免杀死鱼。结果表明，该检测结果表明，在1小时内对罗非鱼组织进行TiLV检测提供了一种有效的方法。因此，该方法推荐作为农场的筛选工具，用于快速诊断TiLV。

引言

罗非鱼湖病毒病（TiLVD）是罗非鱼病毒性疾病，据说在世界许多地区，包括亚洲^1、2、2非洲和美国，导致罗非鱼死亡。¹该病于2009年在以色列罗非鱼大规模死亡期间首次得到确认，金内雷特湖的野生罗非鱼数量^从每年257吨急剧下降到8吨。这种疾病是由罗非鱼湖病毒（TiLV）引起的，该病毒已被分配给安农韦里达家族作为一种新的属罗拉平病毒和新物种罗非鱼罗拉平病毒^3。TiLV的基因特征表明，该病毒是一种新型的包络、负感、单链RNA病毒，具有10个片段编码10个蛋白质^{1,1、2、4。,4}各种品种的罗非鱼属萨罗罗罗登，奥利奥米米，和提拉平和其他温水鱼（如，巨型葫三（奥斯罗莫斯戈拉米）已被证明易受TiLV^22，5。5目前，这种病毒继续在全球传播，可能通过受感染的活鱼^66，77的运动，而通过冷冻罗非鱼或其产品传播病毒的风险是有限的^8。由于TiLV感染造成的大量死亡率有可能对罗非鱼行业产生重大有害的经济影响。例如，埃及夏季死亡率综合征与TiLV感染有关的经济影响计算为1亿^美元。因此，必须开发一种快速和适当的诊断方法，以促进在养鱼场控制这种疾病。

到目前为止，TiLVD的诊断一直基于分子检测、病毒隔离和组织病理学。不同的PCR协议和引素已经开发为TiLV诊断^{10，11。10,}例如，一种基于SYBR的绿色反向转录定量PCR（RT-qPCR）方法，其检测灵敏度为仅两个拷贝/μL，用于TiLV检测^10。其他用于TiLV检测的PCR方法包括TaqMan定量PCR11、RT-PCR^2、嵌套RT-PCR12和半嵌套¹¹RT-PCR13。¹²¹³然而，这些方法需要先进的实验室设备和相对较长的时间来产生结果，由于反应的复杂性，这使得它们不适合现场应用。

循环介导的等温放大（LAMP）测定是一种快速、简单、实用的场内应用^{14、15。14,}该技术采用绞线位移反应原理，而扩增反应在等温条件下运行，没有复杂和昂贵的热循环器^{14，15。14,}因此，放大的LAMP产品或RT-LAMP产品在阶梯状带中进行分析，使用加糖凝胶电泳，带有荧光染色，以安全可视化DNA或RNA^14，或用肉眼观察是否存在浊度或白色沉淀^{物16、17、18。,17,18}由于这些原因，该技术已用于现场检测不同的鱼类病原体17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27。^{17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}本研究的目的是建立一个快速，敏感和准确的RT-LAMP检测的TiLV检测。RT-LAMP测定在30分钟内提供鱼样中TiLV的筛选。该技术可应用于TiLVD的诊断和监测。

研究方案

这项涉及使用动物组织的实验，得到了泰国曼谷卡塞萨特大学机构动物护理和使用委员会的批准（协议号为ACKU61-VET-009）。

1. 组织收集

1. 使用过量的丁香油（即超过3 mL/升）对罗非鱼进行安乐死。三氯苯甲烷硫化剂可用作丁香油的替代品。
2. 使用无菌的梅奥剪刀和钳子切开死后罗非鱼的腹部，切除约30-50毫克的肝脏组织，或使用显微镜盖玻璃，通过纵向刮鱼皮层（从前到后）到1.5mL微离心管收集100μL粘液。
3. 立即进入RNA提取步骤，或将采集的样品保持在+80°C，直到实验。由于完整的RNA比DNA更敏感，因此在RNA提取过程中使用无RNase材料和试剂。

2. RNA 提取

1. 要从肝脏组织中提取RNA，将30~50毫克的罗非鱼组织加入1.5mL微离心管中，该管含有600~1000μL的亚硫酸-苯酚萃取试剂（材料表），然后用手持组织均质器粉碎样品，直到均匀化。组织样本需要大约10%的硫酸-苯酚萃取试剂。对于粘液样品，仅使用300μL的硫酸-苯酚萃取试剂（3:1）。
   注意:甲酸-苯酚萃取试剂有毒;因此，处理必须谨慎进行。必须佩戴安全眼镜、实验室长袍和安全手套等防护设备。
2. 在室温下将均质样品在 10，000 x g下 30 s 进行离心机，并将上清液转移到新的无菌 1.5 mL 微离心管中。
3. 在管子中加入95%乙醇的同等体积，搅拌均匀。
4. 将溶液转移到一个自旋柱（材料表），放置在收集管和离心机在10，000 x g在室温下30s。丢弃流通，并将旋转柱传输到新的收集管。
5. 在室温下，在10，000 x g下加入400 μL的RNA预洗试剂（材料表），在30s下在30s下离心。再次重复此步骤。
   注:要制备RNA预洗涤，将10 mL的95%乙醇加入40 mL的RNA预洗涤浓缩物。
6. 在室温下，将700μL的RNA洗涤缓冲液（材料表）添加到柱中，并在10，000 x g下离心2分钟。将柱转移到无菌的 1.5 mL 微离心管中。
   注:要制备RNA洗涤缓冲液，在RNA洗涤缓冲液浓缩物的12 mL中加入52 mL的95%乙醇。
7. 在旋转柱基质中捕获的RNA样品，在室温下用100 μL的无核酸酶和离心机在10，000 x g下30s。
8. 使用微量分光光度计测量提取的RNA的浓度，并使用无核酸酶将RNA稀释到所需的浓度。
   注:OD260/OD280 的合格吸收值范围从 1.6 到 1.9，指示 RT-LAMP 测定可接受的 RNA 纯度。
9. 立即继续下一步，或将样品保持在 +80°C，直到使用为止。

3. 引素设计

1. 使用引版资源管理器版本 4 设计 RT-LAMP 的特定引版。转到网站，https://primerexplorer.jp/e/，然后单击 PrimerExplorer V4 按钮。
2. 选择包含 FASTA 格式的 TiLV 段 3 序列的文件，然后单击"引版设计"按钮。
   注: 从 GenBank 加入编号 KX631923 检索 FASTA 格式的序列，该编号表示罗非鱼湖病毒 TV1 段 3¹。
3. 要设计引素，输入以下基本参数:
   - GC 含量为 40%~60%
   - 280 对碱基对的安培（bp）
   - 底漆中相似熔融温度 （Tm），最大差值为 5 °C
   注:引信不能相互补充
   1. 避免序列区域容易形成二次结构。
   2. 选择最小 ±3.5 的二角底漆分析，以获得最佳 μG 的最佳设计，并选择最大 +4 的底漆端，以便为较小的 μG 设计最佳设计。
4. 单击"生成"按钮。
   注: 软件完成输入数据处理后，将显示引信结果（图 1）。

4. RT-LAMP测定

1. 制备RT-LAMP主混合物，含有2.5μL的1x SD II反应缓冲液，3 μL的6₄mM MgSO 4，1.4 μL的1.4 mM dNTP集，4 μL的0.8M贝塔因，1.3 μL0.052m卡辛混合物，1 μL 1.6μM TiLV-F3底漆， 1 μL 1.6 μM TiLV-B3 底漆，1 μL 0.2 μM TiLV-BIP 底漆，1 μL 0.2 μM TiLV-FIP 底漆，1 μL 0.3 U Bst DNA 聚合酶，1 μL 0.1 U AMV 逆转录酶，以及 3.8 μL 无核酸酶水。
   注:准备至少占总反应量10%的过量主混合物。
2. 将 RT-LAMP 主混合物的 22 μL 分配到无菌的 1.5 微离心管中。
3. 在反应管中加入3μL的提取RNA，并通过涡旋混合样品。对于负控制，使用蒸馏水代替RNA材料。
4. 在65°C下孵育反应60分钟，然后80°C10分钟终止反应。
5. 孵育后，用肉眼目视观察色度变化。阳性结果将显示为荧光绿色。

5. 阿加罗斯凝胶电泳

1. 通过在 40 mL 的 1x TAE 缓冲液中悬浮 0.6 g 的琼脂粉，制备 1.5% 的 a/v 琼脂糖凝胶。在微波炉中加热3~5分钟，直到琼脂完全溶解，然后旋转混合混合物，将混合物熔化。
2. 让琼脂冷却，直到温度达到 65 °C。将 40 mL 的琼脂溶液倒入凝胶托盘，并在凝胶模具中加入梳子。
3. 让琼脂胶在室温下设置 20~30 分钟，直到完全凝固。然后取出梳子，将凝胶放入凝胶罐中。
4. 添加运行缓冲液以覆盖凝胶罐中的凝胶表面。
5. 将 RT-LAMP 样品的 10 μL 和 2 μL 的 6x 凝胶加载缓冲液添加到每个井中。将 5 μL 的 1 kb DNA 梯级添加到参考通道。
6. 插入连接到阴极和连接到电源的阳极的盖子。打开电源，将其设置为恒定 100 V，然后运行 40 分钟。
7. 完成凝胶分离后，从凝胶托盘中取出凝胶。然后用溴化二苯（EtBr）浓度在10mg/mL的浓度下染色排空凝胶7分钟，并将其留在蒸馏水中5分钟。
   注意:EtBr是有毒的，被认为是一种致癌物质;因此，使用此代理时要小心。
8. 使用带子出现的凝胶文档系统将凝胶暴露在紫外线下，并拍摄凝胶的照片。

6. 补充DNA（cDNA）合成

1. 制备含有2 μL 5x RT缓冲液、0.5 μL底漆混合物、0.5 μL RT酶和2 μL无核酸酶的cDNA合成主混合物。
   注:准备多余的主混合物，包括1倍的反应，由于潜在的损失在移液期间。
2. 将5μL的主混合物分配到无菌的1.5mL微离心管中。
3. 将稀释后的提取RNA（从步骤2.8获得）的100纳克加入反应管，混合并向下旋转，将所有混合物移到容器底部。
4. 在42°C下孵育反应60分钟，随后在PCR机器中孵育98°C5分钟。将 cDNA 储存在 +20 °C，直到使用。

7. RT-qPCR

1. 制备含有0.3 μL 10μM反向底漆、0.3 μL 10 μM正向底漆、5 μL 2x SYBR绿色DNA聚合酶和0.4 μL无核酸酶水的TiLV qPCR主混合物。使用以下引素和控件:
   前进引物（TiLV-112F）:5'-CTGAGCTAGAGATGGATT-3'
   反向引物 （TiLV-112R）: 5'-CGGCGTACTTTAGTCTCT-3'
2. 将 TiLV qPCR 主混合物的 6 μL 分配到与所用实时热循环器兼容的 qPCR 条的每个井中。
3. 加入4 μL的cDNA模板，负对照（无核酸酶），正控制（10 pg/μL），和pTiLV（质粒^）10或连续稀释的TiLV质粒到井中，并通过轻拂混合每个样品。以三脚三联的方式执行每个样品。
4. 将 qPCR 反应放入编程的实时热循环器中。将qPCR程序设置为在95°C下进行孵育3分钟，然后40个周期95°C，10 s和60°C，在熔融曲线步骤之前，温度需要在0.5°C/5的增量下从65°C增加到95°C。
5. 通过评估放大曲线和熔融曲线进行数据分析，然后使用序列稀释的质粒从数据中获取的标准曲线计算 TiLV 拷贝的数量。

结果

在这项研究中，开发了RT-LAMP检测，以检测罗非鱼的TiLV感染。2015年至2016年间，从泰国不同地区的14个农场采集了经测试的样本。受感染和未感染的鱼主要根据身体诊断和有症状的TiLVD的出现进行分组。TiLV感染随后在收集过程后使用RT-PCR得到确认。选择阿加罗斯凝胶电泳和发光绿色检测作为LAMP安培的评估方法（图2）。受感染和未感染的罗非鱼的肝脏和粘液的特点是TiLV疾病症?...

讨论

水产养殖业不断受到病毒感染的威胁，造成直接经济损失^{99、23、28。23,28}例如，世界上许多地区的罗非鱼生产国对罗非鱼生产国构成重大^{1,6,威胁。}到目前为止，还没有特定的治疗药物可用于预防TiLVD。虽然疫苗的开发正在进行中，但高效疫苗在可用于商业目...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue collection:
Clove oil	Better Pharma	N/A
Tricaine methanesulfonate	Sigma-Aldrich	E10521	An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent)	ThermoFisher Scientific Corp.	15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent)	Geneaid	GZR100
Direct-zol RNA Kit:	Zymo Research	R2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash Buffer
- DNase/RNase-free water
- Zymo-spin IIICG columns
- Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction buffer	Biotechrabbit	BR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	7487-88-9
dNTP set	Bioline	BIO-39053
Betaine	Sigma-Aldrich	B2629
Calcein mixture	Merck	1461-15-0
Bst DNA polymerase	Biotechrabbit	BR1101301
AMV reverse transcriptase	Promega	M510A
Nuclease-free water	Invitrogen	10320995
Elite dry bath incubator, single unit	Major Science	EL-01-220
Gel electrophoresis:
Agarose	Vivantis Technologies	PC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer	Sigma-Aldrich	SRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
- Tris	Vivantis Technologies	PR0612-1KG
- Acetic acid (glacial), EMSURE	Merck Millipore	1000632500
- Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec	Sigma-Aldrich	V800170-500G
Neogreen	NeoScience Co., Ltd.	GR107
DNA gel loading dye (6X)	ThermoFisher Scientific Corp.	R0611
DNA ladder and markers	Vivantis Technologies	PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system)	Bio-Rad	1704487
PowerPac HC power supply	Bio-Rad	1645052
Gel Doc EZ System	Bio-Rad	1708270
UV sample tray	Bio-Rad	1708271
NαBI imager	Neogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT Kit	Toyobo	FSQ-101
Viva cDNA Synthesis Kit	Vivantis Technologies	cDSK01	An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer)	ThermoFisher Scientific Corp.	ND-2000
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725120
Nuclease-free water, sterile water	MultiCell	809-115-CL
8-tube PCR strips, white	Bio-Rad	TLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, optical	Bio-Rad	TCS0803
CFX96 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1855196
General equipment and materials:
Mayo scissors		N/A
Forceps		N/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer)	Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60	LioFuge	CM610
Corning LSE mini microcentrifuge	Corning	6765
Pipettes	Rainin	Pipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tips	Quality Scientific Plastics	TF series
Corning Isotip filtered tips	Merck	CLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST	Wuxi NEST Biotechnology	615601