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요약

우리는 기존의 RT-PCR 기술에 비해 상대적으로 짧은 기간 동안 간단한 악기를 사용하여 틸라피아 물고기에서 TiLV의 검출을위한 RT-LAMP 분석법을 제시한다. 이 프로토콜은 특히 개발도상국에서 TiLVD의 전염병 확산을 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다.

초록

틸라피아 호수 바이러스(TiLVD)는 틸라피아 호수 바이러스(TiLV)에 의한 틸라피아의 새로운 바이러스 질환으로, 전 세계 많은 지역에서 틸라피아의 대량 이환율과 사망률을 초래한 양식 산업에서 지속적인 과제입니다. 따라서 TiLV 감염에 대한 효과적이고 신속하며 정확한 진단 분석법은 초기 감염을 감지하고 양식 농업에서 질병의 확산을 방지하는 데 필요합니다. 본 연구에서, 매우 민감하고 실용적인 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 방법은 어류 조직에서 틸라피아 호수 바이러스를 검출하기 위해 제시된다. 감염된 샘플의 RT-qPCR 및 RT-LAMP 검문 결과를 비교한 결과 63개(100%)에서 긍정적인 결과가 나타났습니다. 51 (80.95%) 각각 샘플을 채취한다. 더욱이, 감염되지 않은 견본의 분석은 모든 63의 감염되지 않은 조직이 RT-qPCR 및 RT-LAMP 분석결과 둘 다에 대한 부정적인 결과를 산출한다는 것을 보여주었습니다. 틸라피아에 있는 5개의 병원체를 가진 교차 반응성은 RT-LAMP를 사용하여 평가되고, 모든 시험은 부정적인 결과를 보여주었습니다. 감염된 물고기에게서 얻은 간 및 점액 견본 둘 다 RT-LAMP 방법을 사용하여 비교 결과를 보여주었습니다, 점액이 물고기를 죽이는 것을 피하기 위하여 비치명적인 분석으로 RT-LAMP에서 사용될 수 있다는 것을 건의합니다. 결론적으로, 제시된 RT-LAMP 분석법은 1시간 이내에 틸라피아 조직에서 TiLV 검출을 위한 효과적인 방법을 제공한다는 것을 입증하였다. 이 방법은 따라서 TiLV의 신속한 진단을 위한 농장에서 검열 공구로 추천됩니다.

서문

틸라피아 호수 바이러스 질환(TiLVD)은 아시아1,2,2아프리카 및 미국을 포함한 세계의 많은 지역에서 틸라피아 사망을 유발하는 틸라피아(Oreochromis spp.)의 바이러스 성 질환이다. 이 질병은 2009년 이스라엘에서 틸라피아의 대량 사망률에서 처음 인식되었으며, 키너렛 호수의 야생 틸라피아 수는 연간 257톤에서8톤으로급격히 감소했습니다 2. 이 질병은 틸라피아 호수 바이러스(TiLV)에 의해 발생하며, 이는 새로운 종인 틸라핀바이러스와 새로운 종틸라피네바이러스3로 가족암누온비리대에 할당되었다. TiLV의 유전적 특성은 바이러스가 10개의 단백질을11,2,,4를인코딩하는 10개의 세그먼트를 가지는 새로운 포위, 음성 감각, 단일 가닥 RNA 바이러스임을 보여주었다. 사로테오돈, 오레오로미스, 틸라핀 및 기타 따뜻한 물 물고기(예를 들어, 거대 가라미(Osphronemusgoramy))의다양한 종은 TiLV2,,5에취약한 것으로 나타났습니다. 현재, 이 바이러스는 감염된 살아있는 물고기의 움직임을 통해 아마도 전 세계적으로 확산계속6,,7,냉동 틸라피아 또는 그 제품을 통해 바이러스 전송의 위험이 제한되는 동안8. TiLV 감염으로 인한 실질적인 사망률은 틸라피아 산업에 상당한 해로운 경제적 영향을 미칠 가능성이 있다. 예를 들어, TiLV 감염과 관련된 이집트의 여름 사망 증후군의 경제적 영향은 미화 1억 달러9로계산되었습니다. 따라서, 어류 양식장에서 이 질병의 통제를 용이하게 하기 위해 신속하고 적절한 진단 방법을 개발하는 것이 중요하다.

지금까지 TiLVD의 진단은 분자 분석, 바이러스 격리 및 조직 병리학에 기반을 두고 있습니다. 다른 PCR 프로토콜 및 프라이머는 TiLV 진단10,,11을위해 개발되었습니다. 예를 들어, 바이러스의 2개의 사본/μL만큼 적은 수의 검출을 위한 민감성을 가진 SYBR 녹색 기반 역전사 정량적 PCR(RT-qPCR) 방법은 TiLV 검출을 위해 개발 및 검증되었다10. TiLV 검출을 위한 다른 PCR 방법은 TaqMan 양적 PCR11,RT-PCR2,중첩 된 RT-PCR12및 반 중첩 된 RT-PCR13을포함한다. 그러나 이러한 방법은 반응의 복잡성으로 인해 결과를 산출하기 위해 정교한 실험실 장비와 비교적 오랜 시간이 필요하므로 현장 적용에 적합하지 않습니다.

루프 매개 등등 증폭(LAMP) 분석은 신속하고 간단하며 실용적인 현장 용 어플리케이션14,,15이다. 이 기술은 가닥 변위 반응의 원리를 채택하고 증폭 반응은 정교하고 고가의 열 사이클러(14,,15)없이등온 조건하에서 실행됩니다. 따라서 증폭된 LAMP 제품 또는 RT-LAMP 제품은 DNA 또는 RNA14의 안전한 시각화를 위해 형광 얼룩을 가진 아가로즈 겔 전기영동을 이용한 사다리형 밴드로 분석되거나 탁도 또는 백색 침전물의 존재에 대한 육안으로관찰16,,17,,18. 이러한 이유로, 이 기술은 상이한 어류 병원체17, 18,,19,,20,,19,21,,22,,23,24,,,25,,26,,27의현장 검출에 사용되어 왔다. 이 연구의 목적은 TiLV 검출을 위한 신속하고 민감하며 정확한 RT-LAMP 분석방법을 확립하는 것이었습니다. RT-LAMP 분석기는 30분 이내에 물고기 샘플에서 TiLV에 대한 스크리닝을 제공합니다. 이 기술은 TiLVD의 진단 및 감시를 위해 적용될 수 있다.

프로토콜

동물 조직의 사용을 관련시킨 이 실험은, 카세셋 대학, 방콕, 태국의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 번호 ACKU61-VET-009).

1. 조직 수집

  1. 정향 오일의 과다 복용을 사용하여 틸라피아 물고기를 안락사 (즉, 3 mL / L 이상). 트리카인 메탄설포네이트는 정향 오일의 대안으로 사용될 수 있습니다.
  2. 멸균 마요네즈 가위와 집게를 사용하여 포스트 모템 틸라피아의 복부를 열고 간 조직의 약 30-50 mg을 절제하거나 현미경 커버 유리를 사용하여 물고기 피부 층을 세로로 긁어 서 점액 100 μL을 1.5 mL 마이크로 센트리 튜브로 수집하십시오.
  3. RNA 추출 단계를 즉시 진행하거나 실험전까지 수집된 샘플을 -80°C에서 유지한다. 손상되지 않은 RNA는 DNA보다 더 민감하기 때문에 RNA 추출 중에 RNase 가없는 물질과 시약을 사용하십시오.

2. RNA 추출

  1. 간 조직에서 RNA를 추출하려면 틸라피아 조직의 30-50 mg을 구니디늄 산-페놀 추출 시약 600-1,000 μL을 함유한 1.5 mLTable of Materials미세원심지 튜브에 넣고 휴대용 조직 균질화를 사용하여 균질화될 때까지 시료를 분쇄합니다. 조직 샘플은 구니디늄-산-페놀 추출 시약의 약 10%를 필요로 합니다. 점액 샘플의 경우 구니디늄-산-페놀 추출 시약(3:1)의 300 μL만 사용하십시오.
    주의: 구니디늄-페놀 추출 시약은 독성; 따라서 취급은 주의해야 합니다. 안전 안경, 실험실 가운 및 안전 장갑과 같은 보호 장비는 반드시 착용해야 합니다.
  2. 10,000 x g에서 실온에서 30s의 균질화된 샘플을 원심분리하고, 상구체를 새로운 멸균 1.5 mL 마이크로원심지 튜브로 옮긴다.
  3. 튜브에 95 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가하고 잘 혼합.
  4. 실온에서 30s에 대해 10,000 x g에서 수집 튜브 및 원심 분리기에 놓인 스핀 컬럼(재료 표)으로솔루션을 옮니다. 흐름을 취소하고 스핀 컬럼을 새 컬렉션 튜브로 전송합니다.
  5. 400 μL의 RNA 프리 워시 시약(재료 표)을실온에서 30 s동안 10,000 x g의 기둥과 원심 분리기에 넣고 흐름을 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
    참고: RNA 프리 워시를 준비하려면 RNA 프리 워시 농축액 40 mL에 95% 에탄올 10 mL를 추가하십시오.
  6. RNA 세척 버퍼(재료 표)의700 μL을 실온에서 2 분 동안 10,000 x g에서 열과 원심 분리기에 추가하십시오. 컬럼을 멸균 된 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김.
    참고: RNA 세척 버퍼를 준비하려면 RNA 워시 버퍼 농축액 12 mL에 95% 에탄올 52 mL를 추가하십시오.
  7. 스핀 컬럼 매트릭스에서 포획된 RNA 샘플을 실온에서 30초 동안 10,000 x g에서 100μL의 뉴클레아제 없는 물과 원심분리기를 사용하여 용해합니다.
  8. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 추출된 RNA의 농도를 측정하고 뉴클레아제 없는 물을 사용하여 원하는 농도로 RNA를 희석합니다.
    참고: OD260/OD280의 적격 흡광도 값은 1.6에서 1.9 사이로 RT-LAMP 분석에 허용되는 RNA 순도를 나타냅니다.
  9. 즉시 다음 단계로 진행하거나 사용 될 때까지 샘플을 -80 °C로 유지하십시오.

3. 프라이머 디자인

  1. 프라이머 탐색기 버전 4를 사용하여 RT-LAMP의 특정 프라이머를 디자인합니다. 웹 사이트로 이동하여 https://primerexplorer.jp/e/ PrimerExplorer V4 버튼을 클릭합니다.
  2. FASTA 형식으로 TiLV의 세그먼트 3 시퀀스가 포함된 파일을 선택한 다음 프라이머 디자인 버튼을 클릭합니다.
    참고 : 틸라피아 호수 바이러스 TV1 세그먼트 31을나타내는 GenBank 가입 번호 KX631923에서 FASTA 형식으로 시퀀스를 검색합니다.
  3. 프라이머를 디자인하려면 다음과 같은 기본 매개 변수를 입력합니다.
    - 40%-60%의 GC 콘텐츠
    - ≥280 염기 쌍 (bp)의 앰플리온
    - 최대 차인 프라이머 간에 5°C의 유사한 용융 온도(Tm)
    참고: 프라이머는 서로를 보완해서는 안 됩니다.
    1. 보조 구조물을 형성하는 경향이 있는 서열 영역을 피하십시오.
    2. 가장 큰 ΔG에 대한 최적의 설계를 위해 최소 -3.5의 디머 프라이머 해석을 선택하고 더 작은 ΔG에 대한 최적의 설계를 위해 최대 -4의 프라이머 끝을 선택합니다.
  4. 생성 단추를 클릭합니다.
    참고: 소프트웨어가 입력 데이터 처리를 완료하면 프라이머 결과가표시됩니다(그림 1).

4. RT 램프 분석

  1. 1x SD II 반응 완충제 2.5 μL, 6mM MgSO4,1.4 μL의 1.4 μL, 0.8m 베타인 4μL, 0.052 mM 칼세인 혼합물 1.3 μL, 1 μL 의 1 μL을 함유하는 RT-LAMP 마스터 믹스를 준비합니다. 1 μL 의 1.6 μM TiLV-B3 프라이머, 1 μL 의 0.2 μM TiLV-BIP 프라이머, 0.2 μM TiLV-FIP 프라이머의 1 μL, 0.3 U Bst DNA 폴리머의 1 μL, 0.1 U AMV 역전사, 3.8 μL의 핵항염.
    참고: 총 반응 량의 10% 이상을 포함하는 과잉 마스터 믹스를 준비한다.
  2. RT-LAMP 마스터 믹스의 22 μL을 멸균 된 1.5 마이크로 원심 분리 튜브에 분배하십시오.
  3. 추출된 RNA의 3 μL을 반응 튜브에 추가하고, 와류에 의해 샘플을 혼합한다. 부정적인 제어를 위해 RNA 물질 대신 증류수를 사용하십시오.
  4. 65°C에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 80°C를 10분 동안 배양하여 반응을 종료하였다.
  5. 배양 후 육안으로 색채 변화를 시각적으로 관찰하십시오. 긍정적인 결과는 형광 녹색으로 나타납니다.

5. 아가로즈 젤 전기 동동

  1. 1x TAE 완충액 40 mL에 아가로즈 분말 0.6 g을 일시 중단하여 1.5% w/v 아가로즈 젤을 준비합니다. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 3-5분 동안 전자레인지에 가열하여 혼합물을 녹이고 소용돌이를 섞습니다.
  2. 아가로오스가 온도가 65°C에 도달할 때까지 식힙니다. 아가로즈 용액 40 mL을 젤 트레이에 붓고 젤 몰드에 빗을 추가합니다.
  3. 아가로즈 젤이 완전히 굳어지때까지 실온에서 20-30분 동안 설정합니다. 그런 다음 빗을 제거하고 젤 탱크에 젤을 놓습니다.
  4. 겔 탱크에서 겔의 표면을 덮기 위해 실행 버퍼를 추가합니다.
  5. RT-LAMP 샘플 10 μL과 6x 젤 로딩 버퍼 2 μL을 각 웰에 추가합니다. 기준 차선에 1kb DNA 사다리 의 5 μL을 추가합니다.
  6. 음극과 전원 공급 장치에 연결된 양극에 연결된 뚜껑을 연결합니다. 전원 공급 장치를 켜고 일정한 100V로 설정하고 40 분 동안 실행하십시오.
  7. 겔 분리를 완료한 후, 겔 트레이에서 겔을 제거합니다. 그런 다음 에티듐 브로마이드(EtBr)를 사용하여 배수된 겔을 7분 동안 10 mg/mL의 농도로 염색하고 증류수에서 5분 동안 레스테인합니다.
    주의: EtBr은 독성이 있으며 발암 물질로 간주됩니다. 따라서 이 에이전트를 사용할 때는 주의해야 합니다.
  8. 밴드가 나타나는 젤 문서 시스템을 사용하여 자외선에 젤을 노출하고 젤의 사진을 찍습니다.

6. 상보DNA (cDNA) 합성

  1. 5x RT 완충제 2 μL, 프라이머 믹스 0.5 μL, RT 효소 0.5 μL, 반응당 2 μL의 뉴클레아제 없는 물을 함유하는 cDNA 합성 마스터 믹스를 준비합니다.
    참고: 파이펫팅 중 잠재적 손실로 인한 반응의 1배를 포함하는 과잉 마스터 믹스를 준비합니다.
  2. 마스터 믹스의 5 μL을 멸균 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 분배합니다.
  3. 희석된 추출 RNA(단계 2.8로부터 수득)의 100 ng를 반응 튜브에 넣고, 혼합하고 아래로 회전하여 모든 혼합물을 용기의 바닥으로 이동시켰다.
  4. 42°C에서 60분 동안 배양한 다음 PCR 기계에서 5분 동안 98°C를 배양하였다. 사용 될 때까지 cDNA를 -20 °C에서 보관하십시오.

7. RT-qPCR

  1. 반응당 0.3 μL의 10 μM 역프라이머, 0.3 μL의 10 μM 포워드 프라이머, 5 μL의 SYBR 그린 DNA 폴리머라제, 0.4 μL의 뉴클레아제 함유물을 함유하는 TiLV qPCR 마스터 믹스를 준비한다. 다음 프라이머 및 컨트롤을 사용합니다.
    포워드 프라이머 (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAgAGAGATATGGATT-3'
    리버스 프라이머 (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTTTTTTCAGTATAAGTTCT-3'
  2. TiLV qPCR 마스터 믹스의 6 μL을 사용된 실시간 열 사이클러와 호환되는 qPCR 스트립의 각 웰에 분배합니다.
  3. cDNA 템플릿의 4 μL, 음극 대조물 (뉴클레아제 없는 물), 양성 대조군 (10 pg/μL), 및 pTiLV (플라스미드)10 또는 직렬로 희석 된 TiLV 플라스미드를 웰에 넣고 각 샘플을 쓸어 넘기면서 혼합합니다. 각 샘플을 세 배로 실시합니다.
  4. qPCR 반응을 프로그래밍된 실시간 열 사이클러에 넣습니다. qPCR 프로그램을 3분 동안 95°C에서 인큐베이션을 수행한 다음, 온도가 0.5°C/5°S 증분에서 65°C에서 95°C로 증가해야 하는 용융 곡선 단계 전에 10s및 60s의 경우 95°C의 40 사이클을 수행합니다.
  5. 증폭 및 용융 곡선을 평가하여 데이터 분석을 수행한 다음 직렬로 희석된 플라스미드를 사용하여 데이터로부터 얻은 표준 곡선을 사용하여 TiLV 복사 수를 계산합니다.

결과

이 연구에서는, 틸라피아에서 TiLV 감염을 검출하기 위해 RT-LAMP 분석이 개발되었다. 테스트된 샘플은 2015년과 2016년 사이에 태국의 다른 지역에 위치한 14개의 농장에서 수집되었습니다. 감염되고 감염되지 않은 물고기는 주로 물리적 인 진단과 증상 TiLVD의 출현에 따라 그룹화되었습니다. TiLV 감염은 수집 과정 후 RT-PCR을 사용하여 이후에 확인되었다. 아가로즈 겔 전기동동및 발광 녹색의 검출은 LAM...

토론

양식 산업은 지속적으로 상당한 경제적 손실을 일으키는 바이러스 감염에 의해위협9,,,23,28. 예를 들어, 신흥 TiLV는 세계1,,6,,9의많은 지역에서 틸라피아 생산 국가에 큰 위협을 제기한다. 지금까지, TiLVD를 방지 하기 위해 사용할 수 있는 특정 치료 되었습니?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 프로젝트는 태국 연구 기금 (TRF) 교부금 번호 RDG6050078 및 고급 연구 센터, 고급 연구 연구소, 카세차르트 대학, 방콕, 태국 고등 교육 연구 진흥 및 태국 국립 연구 대학 프로젝트, 고등 교육위원회 사무실, 교육청, 태국에 의해 재정적으로 지원됩니다. 이 연구는 카세사르 대학 대학원의 대학원 프로그램 장학금에 의해 부분적으로 지원됩니다. 저자는 비디오의 이야기 말하기에 대한 박사 Kwanrawee 시리칸차나 감사하고 비디오를 편집 피야 와카라 시카린.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue collection:
Clove oilBetter PharmaN/A
Tricaine methanesulfonateSigma-AldrichE10521An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent)ThermoFisher Scientific Corp.15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent)GeneaidGZR100
Direct-zol RNA Kit:Zymo ResearchR2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash Buffer
- DNase/RNase-free water
- Zymo-spin IIICG columns
- Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction bufferBiotechrabbitBR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-Aldrich7487-88-9
dNTP setBiolineBIO-39053
BetaineSigma-AldrichB2629
Calcein mixtureMerck1461-15-0
Bst DNA polymeraseBiotechrabbitBR1101301
AMV reverse transcriptasePromegaM510A
Nuclease-free waterInvitrogen10320995
Elite dry bath incubator, single unitMajor ScienceEL-01-220
Gel electrophoresis:
AgaroseVivantis TechnologiesPC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) bufferSigma-AldrichSRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
- TrisVivantis TechnologiesPR0612-1KG
- Acetic acid (glacial), EMSUREMerck Millipore1000632500
- Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), VetecSigma-AldrichV800170-500G
NeogreenNeoScience Co., Ltd.GR107
DNA gel loading dye (6X)ThermoFisher Scientific Corp.R0611
DNA ladder and markersVivantis TechnologiesPC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system)Bio-Rad1704487
PowerPac HC power supplyBio-Rad1645052
Gel Doc EZ SystemBio-Rad1708270
UV sample trayBio-Rad1708271
NαBI imagerNeogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101
Viva cDNA Synthesis KitVivantis TechnologiescDSK01An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer)ThermoFisher Scientific Corp.ND-2000
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725120
Nuclease-free water, sterile waterMultiCell809-115-CL
8-tube PCR strips, whiteBio-RadTLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, opticalBio-RadTCS0803
CFX96 Touch Thermal CyclerBio-Rad1855196
General equipment and materials:
Mayo scissorsN/A
ForcepsN/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer)Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60LioFugeCM610
Corning LSE mini microcentrifugeCorning6765
PipettesRaininPipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tipsQuality Scientific PlasticsTF series
Corning Isotip filtered tipsMerckCLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NESTWuxi NEST Biotechnology615601

참고문헌

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