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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Vi presentiamo un saggio RT-LAMP per la rilevazione di TiLV nel pesce tilapia utilizzando strumenti semplici per un periodo di tempo relativamente breve rispetto alle tecniche RT-PCR convenzionali. Questo protocollo può aiutare a controllare la diffusione epidemica di TiLVD, soprattutto nei paesi in via di sviluppo.

Abstract

La malattia virale del lago Tilapia (TiLVD), una malattia virale emergente nella tilapia causata dal virus del lago tilapia (TiLV), è una sfida persistente nell'industria dell'acquacoltura che ha portato alla morbilità di massa e alla mortalità della tilapia in molte parti del mondo. Un test diagnostico efficace, rapido e accurato per l'infezione da TiLV è quindi necessario per rilevare l'infezione iniziale e prevenire la diffusione della malattia nell'agricoltura dell'acquacoltura. In questo studio, viene presentato un metodo di amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa (RT-LAMP) altamente sensibile e pratico e pratico nel tessuto ittico. Un confronto dei saggi RT-qPCR e RT-LAMP di campioni infetti ha rivelato risultati positivi in 63 (100%) e 51 (80,95%) campioni, rispettivamente. Inoltre, un'analisi di campioni non infetti ha mostrato che tutti i 63 tessuti non infetti hanno prodotto risultati negativi sia per i saggi RT-qPCR che RT-LAMP. La reattività incrociata con cinque agenti patogeni in tilapia è stata valutata utilizzando RT-LAMP, e tutti i test hanno mostrato risultati negativi. Sia i campioni di fegato che di muco ottenuti da pesci infetti hanno mostrato risultati comparabili utilizzando il metodo RT-LAMP, suggerendo che il muco può essere utilizzato in RT-LAMP come un saggio non letale per evitare di uccidere i pesci. In conclusione, i risultati hanno dimostrato che il test RT-LAMP presentato fornisce un metodo efficace per il rilevamento TiLV nel tessuto tilapia entro 1 h. Il metodo è quindi raccomandato come strumento di screening nelle aziende agricole per la diagnosi rapida di TiLV.

Introduzione

La malattia da virus del lago Tilapia (TiLVD) è una malattia virale in tilapia (Oreochromis spp.) che, secondo quanto riferito, causa la morte di tilapia in molte regioni del mondo, tra cui Asia1,2, Africa e America. La malattia è stata riconosciuta per la prima volta durante la mortalità di massa di tilapia nel 2009 in Israele, dove il numero di tilapia selvatici nel lago Kinneret è crollato drammaticamente da 257 a 8 tonnellate all'anno2. La malattia è causata dal virus del lago tilapia (TiLV), che è stato assegnato alla famiglia Amnoonviridae come un nuovo genere Tilapinevirus e una nuova specie Tilapia tilapinevirus3. La caratterizzazione genetica di TiLV ha mostrato che il virus è un nuovo virus a singolo filo avvolto, dal senso negativo, che ha 10 segmenti che codificano 10 proteine1,2,4.4 Varie specie di tilapia del genere Sarotherodon, Oreochromis, tilapina e altri pesci d'acqua calda (ad esempio, gourami gigante (Osphronemus goramy)) hanno dimostrato di essere suscettibili a TiLV2,5. Attualmente, questo virus continua a diffondersi a livello globale, possibilmente attraverso il movimento di pesci vivi infetti6,7, mentre il rischio di trasmissione virale tilapia congelati o il suo prodotto è limitato8. Mortalità sostanziale dovuta all'infezione da TiLV ha il potenziale per avere un impatto economico significativamente dannoso sull'industria della tilapia. Ad esempio, l'impatto economico della sindrome della mortalità estiva in Egitto associata all'infezione da TiLV è stato calcolato per essere di 100 milioni di dollari9. Di conseguenza, è importante sviluppare un metodo diagnostico rapido e adeguato per facilitare il controllo di questa malattia negli allevamenti ittici.

Fino ad ora, la diagnosi di TiLVD si è basata su saggi molecolari, isolamento virale e istopatologia. Diversi protocolli PCR e primer sono stati sviluppati per la diagnosi TiLV10,11. Ad esempio, è stato sviluppato e convalidato un metodo PCR quantitativo (RT-qPCR) di trascrizione inversa basato sul verde SYBR con la sensibilità di rilevare solo due copie/L del virus che è stato sviluppato e convalidato per il rilevamento TiLV10. Altri metodi PCR per il rilevamento TiLV includono TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, RT-PCR12annidato e RT-PCR semi-nidificato13. Tuttavia, questi metodi richiedono sofisticate attrezzature di laboratorio e periodi di tempo relativamente lunghi per produrre risultati a causa della complessità delle reazioni, il che le rende inadatte per l'applicazione sul campo.

L'analisi dell'amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) è un'applicazione rapida, semplice e pratica per il campo14,15. La tecnica utilizza il principio di una reazione di spostamento del filo, mentre la reazione di amplificazione viene eseguita in condizioni isotermiche senza un sofisticato e costoso ciclore termico14,15. Di conseguenza, i prodotti LAMP amplificati o i prodotti RT-LAMP vengono analizzati in fasce simili a scaletta utilizzando l'elettroforesi gel agarose con una macchia fluorescente per la visualizzazione sicura del DNA o dell'RNA14 o l'osservazione ad occhio nudo per la presenza di torbidità o un precipitato bianco16,17,18. Per questi motivi, questa tecnica è stata utilizzata per il rilevamento in loco di diversi patogeni ittici17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Lo scopo di questo studio era quello di stabilire un rapido, sensibile e accurato teste RT-LAMP per il rilevamento TiLV. Il test RT-LAMP offre screening per TiLV in campioni di pesce entro 30 min. La tecnica può essere applicata per la diagnosi e la sorveglianza di TiLVD.

Protocollo

Questo esperimento, che ha comportato l'uso del tessuto animale, è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Kasetsart, Bangkok, Thailandia (numero di protocollo ACKU61-VET-009).

1. Collezione di tessuti

  1. Etonizzatore tilapia utilizzando un sovradosaggio di olio di chiodi di garofano (cioè, più di 3 mL / L). Il metano tricoinoilfonato può essere usato come alternativa all'olio di chiodi di garofano.
  2. Utilizzare forbici sterili mayo e pinze per tagliare aprire l'addome della tilapia postmortem e accise circa 30-50 mg di tessuto epatico, o utilizzando un vetro di copertura al microscopio, raccogliere 100L di muco raschiando lo strato di pelle di pesce longitudinalmente (da anteriore a posteriore) in un tubero di microcentricentrismo di 1,5 mL.
  3. Procedere immediatamente verso la fase di estrazione dell'RNA o mantenere il campione raccolto a 80 gradi centigradi fino all'esperimento. Poiché l'RNA intatto è più sensibile del DNA, utilizzare materiali e reagenti privi di RNase durante l'estrazione dell'RNA.

2. Estrazione dell'RNA

  1. Per estrarre l'RNA dal tessuto epatico, aggiungere 30-50 mg del tessuto tilapia a un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL contenente 600-1.000 l di reagente di estrazione guanidianio-acido-fenoli (Tabella dei materiali), e polverizzare il campione fino a ottenere un omogeneo a tessutino portatile. I campioni di tessuto richiedono circa il 10% del reagente di estrazione guanidianio-acido-fenolo. Per i campioni di muco, utilizzare solo 300 l del reagente di estrazione guanidinium-acido-fenolo (3:1).
    AVVISO: il reagente di estrazione guanidianio-acido-fenolo è tossico; quindi, la manipolazione deve essere effettuata con cura. Devono essere indossate attrezzature protettive, come occhiali di sicurezza, un abito da laboratorio e guanti di sicurezza.
  2. Centrifugare il campione omogeneizzato a 10.000 g per 30 s a temperatura ambiente e trasferire il sovrinnante in un nuovo tubo sterile da 1,5 ml di microcentrifuga.
  3. Aggiungere un volume uguale del 95% di etanolo al tubo e mescolare bene.
  4. Trasferire la soluzione in una colonna di spin (Tabella dei materiali) collocata in un tubo di raccolta e centrifugare a 10.000 x g per 30 s a temperatura ambiente. Eliminare il flow-through e trasferire la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta.
  5. Aggiungete alla colonna 400 - L di RNA Reagente Pre-Lavaggio (Tabella dei Materiali) e centrifugate a 10.000 x g per 30 s a temperatura ambiente prima di scartare il flusso attraverso. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
    NOTA: Per preparare l'RNA Pre-Wash, aggiungere 10 mL del 95% di etanolo a 40 mL di RNA Pre-Wash concentrato.
  6. Aggiungete 700 l di RNA Wash Buffer (Table of Materials) alla colonna e centrificate a 10.000 x g per 2 min a temperatura ambiente. Trasferire la colonna in un tubo sterile di microcentrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: Per preparare RNA Wash Buffer, aggiungere 52 mL del 95% di etanolo a 12 mL di RNA Wash Buffer concentrato.
  7. Eluire il campione di RNA catturato nella matrice della colonna di spin con 100 gradi di acqua priva di nuclesiera e centrifuga a 10.000 x g per 30 s a temperatura ambiente.
  8. Misurare la concentrazione dell'RNA estratto utilizzando uno spettrofotometro a microvolume e diluire l'RNA a una concentrazione desiderata utilizzando acqua priva di nuclea.
    NOTA: il valore di assorbimento qualificato di OD260/OD280 varia da 1,6 a 1,9, indicando la purezza accettabile dell'RNA per il saggio RT-LAMP.
  9. Procedere immediatamente al passaggio successivo, o conservare il campione a 80 gradi centigradi fino all'uso.

3. Design Primer

  1. Utilizzare Primer Explorer versione 4 per progettare le primer specifiche per RT-LAMP. Vai al sito web, https://primerexplorer.jp/e/ e fai clic sul pulsante PrimerExplorer V4.
  2. Selezionare il file contenente le sequenze del segmento 3 di TiLV in formato FASTA, quindi fare clic sul pulsante Primer Design.
    NOTA: Recuperare le sequenze in formato FASTA dal numero di adesione GenBank KX631923, che rappresenta tilapia lake virus TV1 segmento 31.
  3. Per progettare i primer, immettere i seguenti parametri di base:
    - Un contenuto GC del 40%–60%
    - Un'ampiezza di coppie di basi da 280 USD (bp)
    - Una temperatura di fusione simile (Tm) tra i primer con una differenza massima di 5
    NOTA: I primer non devono completarsi a vicenda
    1. Evitare le regioni di sequenza soggette a strutture secondarie.
    2. Selezionate l'analisi del primer dimer con un minimo di 3,5 USD per un design ottimale per il più grande g di z, e selezionate le estremità dei primir con un massimo di 4 usd per un design ottimale per il g più piccolo.
  4. Fare clic sul pulsante Genera.
    NOTA: al termine dell'elaborazione dei dati di input da parte del software, verranno visualizzati i risultati di primer (Figura 1).

4. Assay RT-LAMP

  1. Preparare una miscela master RT-LAMP contenente 2,5 litri di 1x buffer di reazione SD II, 3 luna di 6 mM MgSO4, 1,4 l di set dNTP da 1,4 m, 4 L di 0,8 M di betaina, 1,3 di 0,052 mM di miscela calceina, 1 L di 1,6 M TiLV-F3 primer, 1 luna di 1,6 - NilV-B3, 1 - L di 0,2 M TiLV-BIP primer, 1 -L di 0,2 -M TiLV-FIP primer, 1 L di 0,3 U Bst DNA polymerase, 1 - L di 0,1 trascrizione inversa AMV e 3,8 - L di acqua senza nuclease.
    NOTA: Preparare il mix master in eccesso che comprenda almeno il 10% del volume di reazione totale.
  2. Distribuisce 22 anni di lima repanti in uno sterile tubo di microcentrifuga da 1,5.
  3. Aggiungere 3 - L dell'RNA estratto al tubo di reazione e mescolare il campione vortice. Per il controllo negativo, utilizzare acqua distillata al posto dei materiali RNA.
  4. Incubare la reazione a 65 gradi centigradi per 60 min, seguita da 80 gradi centigradi per 10 min per terminare la reazione.
  5. Dopo l'incubazione, osservare visivamente i cambiamenti colorimetrici ad occhio nudo. Un risultato positivo apparirà come un colore verde fluorescente.

5. Elettroforesi gel di agarose

  1. Preparare un gel 1.5% w/v agarose sospendendo 0,6 g di polvere di agarose in 40 mL di 1x tampone TAE. Sciogliere la miscela riscaldandola in un forno a microonde per 3-5 min fino a quando l'agarose è completamente dissolta, e turbinare per mescolare.
  2. Lasciar raffreddare l'agarose fino a quando la temperatura raggiunge i 65 gradi centigradi. Versare 40 mL della soluzione agarose su un vassoio di gel e aggiungere un pettine allo stampo gel.
  3. Lasciare che il gel di agarose si fissi a temperatura ambiente per 20-30 min fino a quando non si è completamente solidificato. Quindi rimuovere il pettine e mettere il gel nel serbatoio gel.
  4. Aggiungere un buffer in esecuzione per coprire la superficie del gel nel serbatoio del gel.
  5. Aggiungete 10 l del campione RT-LAMP e 2 volte il buffer di carico del gel 6x in ogni pozzo. Aggiungete 5 l di una scala di DNA di 1 kb alla corsia di riferimento.
  6. Collegare il coperchio collegato al catodo e l'anodo collegato a un alimentatore. Accendere l'alimentatore, impostarlo su una costante 100 V, ed eseguire per 40 min.
  7. Dopo aver completato la separazione del gel, rimuovere il gel dal vassoio di gel. Quindi macchiare il gel drenato utilizzando bromuro di etidio (EtBr) ad una concentrazione di 10 mg/mL per 7 min e riposare in acqua distillata per 5 min.
    AMMONImento: l'EtBr è tossico e considerato cancerogeno; pertanto, prestare attenzione quando si utilizza questo agente.
  8. Esporre il gel alla luce UV utilizzando un sistema di documentazione gel in cui appaiono bande e scattare una foto del gel.

6. Sintesi di DNA complementare (cDNA)

  1. Preparare una miscela master di sintesi cDNA contenente 2 o L di 5x tampone RT, 0,5 l di miscela di primer, 0,5 l di enzima RT e 2 -L di acqua priva di nuclea per reazione.
    NOTA: Preparare il mix master in eccesso che comprenda 1 x la reazione dovuta a una potenziale perdita durante il pipettaggio.
  2. Distribuisce 5 -L del master mix in un tubo sterile da 1,5 ml di microcentrifuga.
  3. Aggiungere 100 ng di RNA estratto diluito (ottenuto dal passo 2.8) al tubo di reazione, mescolare e girare verso il basso per spostare tutta la miscela sul fondo del vaso.
  4. Incubane le reazioni a 42 gradi centigradi per 60 min, seguiti da 98 gradi centigradi per 5 min in una macchina PCR. Conservare il cDNA a 20 gradi centigradi fino all'uso.

7. RT-qPCR

  1. Preparare un master mix TiLV qPCR contenente 0,3 litri di 10 M di primer inverso, 0,3 litri di 10 M di primer in avanti, 5 -L di 2x SYBR Verde DNA polimerasi e 0,4 l di acqua senza nuclesi per reazione. Utilizzare i seguenti primer e controlli:
    Primer in avanti (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGCAGCAATATATATATATATATATATATATAT-3'
    Primer inverso (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAGtTCT-3'
  2. Distribuisci 6 -L del master mix TiLV qPCR in ogni pozzo della striscia qPCR compatibile con il ciclore termico in tempo reale utilizzato.
  3. Aggiungete 4 -L del modello cDNA, il controllo negativo (acqua priva di nuclenon, il controllo positivo (10 pg/l)e il pTiLV (plasmid)10 o il plasmide TiLV diluito in serie al pozzo, e mescola ogni campione sfilando. Condurre ogni campione in triplice copia.
  4. Inserire le reazioni qPCR nel ciclore termico programmato in tempo reale. Impostare il programma qPCR per eseguire l'incubazione a 95 gradi centigradi per 3 min, seguito da 40 cicli di 95 s per 10 s e 60 s per 30 s prima della fase della curva di fusione in cui la temperatura deve aumentare da 65 a 95 gradi a incrementi di 0,5 gradi centigradi/ 5 s.
  5. Condurre l'analisi dei dati valutando le curve di amplificazione e fusione, quindi calcolare il numero di copie TiLV utilizzando la curva standard ottenuta dai dati utilizzando le plasmidie diluite in serie.

Risultati

In questo studio, è stato sviluppato un saggio RT-LAMP per rilevare l'infezione da TiLV nella tilapia. I campioni testati sono stati raccolti da 14 aziende agricole situate in diverse parti della Thailandia tra il 2015 e il 2016. I pesci infetti e non infetti sono stati raggruppati principalmente in base a diagnosi fisiche e alle comparse di TiLVD sintomatico. L'infezione da TiLV è stata successivamente confermata utilizzando RT-PCR dopo il processo di raccolta. L'elettroforesi gel di Agarose e la rilevazione di un col...

Discussione

L'industria dell'acquacoltura è continuamente minacciata da infezioni virali che causano notevoli perdite economiche9,23,28. Ad esempio, l'emergente TiLV rappresenta una grave minaccia per i paesi produttori di tilapia in molte parti del mondo1,6,9. Fino ad ora, non ci sono state terapie specifiche disponibili per prevenire TiLVD. Ment...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Il progetto è finanziato finanziariamente dal thailandese Research Fund (TRF) numero di sovvenzione RDG6050078 e il Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailandia sotto il Higher Education Research Promotion e National Research University Project of Thailand, Ufficio della Commissione per l'istruzione superiore, Ministero dell'Istruzione, Thailandia. La ricerca è sostenuta in parte dalla Graduate Program Scholarship della Graduate School, Kasetsart University. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kwanrawee Sirikanchana per la narrazione del video e Piyawatchara Sikarin per aver modificato il video.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue collection:
Clove oilBetter PharmaN/A
Tricaine methanesulfonateSigma-AldrichE10521An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent)ThermoFisher Scientific Corp.15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent)GeneaidGZR100
Direct-zol RNA Kit:Zymo ResearchR2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash Buffer
- DNase/RNase-free water
- Zymo-spin IIICG columns
- Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction bufferBiotechrabbitBR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-Aldrich7487-88-9
dNTP setBiolineBIO-39053
BetaineSigma-AldrichB2629
Calcein mixtureMerck1461-15-0
Bst DNA polymeraseBiotechrabbitBR1101301
AMV reverse transcriptasePromegaM510A
Nuclease-free waterInvitrogen10320995
Elite dry bath incubator, single unitMajor ScienceEL-01-220
Gel electrophoresis:
AgaroseVivantis TechnologiesPC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) bufferSigma-AldrichSRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
- TrisVivantis TechnologiesPR0612-1KG
- Acetic acid (glacial), EMSUREMerck Millipore1000632500
- Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), VetecSigma-AldrichV800170-500G
NeogreenNeoScience Co., Ltd.GR107
DNA gel loading dye (6X)ThermoFisher Scientific Corp.R0611
DNA ladder and markersVivantis TechnologiesPC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system)Bio-Rad1704487
PowerPac HC power supplyBio-Rad1645052
Gel Doc EZ SystemBio-Rad1708270
UV sample trayBio-Rad1708271
NαBI imagerNeogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101
Viva cDNA Synthesis KitVivantis TechnologiescDSK01An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer)ThermoFisher Scientific Corp.ND-2000
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725120
Nuclease-free water, sterile waterMultiCell809-115-CL
8-tube PCR strips, whiteBio-RadTLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, opticalBio-RadTCS0803
CFX96 Touch Thermal CyclerBio-Rad1855196
General equipment and materials:
Mayo scissorsN/A
ForcepsN/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer)Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60LioFugeCM610
Corning LSE mini microcentrifugeCorning6765
PipettesRaininPipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tipsQuality Scientific PlasticsTF series
Corning Isotip filtered tipsMerckCLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NESTWuxi NEST Biotechnology615601

Riferimenti

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