P. 阿鲁吉诺萨 气液界面中支气皮细胞和巨噬细胞的感染三维共培养，用于抗感染的临床前评估

摘要

我们描述了一个协议，一个三维共培养模型的感染气道，使用CFBE41o^- 细胞，THP-1 巨噬细胞，和伪多莫纳斯aeruginosa，建立在空气-液体接口。该模型提供了一个新的平台，同时测试抗生素疗效，上皮屏障功能和炎症标记。

摘要

f治疗肺部感染的Drug研究正在向高复杂性 的预测体外 模型发展。细菌在肺模型中的多方面存在可以重新适应上皮排列，而免疫细胞则协调对微环境中细菌的炎症反应。 虽然在囊性 纤维化的背景下，体内模型一直是测试新的抗感染药物的选择，但它们仍然 不能准确地模仿人类 此类疾病的体内条件和治疗结果。基于 人类细胞 （支气管上皮和巨噬细胞）和相关病原体的受感染气道的复杂体外模型可以弥补这一差距，并有助于将新的抗感染药物转化为临床。为此，建立了人类囊性纤维化支气管细胞系CFBE41o^和 THP-1单细胞衍生巨噬细胞的共同培养模型，模拟 了P.aeruginosa 在空气-液体界面（ALI）条件下感染人类支气管粘膜。该模型在七天内建立，并同时评估以下参数:上皮屏障完整性、巨噬细胞迁移、细菌存活和炎症。本协议描述了一个强大且可重复的系统，用于评估药物疗效和宿主反应，该系统可能与发现新的抗感染药物和优化其气溶胶输送到肺部有关。

引言

伪多多多酸菌是 囊性纤维化（CF）中的相关病原体，有助于肺组织损伤^1。多糖的生产，如藻酸盐和其他粘液外聚糖，协调疾病的进展，这导致顽强的细菌坚持，限制抗生素向细菌的输送，并保护细菌免受宿主免疫系统^2。在这种情况下 ，P. aeruginosa从 浮游生物期过渡到生物膜形成是一个关键问题，也促进了抗生素耐受性的发生。

在 CF 的上下文中，鼠标主要用作模型。然而，小鼠不会自发地发展这种疾病与CF突变3的^引入。大多数细菌生物膜开发和药物易感性研究是在非生物表面进行的，如培养皿。但是，此方法并不表示体内的复杂性。例如，重要的生物屏障是不存在的，包括免疫细胞以及粘膜上皮。虽然P.aeruginosa对上皮细胞相当有毒，但一些团体已经成功地与人类支气管细胞共同培育了早期的P.aeruginosa生物膜。这些细胞起源于囊性纤维化患者与CFTR突变（CFBE41o^-细胞^）4，并允许评估抗生素疗效5或评估感染^期间CFTR蛋白的纠正^6。这种模式被证明可以提高药物疗效的可预测性，此外还能够对药物在药物开发后期阶段失败的问题进行^定性。

然而，在肺，粘膜上皮暴露在空气中。此外，存在于气道中的免疫细胞，如组织巨噬细胞，对吸入的病原体或颗粒8起起^{至关重要的作用}。巨噬细胞通过不同的细胞层迁移，到达支气管流明并对抗感染。此外，吸入的药物还必须应付粘液的存在作为肺气血屏障⁹的附加非细胞元素。事实上，已经开发了几个复杂的三 维 （3D）体外模型，旨在提高 体内的相关性 。联合培养系统不仅增加了药物发现 体外 系统的复杂性，而且能够研究细胞-细胞相互作用。这种复杂性在有关巨噬细胞迁移^10、中性粒细胞^{释放11、粘}液在感染中的作用^9、上皮细胞对过度损伤的反应等研究中已经^得到解决。然而，一个可靠的CF感染 体外 模型，功能在CF的基因突变，暴露在空气中（增加的生理条件），并整合免疫细胞仍然缺乏。

为了弥补这一差距，我们描述了一个协议，用于稳定受感染气道的人类3D共培养。该模型由人类CF支气管上皮细胞和巨噬细胞组成，感染了 P.aeruginosa， 能够代表扩散和免疫屏障。以在相当高的通量下测试抗感染物为目的，利用两种人类细胞系:CFBE41o^和 THP-1单细胞衍生巨噬细胞，在井板插入物的渗透滤膜上建立了这种共培养物。此外，为了最终研究气溶胶抗感染剂¹³的沉积，该模型是在空气-液体界面（ALI）而不是液体覆盖条件（LCC）建立的。

正如我们在这里报告，这个模型不仅允许评估抗生素治疗的细菌生存，而且允许评估细胞毒性，上皮屏障完整性，巨噬细胞转运和炎症反应，这些都是药物开发的基本参数。

该协议结合了两种相关的细胞类型，用于肺气道的吸入治疗:巨噬细胞和CF支气管上皮。这些细胞在可渗透支撑刀片的对面播种，允许细胞暴露在空气中（称为空气-液体接口（ALI）条件）。这种宿主细胞的共培养随后感染了 P.aeruginosa。两个宿主细胞系都是人类起源的:上皮细胞代表囊性纤维化支气管上皮，在CF通道（CFBE41o^{-）上发生突变}，THP-1¹⁴ 细胞是一个特征良好的巨噬细胞状细胞系。在将巨噬细胞样细胞添加到相反的隔间之前，首先允许在井板插入物的上侧形成汇合上皮层。一旦在ALI建立共同培养，系统就接种 了P.aeruginosa。 然后，这种受感染的联合培养系统用于评估抗生素的疗效，例如去布拉霉素。分析了以下终点:跨皮质电阻（TEER）、细胞和细胞-细菌相互作用的可视化、共生激光扫描显微镜（CLSM）、通过计数菌群形成单位（CFU）、宿主细胞生存（细胞毒性）和细胞因子释放的细菌存活率。

研究方案

1. 渗透支持插入中细胞的生长和分化

1. 培养 CFBE41o^{- 在} 含有 10% 胎儿小牛血清 （FCS）、1% 非必需氨基酸和 600 mg/L 葡萄糖的 T75 烧瓶中，其最低基本介质 （MEM） 含有 5% 的 CO₂ 气氛。每2~3天向细胞中加入新鲜介质。
   1. 在37°C下用3 mPin-乙二胺四聚氰胺四聚氰胺酸（EDTA）在烧瓶中达到70%汇合后分离细胞，15分钟。加入 7 mL 的新鲜 MEM，在室温 （RT） 下以 300 x g 离心 4 分钟。丢弃上流水液，并添加新的 10 mL 的 MEM，同时通过轻轻上下移液来破坏团块。
   2. 使用自动细胞计数器或血细胞计室计算细胞。密度为 2 x 10⁵ 细胞/孔的种子细胞，在 12 孔板中具有渗透性支架（孔径为 3 μm， 参见材料表）。
      注:自动单元格计数器确定单元格的数量、大小分布和单元格的可行性（参见 材料表）。孔径为0.4 μm的渗透支架可在此使用;然而，在这种情况下，巨噬细胞应直接添加到脂肪侧，在这种情况下，不会评估其跨细胞迁移。
   3. 在液体条件下的种子细胞 （LLC）， 在渗透支撑的渗透侧添加 500 μL 的细胞悬浮液， 在基础侧添加 1.5 mL 的新鲜介质。然后在37°C下孵育细胞，在5%CO2下₂，72小时。
   4. 要转移到空气-液界面（ALI）培养，在播种后的第三天，先从基底面取出介质，然后从基础侧移除介质。在基础侧，加入500μL的新鲜 MEM，并每隔两天更换介质，直到细胞形成汇合单层。
      注:对于该协议中使用的条件，CFBE41o^- 细胞通常在培养3-7天后汇合。
   5. 通过孵育CFBE41o评估第7天的上皮屏障特性^- 在基础侧具有500μL细胞培养基和在基础侧具有1.5 mL的细胞，在5%CO₂下在37°C下1小时。
   6. 使用 STX2 筷子电极和上皮伏特欧姆表，通过跨皮电阻 （TEER） 测量屏障性能;7 天后，这高于 300 °cm2。
      注:最终，在某些膜插入中，细胞具有低TEER。因此，不使用带 TEER < 300 μ cm2 的渗透刀片。
2. 为了培养THP-1细胞，使用罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基，辅以10%FCS，在37°C下孵育5%CO₂的T75烧瓶中。每两天通过播种2 x 10^6个 细胞/mL细胞在一个新的T75烧瓶中分裂细胞。
   注:非分化THP-1细胞在悬浮液中作为单核细胞生长。
   1. 区分THP-1细胞，如下所示。T75 的离心机内容为 300 g x g，4 分钟。丢弃上一杯，在新鲜介质中重新暂停颗粒，并放入新的T75。在37°C和5%CO2大气中加入10纳克/mL Phorbol 12-myristate 13-醋酸（PMA）在RPMI中的细胞中吸收48小时，₂持续48^小时。
      注:与PMA分化后，细胞不再增殖并附着在烧瓶上。
   2. 要分离THP-1巨噬细胞，在37°C下用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，用含有0.5 mM EDTA的3 mL细胞分离溶液（如高分酶）孵育10分钟。
   3. 在倒置显微镜下检查细胞，以查找细胞分离。加入 7 mL 的新鲜介质，在 RT 时以 300 x g 的离心机 4 分钟。
      注: 巨噬细胞也可以与尝试性-EDTA分离，37°C20分钟。然而，与所选的细胞分离溶液（参见材料表）对巨噬细胞的试管更 苛刻。
   4. 取出上清液后，将THP-1介质中3 mL的巨噬细胞重新悬浮到15 mL锥形管中，如1.1.2所述，计算细胞数。并在 37 °C 下孵育 1 小时，低于 5% CO_2， 然后再建立共培养。
      注:悬架中的THP-1细胞可以染色于活力染料，以进一步成像共培养。在此步骤中，使用下面的过程（步骤 1.2.5）。
   5. 用10μM的细胞活力染料染色巨噬细胞（基于细胞内酯的转化，见 材料表），其中3μL的细胞活力染料应用于细胞悬浮液。在37°C下孵育细胞20分钟_，CO25%，然后用PBS 37°C洗涤1x，去除染料。
      注:在室温 （RT） 下，将细胞离心 ，以 300 x g 去除染料 4 分钟。

2. 在可渗透支架上建立上皮-巨噬细胞共培养

1. 使用 CFBE41o^- ALI 的单层，TEER = 300°cm2（步骤 1.1.6.）。从下腔室中去除介质，小心地将无菌玻璃培养皿内的支撑物反转（50 mm x 200 mm），并使用细胞刮刀去除通过膜底部膜孔隙过度生长的细胞。
   注:由于孔径为3μm，上皮细胞往往通过孔隙向基底侧生长。因此，在添加这边的巨噬细胞之前，需要移除它们。CFBE41o^- 肺上皮细胞可以在此步骤染色.可以使用步骤 1.2.5 中的过程;然而，MEM 中的染料溶液不是细胞悬浮液，而是应用于可渗透支持上的粘附细胞上（仅 500 μL 的阳一面）。
2. 使用 2 x 10⁵ 细胞/井（在 200 μL RPMI 中）从 PMA 分化 THP-1 巨噬细胞的细胞悬浮液中放置细胞，并将细胞放在倒置刀片的基底侧。
3. 小心关闭培养皿，在37°C下孵育2小时，低于5%CO_2。
4. 将刀片放回 12 孔微孔板中，并在可渗透刀片的基底侧添加 500 μL 的 MEM 介质，以保持 ALI 条件。细胞现在已准备好感染。

3. 感染 P. aeruginosa

注:以下所有步骤必须在生物安全级别 2 （BSL2） 实验室完成。

1. 接种 15 mL 的 Lysogeny 肉汤 （LB） 辅以 300 μg/mL 氨基林在 Erlenmeyer 烧瓶 （50 mL） 与 P. aeruginosa PAO1-GFP 的单一殖民地。
   注:其他 菌株的P.aeruginosa 也可以在这里使用，例如，PAO1野生类型，PA14，或临床菌株，按照自己的栽培协议。
2. 在37°C下孵育细菌18小时，在180转/小时时摇晃。
3. 18 h 后将内装物转移到 50 mL 锥形管，以 3850 x g 的离心机 传输 5 分钟。丢弃上一液，在37°C下加入10mL的无菌PBS。
4. 测量波长为 600 nm 的分光光度计上的光学密度，并使用细胞培养基调整细菌浓度，最终浓度为 2 x 10⁵ CFU/mL。这对应于每个上皮细胞的一种细菌的多重感染 （MOI）。
5. 将100μL的细菌悬浮液加入渗透支撑的渗透侧（步骤2.4.），在37°C下孵育，在5%CO₂ 下孵育1小时，使细菌附着在细胞上。然后，用移液器小心地去除液体，以恢复ALI条件。将一些样品作为控制保持未感染。
   注:在此阶段，附着的细菌应镀在LB agar中（见步骤5.4/5.5），以确定初始细菌的菌分。
6. 在细胞中细菌粘附后孵育感兴趣的药物。对于治疗实验，将500μL的细胞培养中稀释的药物溶液（本协议中使用6μg/mL）添加到细胞侧。加入1，500μL的细胞培养基，在基底面不带药物。
   注:该模型也可以适应气溶胶沉积，而不是将药物作为溶液注入。出于此类目的，ALI 的细胞从基底端以 500 μL 的细胞培养基进行喂养。然后，药物首先被雾化，并允许通过适当的装置沉积在雾室中（此处未说明）。可以检查受感染和经过处理的样本是否检查第 4-7 节中概述的端点。从这一步开始，渗透支持可用于创建图像（第4节）或获得细菌生长和哺乳动物细胞生存能力的结果，等等（第5-7节）。

4. 共声激光扫描显微镜（CLSM）的样品制备

1. 建立共同培养，感染和药物治疗后，去除所有媒介从药方和基础侧。在 37°C 下用 PBS 清洗 1x，然后用 3% 半甲醛 （PFA） 将细胞在 RT（300 μL 上，在基础体上 300 μL/600 μL）固定 1 小时。细胞核在室温下用5微克/mL的DAPI-PBS染色30分钟。
   注意:PFA 是危险的。
2. 使用手术刀切割膜，并使用安装介质将它们放在两个 12 mm 显微镜盖幻灯片之间（ 参见材料表）。在 4 °C 储存之前，让它在流量台内干燥 30 分钟。 通过共和扫描显微镜进行可视化。
   注:在共培养和安装之前，可以进行紧密的结免疫污染。为此，细胞用甲状甲醛3%固定30分钟，用PBS再次清洗，用PBS用皂素0.05%/BSA 1%渗透。在该协议中，通过小鼠抗人类ZO-1抗体（1:400，在4°C下孵育过夜）检测出区黄素蛋白（ZO-1）。然后，在RT中用山羊抗小鼠IgG抗体Alexa Fluor 633（红色1:2000）孵育样品2小时。核沾有DAPI（1 μg/mL），安装在盖玻片上安装介质。
3. 使用共和显微镜对存储的膜进行成像。选择 25 倍或 63 倍水浸目标和激光器，在 405、488、505 或 633 nm 进行检测。图像的分辨率应为 1024 x 1024 像素。
   注:激光器根据使用的污渍进行选择。
4. 获取截面和横截面视图，并使用 Zeta 堆栈模式 （10~15 堆栈） 使用成像软件构建三维模型。

5. 通过形成菌落的单位（CFU）测量细菌扩散

1. 收集非附着细菌的CFU和基础介质（含细菌）。从面和基波拉特面收集 500 μL 并池化它们。
   注:直接使用此悬浮液对细菌进行计数（步骤 5.4）或在 21，250 x g 下离心 10 分钟，以评估上清液中的乳酸盐脱氢酶 （LDH）和/或在 PBS 中重新悬浮以计数细胞外细菌（步骤 5.4）。
2. 通过添加 500 μL 无菌脱越冷水，评估细胞内附和/或内化细菌的生存。在室温下孵育细胞30分钟。
   注:样品可以镀在LB agar（见步骤5.4）上，也可以在-20°C下冷冻（作为整个插入板），供以后电镀。
3. 为评估粘附细菌/内化细菌的CFU，在37°C下解冻样品10分钟（如果冷冻）。使用每孔的移液器尖端，刮膜表面和移液器上下，以去除所有粘附的内容。
   注:在此步骤中，所有上皮细胞都得到粘液和粘附/内化细菌作为悬浮液进行镀。
4. 使用两个分数的细菌悬浮液，使用 Tween-80 0.05% 的 PBS 进行 1/10 序列稀释，并在 LB agar 板上对细菌进行镀膜。
   注:建议在 1 到 10 之间稀释。细菌应计数在最高的稀释，其中单菌落首先被识别。
5. 在30°C下孵育加糖板16~72小时，以计数菌落，并相应地计算CFU。
   注:在板孵化时，温度为30°C对于处理样品和观察菌落的延迟生长至关重要。

6. 通过乳酸脱氢酶测定对细胞细胞毒性的评价

1. 使用含有细菌的受感染细胞的上因（见步骤5.1）进行LDH测定^{16的细胞生存能力评估}。将上能液在21，250 x g 下离心10分钟，以对细菌进行颗粒化，并最终使细胞的其余部分产生。使用无细菌的上一液测量LDH释放。
   注:在通过此测定测量LDH之前，不应冻结上一液。
2. 将上液的 100 μL 转移到 96 井板中，并加入 100 μL 的 LDH 测定溶液（ 参见材料表）。在室温下在黑暗中孵育5分钟，然后在492纳米时读取吸收。

7. 评估人类细胞因子的释放

1. 有关细胞因子定量，请使用 ELISA 或细胞测量珠阵列免疫测定^17（参见材料表）。为此，从步骤 5.1 的离心机 5.1 以 21，250 x g进行 10 分钟测量，或立即测量或储存 -80°C 长达 15 天，直到分析。
2. 使用市售的 ELISA 套件评估超级钠。
   注:该程序遵循制造说明，包括带捕获抗体的板涂层、样品（100 μL）和细胞因子标准的添加、孵化、洗涤和检测抗体的添加，以提供细胞因子存在的色度测量。或者，流式细胞仪可用于通过市售试剂盒测量细胞因子（参见 材料表）。

结果

图1A 显示了在渗透支架的渗透支架的渗透侧和基础侧生长24小时后，人类支气管上皮细胞和巨噬细胞共同培养的形态。上皮屏障完整性由较高的TEER（834°cm^2）和CLSM通过免疫固结蛋白ZO-1（图1B）显示。在未感染的CFBE41o的屏障完整性方面观察到的相同结果^- 单一培养可以在未受感染的上皮-巨噬细胞共培养物中看到。

为...

讨论

本文描述了受感染气道的3D共培养方案，由人类囊性纤维化支气管上皮细胞系CFBE41o和人类单细胞衍生巨噬细胞系THP-1组成。该协议允许评估上皮屏障的完整性，巨噬细胞迁移，细菌生存和炎症，这是测试药物疗效和宿主反应时同时的重要参数。模型中的新颖性在于将上皮细胞（即人类CF细胞系和巨噬细胞）与急性细菌感染（即P.aeruginosa）结合在一起。上皮细胞的急性感染证明是由抗生素（即...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	-
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o- cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754