P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per un modello di co-coltura tridimensionale di vie aeree infette, utilizzando CFBE41o^- cellule, macrofagi THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, stabilito presso l'interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce una nuova piattaforma per testare simultaneamente l'efficacia antibiotica, la funzione della barriera epiteliale e i marcatori infiammatori.

Abstract

f La ricerca antidroga per il trattamento delle infezioni polmonari sta progredendo verso modelli in vitro predittivi di elevata complessità. La presenza multiforme di batteri nei modelli polmonari può riapproizionare la disposizione epiteliale, mentre le cellule immunitarie coordinano una risposta infiammatoria contro i batteri nel microambiente. Mentre i modelli in vivo sono stati la scelta per testare nuovi anti-infettivi nel contesto della fibrosi cistica, non imitano ancora con precisione le condizioni in vivo di tali malattie negli esseri umani e gli esiti del trattamento. Modelli complessi in vitro delle vie aeree infette basate su cellule umane (epiteliali bronchiali e macrofagi) e agenti patogeni rilevanti potrebbero colmare questa lacuna e facilitare la traduzione di nuovi anti-infettivi nella clinica. Per tali scopi, è stato stabilito un modello di co-coltura della linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o^{- e} dei macrofagi derivati dai monociti THP-1, che imitano un'infezione della mucosa bronchiale umana da P. aeruginosa in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questo modello è impostato in sette giorni, e i seguenti parametri sono valutati contemporaneamente: integrità barriera epiteliale, trasmigrazione macrofagi, sopravvivenza batterica, e infiammazione. Il presente protocollo descrive un sistema robusto e riproducibile per valutare l'efficacia dei farmaci e le risposte dell'ospite che potrebbe essere rilevante per scoprire nuovi anti-infettivi e ottimizzare la loro consegna di aerosol ai polmoni.

Introduzione

Pseudomonas aeruginosa è un agente patogeno rilevante nella fibrosi cistica (CF) che contribuisce al danno del tessuto^{polmonare 1}. La produzione di polisaccharides, come l'alginato e altri esopolidi mucoidi, coordina il progresso della malattia, che porta ad una tenace aderenza batterica, limita la somministrazione di antibiotici ai batteri e protegge i batteri contro il sistema immunitario dell'ospite². La transizione di P. aeruginosa dallo stadio planctonic alla formazione di biofilm è una questione critica in questo contesto, facilitando anche l'insorgenza della tolleranza antibiotica.

Nel contesto di CF, il mouse è stato utilizzato principalmente come modello. I topi, tuttavia, non sviluppano spontaneamente questa malattia con l'introduzione di mutazioni CF³. La maggior parte dello sviluppo di biofilm batterici e studi di suscettibilità ai farmaci sono stati eseguiti su superfici abiotiche, come i piatti Petri. Tuttavia, questo approccio non rappresenta la complessità in vivo. Ad esempio, sono assenti importanti barriere biologiche, comprese le cellule immunitarie e l'epitelio mucoso. Anche se P. aeruginosa è abbastanza tossico per le cellule epiteliali, alcuni gruppi sono riusciti a co-coltivare un precedente biofilm P. aeruginosa con cellule bronchiali umane. Queste cellule hanno avuto origine da pazienti affetti da fibrosi cistica con mutazione CFTR (CFBE41o^- cellule)^{4 e} hanno permesso di valutare l'efficacia antibiotica⁵ o valutare la correzione della proteina CFTR durante l'infezione⁶. Tale modello è stato indicato per migliorare la prevedibilità dell'efficacia dei farmaci, oltre a consentire la caratterizzazione dei problemi con i farmaci che non sono riusciti nelle fasi successive dello sviluppo di farmaci⁷.

Tuttavia, nel polmone, l'epitelio mucoso è esposto all'aria. Inoltre, le cellule immunitarie presenti nelle vie aeree, come i macrofagi tissed, svolgono un ruolo essenziale contro gli agenti patogeni inalati o le particelle⁸. I macrofagi migrano attraverso i diversi strati cellulari per raggiungere il lume bronchiale e combattere l'infezione. Inoltre, i farmaci inalati devono anche far fronte alla presenza di muco come elemento aggiuntivo non cellulare della barriera polmonare aria-sangue⁹. Infatti, sono stati sviluppati diversi modelli complessi tridimensionali (3D) in vitro, con l'obiettivo di aumentare la rilevanza in vivo. I sistemi di co-coltura non solo aumentano la complessità dei sistemi in vitro per la scoperta di farmaci, ma consentono anche di studiare le interazioni tra cellule cellulari. Tale complessità è stata affrontata negli studi sulla migrazione dei macrofago¹⁰, il rilascio di peptidi antimicrobici da parte dei neutrofili¹¹, il ruolo del muco^{nell'infezione 9}e la reazione cellulare epiteliale a danni^{eccessivi 12}. Tuttavia, un modello in vitro affidabile infettato da CF che presenta la mutazione genetica in CF, che è esposto all'aria (maggiore condizione fisiologica), e integra le cellule immunitarie è ancora carente.

Per colmare questa lacuna, descriviamo un protocollo per la co-coltura 3D umana stabile delle vie aeree infette. Il modello è costituito da cellule epiteliali e macrofagi bronchiali CF umani, infettati da P. aeruginosa e in grado di rappresentare sia una barriera diffusionale che immunologica. Con l'obiettivo di testare gli anti-infettivi a un rendimento ragionevolmente elevato, questa co-coltura è stata stabilita sulla membrana filtro permeabile di inserti a piastre ben, utilizzando due linee cellulari umane: CFBE41o^{- e} macrofagi derivati da monociti THP-1. Inoltre, per studiare alla fine la deposizione di anti-infettivi aerosolizzati¹³, il modello è stato stabilito all'interfaccia aria-liquido (ALI) piuttosto che alle condizioni di trattamento con liquido (LCC).

Come riferiamo qui, questo modello permette di valutare non solo la sopravvivenza batterica su un trattamento antibiotico, ma anche la citotossicità cellulare, l'integrità della barriera epiteliale, la trasmigrazione dei macrophage e le risposte infiammatorie, che sono parametri essenziali per lo sviluppo di farmaci.

Questo protocollo combina due tipi di cellule rilevanti per la terapia dell'inalazione delle vie aeree polmonari: i macrofagi e l'epitelio bronchiale CF. Queste cellule sono semi su lati opposti di inserti di supporto permeabili, permettendo l'esposizione delle cellule all'aria (chiamata condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI). Questa co-coltura delle cellule ospitante viene successivamente infettata da P. aeruginosa. Entrambe le linee cellulari ospitali sono di origine umana: le cellule epiteliali rappresentano l'epitelio bronchiale della fibrosi cistica, con una mutazione sul canale CF (CFBE41o^-), e le cellule THP-1¹⁴ sono una linea cellulare macrofamiga ben caratterizzata. Uno strato epiteliale confluente è prima permesso di formarsi sul lato superiore degli inserti di piastra del pozzo prima che le cellule macrofagi vengono aggiunte al vano opposto. Una volta stabilita la co-cultura in ALI, il sistema viene inoculato con P. aeruginosa sul lato apical. Questo sistema di co-coltura infetto viene quindi utilizzato per valutare l'efficacia di un antibiotico, ad esempio tobramicina. Vengono analizzati i seguenti punti finali: integrità della barriera epiteliale in termini di resistenza elettrica transepithelial (TEER), visualizzazione delle interazioni cellula-cellula-cellula-batterio mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM), sopravvivenza batterica mediante conteggio di unità formanti di colonia (CFU), sopravvivenza delle cellule ospite (citotossicità) e rilascio di citochine.

Protocollo

1. Crescita e differenziazione delle cellule negli inserti di supporto permeabili

1. Coltivare CFBE41o^- in una fiaschetta T75 con 13 mL di mezzo minimo essenziale (MEM) contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS), 1% di amminoacidi non essenziali e glucosio 600 mg/L a 37 gradi centigradi con 5 % di atmosfera di CO_2. Aggiungere mezzo fresco alle cellule ogni 2-3 giorni.
   1. Staccare le cellule dopo aver raggiunto il 70% di confluenza nel pallone con 3 mL di trypsin- acido etilenediaminetetraacetico (EDTA) a 37oC per 15 min. Aggiungere 7 mL di MEM fresco e centrifugare le cellule a 300 x g per 4 min a temperatura ambiente (RT). Scartare il supernatant e aggiungere nuovi 10 mL di MEM mentre si interrompono i grumi pipettando delicatamente su e giù.
   2. Contare le celle con un contatore cellulare automatizzato o camera emocitometrica. Cellule di semi con una densità di 2 x^{10 5} celle/bene in piastre a 12 poi con supporti permeabili (dimensioni dei pori di 3 m, vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: il contatore automatico delle celle determina il numero di cella, la distribuzione delle dimensioni e la vitalità delle celle (vedere Tabella dei materiali). In questo caso potrebbero essere utilizzati supporti permeabili con una dimensione di poro di 0,4 m; tuttavia, i macrofagi, in questa condizione, dovrebbero essere aggiunti direttamente al lato apico, e la loro migrazione transcellulare non sarà valutata in questo caso.
   3. Cellule di semi a condizione liquido-liquido (LLC) aggiungendo 500 l della sospensione cellulare sul lato arroico del supporto permeabile e 1,5 mL di mezzo fresco nel lato basolatero. Quindi incubare le cellule a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO₂, per 72 h.
   4. Per passare alla coltura aria-liquido interfaccia (ALI), il terzo giorno dopo la semina, rimuovere il mezzo dal lato basolaterale prima, poi dal lato ativo. Per il lato basolaterale, aggiungere 500 L di MEM fresco e cambiare il mezzo ogni secondo giorno fino a quando le cellule formano un monostrato confluente.
      NOTA: Per le condizioni utilizzate in questo protocollo, il CFBE41o^{- le} cellule di solito sono confluenti dopo 3-7 giorni in coltura.
   5. Valutare le proprietà della barriera epiteliale il giorno 7 incubando CFBE41o^- cellule con 500 sL media cellulare nel lato ape e 1,5 mL nel lato basolaterale per 1 h, a 37 gradi centigradi sotto il 5% DI CO₂.
   6. Misurare le proprietà della barriera tramite resistenza elettrica transepithelial (TEER), con un elettrodo di bacchetta STX2 e un volt-ohmmetro epiteliale; dopo 7 giorni questo è superiore a 300 Ω-cm2.
      NOTA: Alla fine, in alcuni inserti a membrana, le cellule hanno basso TEER. Pertanto non vengono utilizzati inserti permeabili con TEER < 300 Ω-cm2.
2. Per coltivare le cellule THP-1, coltivarle in una fiaschetta T75 utilizzando 13 mL del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media integrata con 10% FCS, e incubare a 37oC sotto 5% CO₂. Dividere le celle ogni secondo giorno seminando 2 x 10^celle/mL in un nuovo pallone T75.
   NOTA: Le cellule THP-1 non differenziate vengono coltivate come monociti in sospensione.
   1. Differenziare le cellule THP-1 come segue. Contenuto centrifuga di un T75 a 300 x g per 4 min. Scartare il supernatant, risundere il pellet in mezzo fresco e mettere in un nuovo T75. Aggiungere 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) incubatig le cellule in RPMI per 48 h a 37 gradi centigradi e 5% DI CO₂ ^{atmosfera 15}.
      NOTA: Dopo la differenziazione con PMA, le cellule non proliferano più e si attaccano al pallone.
   2. Per staccare le cellule simili a macrofagi THP-1, lavare una volta con la salina tamponata di fosfati (PBS) a 37 gradi centigradi e incubare con 3 mL di soluzione di distacco cellulare (ad esempio accutase) contenente 0,5 mM EDTA per 10 min a temperatura ambiente.
   3. Ispezionare le cellule al microscopio invertito per cercare il distacco delle cellule. Aggiungere 7 mL di mezzo fresco e centrifuga a 300 x g per 4 min a RT.
      NOTA: I macrofagi possono anche essere staccati con trypsin-EDTA, 37 gradi centigradi per 20 min. Tuttavia, la trypsina è più dura per i macrofagi rispetto alla soluzione di distacco delle celle scelta (vedere Tabella dei materiali).
   4. Dopo aver rimosso le celle macrofacie di 3 mL di THP-1 in un tubo conico da 15 mL, contare le celle come descritto al punto 1.1.2. e incubare per un massimo di 1 h a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO₂ prima di creare la co-cultura.
      NOTA: le celle THP-1 in sospensione possono essere macchiate con coloranti vivibilità per immaginiare ulteriormente la co-coltura. In questo passaggio, utilizzare la procedura seguente (passaggio 1.2.5).
   5. Macrofagi di macchie con 10 M di un colorante di vitalità cellulare (basato sulla conversione di moieties di acetato da parte di esterases intracellulari, vedi Tabella dei materiali) in cui viene applicato 3 ìL del colorante di vitalità cellulare alla sospensione cellulare. Incubare le cellule per 20 minuti a 37 gradi centigradi, 5% CO_2,quindi lavare 1x con PBS 37oC per rimuovere il colorante.
      NOTA: Centrifugare le cellule per rimuovere il colorante a 300 x g per 4 min a temperatura ambiente (RT).

2. Creazione di una co-cultura epiteliale-macrofamiù su supporti permeabili

1. Utilizzare CFBE41o^- monostrati in ALI con TEER 300 Ω-cm2 (passaggio 1.1.6.). Rimuovere il mezzo dalla camera inferiore, invertire con attenzione il supporto all'interno di un piatto Petri vetro sterile (50 mm x 200 mm) e rimuovere le cellule ricoperte attraverso i pori di membrana sul lato inferiore della membrana utilizzando un raschietto cellulare.
   NOTA: A causa delle dimensioni dei pori di 3 m, le cellule epiteliali tendono a crescere attraverso i pori verso il lato basolatero. Pertanto, è necessario rimuoverli prima di aggiungere i macrofagi su questo lato. CFBE41o^{- Le} cellule epiteliali polmonari possono essere macchiate in questa fase. La procedura di cui al punto 1.2.5 può essere utilizzata; tuttavia, invece di una sospensione cellulare, viene applicata la soluzione di colorante in MEM (solo lato ape 500 L) sulle cellule aderenti sul supporto permeabile.
2. Utilizzare 2 x 10⁵ celle/pozzo (in 200 L di RPMI) dalla sospensione cellulare dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e posizionare le celle sul lato basolaterale degli inserti invertiti.
3. Chiudere con cura i piatti Petri e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO₂.
4. Rimimolate gli inserti nelle microplacchi da 12 pozzetti e aggiungete 500 L di mezzo MEM nel lato basolaterale dell'inserto permeabile per mantenere le condizioni DI ALI. Le cellule sono ora pronte per l'infezione.

3. Infezione da P. aeruginosa

NOTA: Tutti i seguenti passaggi da qui devono essere eseguiti in un laboratorio di biosafetà di livello 2 (BSL2).

1. Inoculare 15 mL di brodo di lniogene (LB) integrato con ampicillina da 300 g/mL in una fiaschetta di Erlenmeyer (50 mL) con una singola colonia di P. aeruginosa PAO1-GFP.
   NOTA: Altri ceppi di P. aeruginosa potrebbero essere utilizzati anche qui, ad esempio, paO1 wild type, PA14, o ceppi clinici, seguendo i propri protocolli di coltivazione.
2. Incubare i batteri per 18 h a 37 gradi centigradi, agitando a 180 giri/min.
3. Trasferire il contenuto dopo il tubo conico da 18 h in un tubo conico da 50 mL e la centrifuga a 3850 x g per 5 min. Scartare il supernatant e aggiungere 10 mL di PBS sterile a 37 gradi centigradi.
4. Misurare la densità ottica su uno spettrofotometro a lunghezza d'onda 600 nm e regolare la concentrazione dei batteri utilizzando il mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione finale di 2 x 10⁵ CFU/mL. Ciò corrisponde a una molteplicità di infezione (MOI) di un batterio per cellula epiteliale.
5. Aggiungere 100 L di sospensione batterica al lato aparico del supporto permeabile (passo 2.4.) e incubare a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO₂ per 1 h, per consentire l'attaccamento dei batteri alle cellule. Quindi, rimuovere il liquido a caldo con attenzione con una pipetta per ripristinare le condizioni ALI. Mantenere alcuni campioni non infetti come controllo.
   NOTA: In questa fase, i batteri attaccati devono essere placcati in Agar LB (vedi punti 5.4/5.5) per determinare l'inoculo iniziale dei batteri.
6. Incubare il farmaco di interesse dopo l'adesione batterica nelle cellule. Per gli esperimenti di trattamento, aggiungere 500 L di una soluzione farmacologica diluita nel mezzo cellulare (in questo protocollo è stato utilizzato il 6 g/mL) al lato apico. Aggiungere 1.500 L di mezzo cellulare senza farmaco sul lato basolatero.
   NOTA: Invece di instillare i farmaci come soluzione, il modello può anche essere adattato alla deposizione di aerosol. Per tali scopi, le cellule di ALI sono alimentate dal lato basolaterale con 500 L di mezzo cellulare. Il farmaco viene quindi prima nebulizzato e permesso di depositarsi nel compartimento ape da un dispositivo appropriato (non descritto qui). Il campione infetto e trattato può essere controllato per gli endpoint descritti nelle sezioni 4-7. Da questo passaggio in poi, i supporti permeabili possono essere utilizzati per creare immagini (sezione 4) o per ottenere risultati di crescita batterica e vitalità cellulare dei mammiferi, tra gli altri (sezioni 5–7).

4. Preparazione del campione per la microscopia a scansione laser confocale (CLSM)

1. Dopo l'istituzione della co-cultura, infezione e trattamento farmacologico, rimuovere tutti i mezzi dal lato apico e basolaterale. Lavare 1x con PBS a 37 gradi centigradi e quindi fissare le cellule con 3% di paraformaldeide (PFA) per 1 h a RT (300 l su apical/600 l su basolateral). I nuclei cellulari sono macchiati con 5 g/mL di DAPI-PBS per 30 min a temperatura ambiente.
   CAUTION: PFA è pericoloso.
2. Tagliare le membrane utilizzando un bisturi e posizionarle tra due vetrini di copertura in microscopia da 12 mm utilizzando un mezzo di montaggio (vedi Tabella dei materiali). Lasciare asciugare all'interno del banco di flusso per 30 minuti prima dello stoccaggio a 4 gradi centigradi. Visualizza mediante microscopia a scansione confocale.
   NOTA: Dopo la co-coltura e prima del montaggio, è possibile eseguire l'immunosostenimento delle giunzioni strette. Per questo, le cellule sono fissate con paraformaldeide 3% per 30 min, lavate di nuovo con PBS, e permeabili con saponin 0.05%/BSA 1% in PBS. In questo protocollo, la proteina zonula occludens (O-1) è stata rilevata tramite anticorpo anti-umano del topo (1:400, incubazione a 4 gradi centigradi durante la notte). I campioni sono stati poi incubati per 2 h a RT con anti-topo capra IgG anticorpo Alexa Fluor 633 (1:2000 in rosso). I nuclei sono stati macchiati con DAPI (1 g/mL) e montati con mezzo di montaggio su coperture.
3. Utilizzare un microscopio confocale per l'imaging delle membrane immagazzinate. Scegliere obiettivi di immersione in acqua 25x o 63x e laser a 405, 488, 505 o 633 nm per il rilevamento. Le immagini devono avere una risoluzione di 1024 x 1024 pixel.
   NOTA: I laser vengono scelti in base alla macchia utilizzata.
4. Acquisire viste apical e trasversali e utilizzare la modalità zeta-stack (10-15 pile) per la costruzione di un modello tridimensionale utilizzando un software di imaging.

5. Misurazione della proliferazione batterica tramite unità di formazione colonia (CFU)

1. Raccogliere il mezzo aturico e basolaterale (contenente batteri) per valutare la CFU dei batteri non attaccati. Raccogliere 500 L dai lati atici e basolateral e metterli in comune.
   NOTA: Utilizzare questa sospensione direttamente per contare i batteri (passaggio 5.4) o centrifuga a 21.250 x g per 10 min per valutare la diidrogenasi latta (LDH) dal supernatante (sezione 6) e/o ri-sospesa in PBS per contare i batteri extracellulari (passaggio 5.4).
2. Valutare la sopravvivenza dei batteri attaccati e/o internalizzati nelle cellule aggiungendo 500 L di acqua fredda sterile deionizzata in ogni compartimento del supporto permeabile. Incubare le cellule per 30 min a temperatura ambiente.
   NOTA: I campioni possono essere placcati su Agar LB (c'è il punto 5.4) o congelati (come piastra di inserto intero) a -20 gradi centigradi per placcatura in seguito.
3. Per valutare il CFU dei batteri aderenti/internalizzati, scongelare i campioni a 37oC per 10 min (se congelati). Utilizzando le punte di pipetta per ogni pozzo, raschiare la superficie della membrana e pipetta su e giù per rimuovere tutto il contenuto aderente.
   NOTA: In questa fase, tutte le cellule epiteliali sono lizzate e i batteri aderenti/internalizzati sono disponibili come sospensione da placcare.
4. Con le sospensioni batteriche di entrambe le frazioni, eseguire una diluizione seriale 1/10 utilizzando Tween-80 0,05% in PBS e placcare i batteri sulle piastre di agar LB.
   NOTA: Si consiglia di diluizioni tra 1 e 10. I batteri devono essere conteggiati nella diluizione più alta, dove le singole colonie vengono identificate per la prima volta.
5. Incubare le piastre di agar a 30oC per 16-72 h per contare le colonie, e calcolare CFU di conseguenza.
   NOTA: Una temperatura di 30oC al momento dell'incubazione delle placche è essenziale per i campioni trattati e per osservare la crescita ritardata delle colonie.

6. Valutazione della citotossicità cellulare tramite analisi disidrogenasi del lattato

1. Utilizzare il supernatant di cellule infette contenenti batteri (dal punto 5.1) per la valutazione della vitalità cellulare per il saggio LDH¹⁶. Centrifugare il supernatant a 21.250 x g per 10 min per pellet i batteri e, infine, il resto delle cellule. Utilizzare il supernatant senza batteri per misurare il rilascio di LDH.
   NOTA: Il supernatanto non deve essere congelato prima di misurare LDH con questo saggio.
2. Trasferire 100 L del supernante in una piastra da 96 potes gradi e aggiungere 100 L della soluzione di saggio LDH (vedere la Tabella dei Materiali). Incubare a temperatura ambiente per 5 min al buio, quindi leggere l'assorbimento a 492 nm.

7. Valutazione del rilascio di citochine umane

1. Per la quantificazione delle citochine, utilizzare ELISA o la matrice di perline citometriche immunoassay¹⁷(vedere la Tabella dei Materiali). Per questo, centrifugare supernatant dal passo 5.1 a 21.250 x g per 10 min e misurare immediatamente o conservare -80 gradi centigradi per un massimo di 15 giorni fino all'analisi.
2. Valuta i supernatanti con un kit ELISA disponibile in modo commerciale.
   NOTA: La procedura segue le istruzioni di fabbricazione, che includono il rivestimento di piastre con l'anticorpo di cattura, l'aggiunta dei campioni (100 L) e gli standard di citochina, l'incubazione, il lavaggio e l'aggiunta di anticorpi di rilevamento per fornire una misurazione colorimetrica della presenza di citochine. In alternativa, la citometria di flusso può essere utilizzata per misurare le citochine tramite kit disponibili in mercato (vedi Tabella dei materiali).

Risultati

La figura 1A mostra la morfologia della co-coltura risultante delle cellule epiteliali bronchiali umane e dei macrofagi dopo essere cresciuta sia per 24 h sul lato apicale che basolaterale dei supporti permeabili, rispettivamente. L'integrità della barriera epiteliale è dimostrata da TEER più alto (834 Ω-cm²) e CLSM da immunostaining per la proteina di giunzione stretta O-1 (Figura 1B). Gli stessi risultati osservati in termini di integrità barri...

Discussione

Questo documento descrive un protocollo per una co-coltura 3D delle vie aeree infette, costituito dalla linea cellulare epiteliale bronchiale della fibrosi umana CFBE41o- e dalla linea cellulare macrofamizza derivata dal monocito umano THP-1. Il protocollo consente la valutazione dell'integrità della barriera epiteliale, della trasmigrazione dei macrofagio, della sopravvivenza dei batteri e dell'infiammazione, che sono parametri importanti quando si testano l'efficacia dei farmaci e le risposte dell'ospite contemporanea...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	-
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o- cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754