P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

Resumo

Descrevemos um protocolo para um modelo tridimensional de co-cultura de vias aéreas infectadas, usando CFBE41o^- células, macrófagos THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, estabelecido na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma nova plataforma para testar simultaneamente a eficácia dos antibióticos, a função da barreira epitelial e marcadores inflamatórios.

Resumo

A pesquisa de fDrug para o tratamento de infecções pulmonares está progredindo para modelos in vitro preditivos de alta complexidade. A presença multifacetada de bactérias em modelos pulmonares pode retransformar o arranjo epitelial, enquanto as células imunes coordenam uma resposta inflamatória contra as bactérias no microambiente. Embora os modelos in vivo tenham sido a escolha para testar novos anti-infecciosos no contexto da fibrose cística, eles ainda não imitam com precisão as condições in vivo de tais doenças em humanos e os desfechos do tratamento. Modelos in vitro complexos das vias aéreas infectadas com base em células humanas (epiteliais brônquicais e macrófagos) e patógenos relevantes poderiam preencher essa lacuna e facilitar a tradução de novos anti-infecciosos para a clínica. Para tais efeitos, foi estabelecido um modelo de co-cultura da linha de células epiteliais antelásticas císticas humanas CFBE41o^- e macrófagos derivados do monócito THP-1, imitando uma infecção da mucosa brônquica humana por P. aeruginosa em condições de interface ar-líquido (ALI). Este modelo é configurado em sete dias, e os seguintes parâmetros são avaliados simultaneamente: integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófago, sobrevida bacteriana e inflamação. O presente protocolo descreve um sistema robusto e reprodutível para avaliar a eficácia da droga e respostas do hospedeiro que poderiam ser relevantes para a descoberta de novos anti-infecciosos e a otimização de sua entrega de aerossol para os pulmões.

Introdução

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno relevante na fibrose cística (CF) que contribui para o comprometimento do tecido pulmonar¹. A produção de polissacarídeos, como alginato e outros exopolídeos mucoides, coordena o progresso da doença, que leva à tenaz adesão bacteriana, limita a entrega de antibióticos a bactérias e protege as bactérias contra o sistema imunológico hospedeiro². A transição da P. aeruginosa da fase planctônica para a formação de biofilmes é uma questão crítica nesse contexto, facilitando também a ocorrência de tolerância a antibióticos.

No contexto da CF, o mouse tem sido usado principalmente como modelo. Os camundongos, no entanto, não desenvolvem espontaneamente essa doença com a introdução de mutações CF³. A maioria dos estudos de desenvolvimento de biofilme bacteriano e suscetibilidade a medicamentos tem sido realizada em superfícies abióticas, como placas de Petri. No entanto, essa abordagem não representa a complexidade in vivo. Por exemplo, importantes barreiras biológicas estão ausentes, incluindo células imunes, bem como o epitélio mucosa. Embora p. aeruginosa seja bastante tóxica para células epiteliais, alguns grupos conseguiram co-cultivar um biofilme P. aeruginosa anterior com células brônquicas humanas. Essas células originaram-se de pacientes com fibrose cística com mutação CFTR (CFBE41o^- células)⁴ e permitiram avaliar a eficácia do antibiótico⁵ ou avaliar a correção da proteína CFTR durante a infecção⁶. Tal modelo mostrou-se para melhorar a previsibilidade da eficácia da droga, além de possibilitar a caracterização de problemas com drogas que falharam em fases posteriores do desenvolvimento de medicamentos⁷.

No entanto, no pulmão, o epitélio mucosa é exposto ao ar. Além disso, as células imunes presentes nas vias aéreas, como macrófagos teciduais, desempenham um papel essencial contra patógenos ou partículas inaladas⁸. Macrófagos migram através das diferentes camadas celulares para alcançar o lúmen brônquico e combater a infecção. Além disso, as drogas inaladas também têm que lidar com a presença de muco como um elemento não celular adicional da barreira ar-sangue pulmonar⁹. De fato, vários modelos in vitro tridimensionais complexos (3D) foram desenvolvidos, com o objetivo de aumentar a relevância in vivo. Sistemas de co-cultura não só aumentam a complexidade de sistemas in vitro para descoberta de drogas, mas também permitem estudar interações célula-células. Tal complexidade tem sido abordada em estudos sobre a migração de macrófagos¹⁰, a liberação de peptídeos antimicrobianos por neutrófilos¹¹, o papel do muco na infecção⁹, e a reação das células epiteliais ao dano excessivo¹². No entanto, um modelo in vitro infectado por CF confiável que apresenta a mutação genética em CF, que é exposto ao ar (aumento da condição fisiológica), e integra as células imunes ainda está em falta.

Para preencher essa lacuna, descrevemos um protocolo para a co-cultura 3D humana estável das vias aéreas infectadas. O modelo é constituído por células epiteliais e macrófagos bronquiais humanos, infectados com P. aeruginosa e capazes de representar uma barreira difuso e imunológica. Com o objetivo de testar anti-infecciosos a uma taxa razoavelmente alta, esta co-cultura foi estabelecida na membrana de filtro permeável de pastilhas de placas de poço, utilizando duas linhas de células humanas: CFBE41o^- e macrófagos derivados de monócitos THP-1. Além disso, para eventualmente estudar a deposição de anti-infecciosos aerossolizados^13,o modelo foi estabelecido na interface ar-líquido (ALI) em vez de condições cobertas líquidas (LCC).

Como relatamos aqui, este modelo permite avaliar não apenas a sobrevivência bacteriana em um tratamento antibiótico, mas também citotoxicidade celular, integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófagos e respostas inflamatórias, que são parâmetros essenciais para o desenvolvimento de medicamentos.

Este protocolo combina dois tipos de células relevantes para a terapia de inalação das vias aéreas pulmonares: macrófagos e epitélio bronquial cf. Essas células são semeadas em lados opostos de pastilhas de suporte permeáveis, permitindo a exposição celular ao ar (chamada de interface ar-líquido (ALI). Esta co-cultura de células hospedeiras é subsequentemente infectada com P. aeruginosa. Ambas as linhas celulares hospedeiras são de origem humana: as células epiteliais representam o epitélio brônquico da fibrose cística, com uma mutação no canal CF (CFBE41o^-), e as células THP-1¹⁴ são uma linha celular bem caracterizada como macrófago. Uma camada epitelial confluente é permitida pela primeira vez para se formar no lado superior das pastilhas de placas de poço antes que as células semelhantes ao macrófago sejam adicionadas ao compartimento oposto. Uma vez que a co-cultura é estabelecida na ALI, o sistema é inoculado com P. aeruginosa no lado apical. Este sistema de cocultura infectado é então usado para avaliar a eficácia de um antibiótico, por exemplo, tobramicina. São analisados os seguintes pontos finais: integridade da barreira epitelial em termos de resistência elétrica transepitelial (TEER), visualização de interações célula-célula-célula-célula-bactérias por microscopia de varredura a laser confocal (CLSM), sobrevivência bacteriana por contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), sobrevivência celular hospedeira (citotoxicidade) e liberação de citocinas.

Protocolo

1. Crescimento e diferenciação de células em pastilhas de suporte permeáveis

1. Cultivar CFBE41o^- em um frasco T75 com 13 mL de meio essencial mínimo (MEM) contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% aminoácidos não essenciais e 600 mg/L de glicose a 37 °C com atmosfera de 5 % de CO_2. Adicione meio fresco às células a cada 2 a 3 dias.
   1. Retire as células após atingir 70% de confluência no frasco com 3 mL de trippsina- ácido edenediaminetetraacético (EDTA) a 37°C por 15 min. Adicione 7 mL de MEM fresco e centrifugar as células a 300 x g por 4 min a temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatante e adicione novos 10 mL de MEM enquanto interrompe os aglomerados, em tubos suavemente para cima e para baixo.
   2. Conte as células com um contador celular automatizado ou câmara hemótmetro. Células de sementes com densidade de 2 x 10⁵ células/poço em placas de 12 poços com suportes permeáveis (tamanho de poros de 3 μm, ver Tabela de Materiais).
      NOTA: O contador automatizado de células determina número de célula, distribuição de tamanho e viabilidade das células (ver Tabela de Materiais). Suportes permeáveis com tamanho de poros de 0,4 μm poderiam ser usados aqui; no entanto, os macrófagos, nesta condição, devem ser adicionados diretamente ao lado apical, e sua migração transcelular não será avaliada neste caso.
   3. Células de sementes em condição líquido-líquido (LLC) adicionando 500 μL da suspensão celular no lado apical do suporte permeável e 1,5 mL de meio fresco no lado basolateral. Em seguida, incubar células a 37°C abaixo de 5% de CO₂, por 72 h.
   4. Para mudar para a cultura de interface ar-líquido (ALI), no terceiro dia após a semeadura, remova o meio do lado basolateral primeiro, depois do lado apical. Ao lado basolateral, adicione 500 μL de MEM fresco e mude o meio a cada dois dias até que as células formem uma monocamada confluente.
      NOTA: Para as condições utilizadas neste protocolo, as células CFBE41o^- geralmente são confluentes após 3-7 dias na cultura.
   5. Avalie as propriedades da barreira epitelial no dia 7 incubando CFBE41o^- células com 500 μL de meio celular no lado apical e 1,5 mL no lado basolateral por 1h, a 37°C abaixo de 5% de CO₂.
   6. Medir as propriedades da barreira através da resistência elétrica transepitenelial (TEER), com um eletrodo de pauzinho STX2 e um volt-ohmmeter epitelial; depois de 7 dias este é superior a 300 Ω×cm².
      NOTA: Eventualmente, em algumas pastilhas de membrana, as células têm teer baixo. Portanto, não são utilizadas pastilhas permeáveis com TEER < 300 Ω×cm².
2. Para cultivar células THP-1, plante-as em um frasco T75 usando 13 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio suplementado com 10% de FCS, e incubar a 37°C abaixo de 5% de CO₂. Células divididas a cada segundo dia semeando células 2 x 10⁶ células/mL em um novo frasco T75.
   NOTA: As células THP-1 não diferenciadas são cultivadas como monócitos em suspensão.
   1. Diferencie as células THP-1 da seguinte forma. Cento destoe de um T75 a 300 x g por 4 min. Descarte o supernasce, resuspenque a pelota em meio fresco e coloque em um novo T75. Adicione 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) incubar as células em RPMI por 48 h a 37 °C e 5% de CO₂ atmosfera¹⁵.
      NOTA: Após a diferenciação com o PMA, as células não se proliferam mais e se prendem ao frasco.
   2. Para desprender células semelhantes ao macrófago THP-1, lave uma vez com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) a 37 °C e incubar com 3 mL de solução de descolamento celular (por exemplo, accutase) contendo 0,5 mM EDTA por 10 minutos à temperatura ambiente.
   3. Inspecione as células sob um microscópio invertido para procurar o destacamento celular. Adicione 7 mL de meio fresco e centrífuga a 300 x g por 4 min no RT.
      NOTA: Os macrófagos também podem ser destacados com trippsina-EDTA, 37 °C por 20 min. No entanto, a trippsina é mais dura aos macrófagos do que a solução de descolamento celular escolhida (ver Tabela de Materiais).
   4. Depois de remover o supernasce, suspenda derrese as células macrófagos em 3 mL de meio THP-1 em um tubo cônico de 15 mL, conte as células conforme descrito em 1.1.2. e incubar por uma máxima de 1h a 37 °C abaixo de 5% de CO₂ antes de configurar a co-cultura.
      NOTA: As células THP-1 em suspensão podem ser manchadas com corantes de viabilidade para a imagem da co-cultura ainda mais. Nesta etapa, utilize o procedimento abaixo (etapa 1.2.5).
   5. Macrófagos de manchas com 10 μM de um corante de viabilidade celular (baseado na conversão de moieties de acetato por esterases intracelulares, ver Tabela de Materiais) em que 3 μL do corante de viabilidade celular é aplicado à suspensão da célula. Incubar células por 20 min a 37 °C, 5% DE CO₂, depois lave 1x com PBS 37°C para remover o corante.
      NOTA: Centrifugar as células para remover o corante a 300 x g por 4 min a temperatura ambiente (RT).

2. Estabelecimento de uma co-cultura epitelial-macrófago em suportes permeáveis

1. Use CFBE41o^- monocamadas em ALI com TEER ≥ 300 Ω×cm² (etapa 1.1.6.). Retire o meio da câmara inferior, inverta cuidadosamente o suporte dentro de uma placa de vidro estéril de Petri (50 mm x 200 mm), e remova as células sobreessaladas através dos poros de membrana na parte inferior da membrana usando um raspador de células.
   NOTA: Devido ao tamanho dos poros de 3 μm, as células epiteliais tendem a crescer através dos poros em direção ao lado basolateral. Portanto, é preciso removê-los antes de adicionar os macrófagos deste lado. CFBE41o^- as células epiteliais pulmonares podem ser manchadas nesta etapa. O procedimento na etapa 1.2.5 pode ser utilizado; no entanto, em vez de uma suspensão celular, a solução de corante no MEM é aplicada (500 μL lado apical) apenas nas células aderidas no suporte permeável.
2. Use 2 x 10⁵ células/poço (em 200 μL de RPMI) da suspensão celular de macrófagos THP-1 diferenciados pelo PMA e coloque as células no lado basolateral das pastilhas invertidas.
3. Feche as placas de Petri cuidadosamente e incubar por 2h a 37 °C abaixo de 5% de CO₂.
4. Coloque as pastilhas de volta nas microplatas de 12 poços e adicione 500 μL de meio MEM no lado basolateral da inserção permeável para manter as condições de ALI. As células estão prontas para infecção.

3. Infecção por P. aeruginosa

NOTA: Todos os passos a seguir devem ser feitos em um laboratório de biossegurança nível 2 (BSL2).

1. Inoculação 15 mL de caldo de lysogeny (LB) suplementado com 300 μg/mL ampicillin em um frasco de Erlenmeyer (50 mL) com uma única colônia de P. aeruginosa PAO1-GFP.
   NOTA: Outras cepas de P. aeruginosa também poderiam ser usadas aqui, por exemplo, tipo selvagem PAO1, PA14, ou cepas clínicas, seguindo seus próprios protocolos de cultivo.
2. Incubar a bactéria por 18 h a 37°C, tremendo a 180 rpm.
3. Transfira o conteúdo após as 18h para um tubo cônico de 50 mL e centrífuga a 3850 x g por 5 min. Descarte o supernaspe e adicione 10 mL de PBS estéril a 37°C.
4. Meça a densidade óptica em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 600 nm e ajuste a concentração de bactérias usando o meio de cultura celular para uma concentração final de 2 x 10⁵ UFC/mL. Isso corresponde a uma multiplicidade de infecção (MOI) de uma bactéria por célula epitelial.
5. Adicione 100 μL de suspensão bacteriana ao lado apical do suporte permeável (etapa 2.4.) e incubar a 37 °C sob 5% de CO₂ por 1 h, para permitir o apego de bactérias às células. Em seguida, remova o líquido apical cuidadosamente com uma pipeta para restaurar as condições de ALI. Mantenha algumas amostras não infectadas como controle.
   NOTA: Nesta fase, as bactérias anexadas devem ser emplacar em ágar LB (ver passos 5.4/5.5) para determinar o inóculo das bactérias iniciais.
6. Incubar a droga de interesse após a adesão bacteriana nas células. Para experimentos de tratamento, adicione 500 μL de uma solução medicamentosa diluída em meio celular (neste protocolo foi utilizada tobramycina 6 μg/mL) ao lado apical. Adicione 1.500 μL de meio celular sem droga no lado basolateral.
   NOTA: Em vez de incutir as drogas como solução, o modelo também pode ser adaptado à deposição aerossol. Para tais efeitos, as células em ALI são alimentadas do lado basolateral com 500 μL de meio celular. A droga é então nebulizada e permitida a depósito no compartimento apical por um dispositivo apropriado (não descrito aqui). A amostra infectada e tratada pode ser verificada para os pontos finais descritos nas seções 4-7. A partir deste passo, suportes permeáveis podem ser usados para criar imagens (seção 4) ou para obter resultados de crescimento de bactérias e viabilidade celular de mamíferos, entre outros (seções 5-7).

4. Preparação da amostra para microscopia de varredura a laser confocal (CLSM)

1. Após o estabelecimento da cocultura, infecção e tratamento medicamentoso, remova todos os meios do lado apical e basolateral. Lave 1x com PBS a 37°C e, em seguida, fixe as células com 3% de paraformaldeído (PFA) por 1 h a RT (300 μL em apical/600 μL no basolateral). Os núcleos celulares são manchados com 5 μg/mL de DAPI-PBS por 30 minutos à temperatura ambiente.
   ATENÇÃO: A PFA é perigosa.
2. Corte as membranas usando um bisturi e coloque-as entre duas lâminas de tampa de microscopia de 12 mm usando um meio de montagem (ver Tabela de Materiais). Deixe secar dentro do banco de fluxo por 30 minutos antes de armazenar a 4 °C. Visualize por microscopia de varredura confocal.
   NOTA: Após a cocultura e antes da montagem, podem ser realizadas junções apertadas de imunossuagem. Para isso, as células são fixadas com paraformaldeído 3% por 30 min, lavadas novamente com PBS, e permeabilizadas com saponia 0,05%/BSA 1% em PBS. Neste protocolo, a proteína de oclundos de zonula (ZO-1) foi detectada através de anticorpo zo-1 anti-humano de camundongos (1:400, incubação a 4 °C durante a noite). As amostras foram então incubadas por 2 h no RT com anticorpo igG anti-rato de cabra Alexa Fluor 633 (1:2000 em vermelho). Os núcleos foram manchados com DAPI (1 μg/mL) e montados com meio de montagem em tampas.
3. Use um microscópio confocal para fotografar as membranas armazenadas. Escolha 25x ou 63x objetivos de imersão em água e lasers em 405, 488, 505 ou 633 nm para detecção. As imagens devem ter uma resolução de 1024 x 1024 pixels.
   NOTA: Os lasers são escolhidos de acordo com a mancha utilizada.
4. Adquira visualizações apical e seção transversal e use o modo zeta-stack (10-15 pilhas) para a construção de um modelo tridimensional usando software de imagem.

5. Medição da proliferação bacteriana através de unidades formadoras de colônias (UFC)

1. Colete o meio apical e basolateral (contendo bactérias) para avaliar a UFC de bactérias não ligadas. Colete 500 μL dos lados apical e basolateral e junte-os.
   NOTA: Use esta suspensão diretamente para contar bactérias (etapa 5.4) ou centrífuga a 21.250 x g por 10 minutos para avaliar lactato desidrogenase (LDH) do supernascido (seção 6) e/ou re-suspenso em PBS para contar bactérias extracelulares (passo 5.4).
2. Avalie a sobrevivência de bactérias presas e/ou internalizadas nas células adicionando 500 μL de água fria estéril deionizada em cada compartimento do suporte permeável. Incubar células por 30 minutos em temperatura ambiente.
   NOTA: As amostras podem ser banhadas em ágar LB (ver passo 5.4) ou congelado (como placa de inserção inteira) a -20 °C para chapeamento mais tarde.
3. Para avaliar a UFC de bactérias aderentes/internalizadas, descongele as amostras a 37°C por 10 minutos (se congelados). Usando pontas de pipeta para cada poço, raspe a superfície da membrana e a pipeta para cima e para baixo para remover todo o conteúdo aderido.
   NOTA: Nesta etapa, todas as células epiteliais são líricas e bactérias aderidas/internalizadas estão disponíveis como suspensão a ser emplacado.
4. Com a suspensão bacteriana de ambas as frações, realize uma diluição serial de 1/10 usando Tween-80 0,05% em PBS e emplaque as bactérias em placas de ágar LB.
   NOTA: Recomenda-se diluições entre 1 a 10. As bactérias devem ser contadas na maior diluição, onde colônias únicas são identificadas pela primeira vez.
5. Incubar placas de ágar a 30°C por 16-72 h para contar colônias, e calcular a UFC em conformidade.
   NOTA: Uma temperatura de 30°C no momento da incubação da placa é essencial para as amostras tratadas e para observar o crescimento atrasado das colônias.

6. Avaliação da citotoxicidade celular via ensaio de lactato desidrogenase

1. Use o supernatante de células infectadas contendo bactérias (a partir da etapa 5.1) para avaliação de viabilidade celular para o ensaio LDH¹⁶. Centrifugar o supernante a 21.250 x g por 10 minutos para pelotar as bactérias e, eventualmente, o resto das células. Use o supernanato livre de bactérias para medir a liberação de LDH.
   NOTA: O supernazio não deve ser congelado antes de medir o LDH por este ensaio.
2. Transfira 100 μL do supernante para uma placa de 96 poços e adicione 100 μL da solução de ensaio LDH (veja a Tabela de Materiais). Incubar à temperatura ambiente por 5 minutos no escuro, depois ler absorvente a 492 nm.

7. Avaliação da liberação de citocinas humanas

1. Para quantificação de citocinas, use o imunoensaio de matriz de contas ELISA ou citométrico¹⁷(ver a Tabela de Materiais). Para isso, a centrífuga supernasal a partir da etapa 5.1 a 21.250 x g por 10 min e mede imediatamente ou armazena -80 °C por até 15 dias até a análise.
2. Avalie os supernantes com um kit ELISA disponível comercialmente.
   NOTA: O procedimento segue as instruções de fabricação, que incluem o revestimento das placas com o anticorpo de captura, adição das amostras (100 μL) e normas de citocina, incubação, lavagem e adição de anticorpos de detecção para fornecer uma medição colorimétrica da presença de citocinas. Alternativamente, a citometria de fluxo pode ser usada para medir citocinas através de kits disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais).

Resultados

A Figura 1A mostra a morfologia da co-cultura resultante das células epiteliais e macrófagos brônquicos humanos depois de crescer tanto por 24 h no lado apical e basolateral de suportes permeáveis, respectivamente. A integridade da barreira epitelial é mostrada por TEER (834 Ω×cm²) e CLSM por imunostaining para a proteína de junção apertada ZO-1 (Figura 1B). Os mesmos resultados observados em termos de integridade de barreira de CFBE41o não...

Discussão

Este artigo descreve um protocolo para uma cocultura 3D das vias aéreas infectadas, constituída pela linha de células epiteliais anfíquiis císticas humanas CFBE41o- e a linha de células macrófagos derivadas do monocito humano THP-1. O protocolo permite a avaliação da integridade da barreira epitelial, transmigração de macrófagos, sobrevivência de bactérias e inflamação, que são parâmetros importantes ao testar a eficácia da droga e as respostas do hospedeiro simultaneamente. A novidade no modelo está ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	-
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o- cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754