JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.

Abstract

מחקר fDrug לטיפול בדלקות ריאות מתקדם לקראת חיזוי במודלים מוליטרו של מורכבות גבוהה. הנוכחות הרב-גפית של חיידקים במודלים של ריאות יכולה להתאים מחדש את הסידור האפיתל, בעוד תאים חיסוניים לתאם תגובה דלקתית נגד החיידקים בסביבה מיקרו. בעוד במודלים vivo היו הבחירה לבדיקת אנטי-זיהומים חדשים בהקשר של סיסטיק פיברוזיס, הם עדיין לא לחקות במדויק את תנאי vivo של מחלות כאלה בבני אדם ואת תוצאות הטיפול. מורכבים במודלים מולכיים של דרכי הנשימה הנגועות המבוססות על תאים אנושיים (אפיתל סיפונות וקרופאגים) ופתוגנים רלוונטיים יכולים לגשר על הפער הזה ולהקל על תרגום של נוגדי זיהומים חדשים למרפאה. למטרות כאלה, מודל תרבות שיתופית של סיסטיק פיברוזיס האנושית סימפונות קו תא אפיתל CFBE41o- ו THP-1 מונוציט נגזר מקרופאגים הוקמה, מחקה זיהום של רירית הסימפונות האנושית על ידי P. aeruginosa בממשק אוויר נוזלי (ALI) תנאים. מודל זה מוגדר בשבעה ימים, ואת הפרמטרים הבאים מוערכים בו זמנית: שלמות מחסום אפיתל, טרנסמיג מקרופאג,הישרדות חיידקים, ודלקת. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת חזקה ותשובת להערכת יעילות התרופה ותגובות מארחות שיכולות להיות רלוונטיות לגילוי נוגדי זיהומים חדשים ולייטוב אספקת האירוסול שלהם לריאות.

Introduction

פסאודומונס aeruginosa הוא פתוגן רלוונטי סיסטיק פיברוזיס (CF) שתורם ליקוי רקמת ריאה1. הייצור של פוליסכרידים, כגון אלגינט ואקסופוליסכרידים אחרים, מתאם את התקדמות המחלה, מה שמוביל לדבקות חיידקים עקשנית, מגביל את אספקת אנטיביוטיקה לחיידקים ומגן על החיידקים מפני המערכת החיסוניתהמארחת 2. המעבר של P. aeruginosa מהשלב פלנקטוני להיווצרות biofilm הוא נושא קריטי בהקשר זה, גם להקל על המופע של סובלנות לאנטיביוטיקה.

בהקשר של CF, העכבר שימש בעיקר כמודל. עכברים, עם זאת, לא באופן ספונטני לפתח מחלה זו עם המבוא של מוטציות CF3. רוב פיתוח הביופילם החיידקי ותרופות רגישות מחקרים בוצעו על משטחים abiotic, כגון צלי פטרי. עם זאת, גישה זו אינה מייצגת את מורכבות vivo. לדוגמה, מחסומים ביולוגיים חשובים נעדרים, כולל תאים חיסוניים, כמו גם אפיתל ריר. למרות P. aeruginosa הוא רעיל למדי לתאי אפיתל, כמה קבוצות הצליחו לטפח מוקדם P. aeruginosa biofilm עם תאים הסימונכיאליים האנושיים. תאים אלה מקורם חולי סיסטיק פיברוזיס עם מוטציה CFTR (CFBE41o- תאים)4 ומותר להעריך יעילותאנטיביוטית 5 או להעריך את התיקון של חלבון CFTR במהלךזיהום 6. מודל כזה הוצג כדי לשפר את יכולת החיזוי של יעילות התרופה, בנוסף לאפשר אפיון של בעיות עם תרופות שנכשלו בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח תרופות7.

עם זאת, בריאה, אפיתל הריר חשוף לאוויר. יתר על כן, תאים חיסוניים נוכחים בדרכי הנשימה, כמו מקרופאגים רקמה, לשחק תפקיד חיוני נגד פתוגנים בשאיפה אוחלקיקים 8. מקרופאגים נודדים דרך שכבות התא השונות כדי להגיע לומן הסיפונות ולהילחם בזיהום. יתר על כן, תרופות בשאיפה גם צריך להתמודד עם הנוכחות של ריר כמרכיב נוסף שאינו תאי של מחסום דם האווירריאתי 9. ואכן, פותחו מספר תלת מימד מורכבים (תלת מימד) בדגמי מבחנה, במטרה להגדיל את הרלוונטיות של vivo. מערכות שיתוף תרבות לא רק להגדיל את המורכבות של מערכות חוץ חוץ עבור גילוי סמים, אלא גם לאפשר ללמוד אינטראקציות תא. מורכבות כזו טופלה במחקרים על הגירהמקרופאג 10, שחרור פפטידים מיקרוביאליים על ידינויטרופילים 11, התפקיד שלריר בזיהום 9, ואת התגובה תא אפיתל לנזקמוגזם 12. עם זאת, אמין CF נגוע במודל במבחנה הכולל את המוטציה הגנטית ב CF, כי הוא חשוף לאוויר (מצב פיזיולוגי מוגבר), ומשלב תאים חיסוניים עדיין חסר.

כדי לגשר על הפער הזה, אנו מתארים פרוטוקול לתרבות תלת-מית-מית-מית-אנושית יציבה של דרכי הנשימה הנגועות. המודל מורכב של תאי אפיתל סימונכיים CF אנושיים מקרופאגים, נגוע P. aeruginosa ומסוגל לייצג מחסום דיפוזיה ואימונולוגית. במטרה לבחון נוגדי זיהומים בתפוקה גבוהה למדי, תרבות משותפת זו הוקמה על קרום מסנן חדיר של תוספות צלחת באר, באמצעות שני קווי תאים אנושיים: CFBE41o- ו מקרופאגים נגזר THP-1 מונוציט. יתר על כן, כדי ללמוד בסופו של דבר את התצהיר שלתרסיס נגד זיהומים 13, המודל הוקם בממשק האוויר נוזלי (ALI) ולא תנאים מכוסים נוזלי (LCC).

כפי שאנו מדווחים כאן, מודל זה מאפשר להעריך לא רק הישרדות חיידקים על טיפול אנטיביוטי, אלא גם ציטוקסיות תא, שלמות מחסום אפיתל, טרנסמיג מקרופאג, ותגובות דלקתיות, שהם פרמטרים חיוניים לפיתוח תרופות.

פרוטוקול זה משלב שני סוגי תאים רלוונטיים לטיפול בשאיפה של דרכי הנשימה הריאתיות: מקרופאגים ואפיליום סימפונות CF. תאים אלה נזרעים משני צדי המתוספה לתמיכה חדיר, ומאפשרים חשיפה לתא לאוויר (הנקרא תנאי ממשק נוזלי אוויר (ALI). תרבות זו של תאים מארחים נגועה לאחר מכן P. aeruginosa. שני קווי התא המארחים הם ממוצא אנושי: תאי האפיתל מייצגים את האפיתל הסימפונת סיסטיק פיברוזיס, עם מוטציה בערוץ CF (CFBE41o-), ואת THP-1114 תאים הם קו תא מאופיין היטב דמוי מקרופאג. שכבת אפיתל confluent מותרת תחילה ליצור בצד העליון של מותב צלחת באר לפני תאים כמו מקרופאג מתווספים לתא הנגדי. לאחר שהתרבות ההתופת הוקמה ב-ALI, המערכת מחוסנת עם P. aeruginosa בצד apical. מערכת זו נגועה שיתוף תרבות משמש לאחר מכן כדי להעריך את היעילות של אנטיביוטיקה, למשל tobramycin. נקודות הקצה הבאות מנותחות: שלמות מחסום אפיתל במונחים של התנגדות חשמלית טרנסאפיתליאלית (TEER), הדמיה של תא תא ותאי-חיידקים אינטראקציות על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM), הישרדות חיידקים על ידי ספירה של יחידות יוצרי מושבה (CFU), הישרדות תאי מארח (cytotoxicity) ושחרור ציטוקינה.

Protocol

1. צמיחה והבידול של תאים בהוספת תמיכה חדיר

  1. לטפח CFBE41o- בקבוקון T75 עם 13 מ"ל של מינימום חיוני בינוני (MEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי (FCS), 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו 600 מ"ג / L גלוקוז ב 37 ° C עם 5 % CO2 אטמוספרה. מוסיפים מדיום טרי לתאים כל 2-3 ימים.
    1. נתק את התאים לאחר שהגיע 70% confluence בקבוקון עם 3 מ"ל של טריפסין- חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף 7 מ"ל של MEM טרי וצנטריפוגה התאים ב 300 x g עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנטנט והוספו 10 מ"ל חדשים של MEM תוך שיבוש הגושים על-ידי התפתלות בעדינות כלפי מטה.
    2. ספור את התאים עם מונה תא אוטומטי או תא המוציטומטר אוטומטי. תאי זרע עם צפיפות של 2 x 105 תאים / גם 12-גם לוחות עם תומך חדיר (גודל נקבוביות של 3 μm, ראה טבלת חומרים).
      הערה: מונה התא האוטומטי קובע מספר תא, התפלגות גודל וכדאיות של התאים (ראה טבלת חומרים). תומך חדירות עם גודל נקבוביות של 0.4 μm יכול לשמש כאן; עם זאת, יש להוסיף את מקרופאגים, במצב זה, ישירות לצד האפאלי, וההעברה הטרנס-תאית שלהם לא תוערך במקרה זה.
    3. תאי זרע במצב נוזלי נוזלי (LLC) על ידי הוספת 500 μL של מתלי התא בצד apical של תמיכה חדיר ו 1.5 מ"ל של מדיום טרי בצד basolateral. לאחר מכן דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2, עבור 72 שעות.
    4. כדי לעבור לתרבות ממשק האוויר-נוזלי (ALI), ביום השלישי לאחר זריעה, להסיר את המדיום מהצד basolateral הראשון, לאחר מכן מהצד apical. לצד הבאסולטרלי, להוסיף 500 μL של MEM טרי ולשנות את המדיום בכל יום שני עד תאים יוצרים שכבת מונו-שכבה confluent.
      הערה: עבור התנאים המשמשים בפרוטוקול זה, CFBE41o- תאים בדרך כלל הם confluent לאחר 3-7 ימים בתרבות.
    5. להעריך את מאפייני מחסום האפיתל ביום 7 על ידי דגירה CFBE41o- תאים עם 500 μL תא בינוני בצד apical ו 1.5 מ"ל בצד basolateral עבור 1 h, ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2.
    6. למדוד את מאפייני המחסום באמצעות התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER), עם אלקטרודה צ'ופסטיק STX2 וmmeter וולט אפיתל; לאחר 7 ימים זה גבוה מ- 300 Ω×cm².
      הערה: בסופו של דבר, בחלק מהתוססות קרום, התאים יש TEER נמוך. לכן לא נעשה שימוש בתוסוסים חדירים עם TEER < 300 Ω×cm².
  2. כדי לטפח תאי THP-1, לגדל אותם בקבוקון T75 באמצעות 13 מ"ל של רוזוול פארק ממון מכון (RPMI) 1640 בינוני בתוספת עם 10% FCS, ולדגר ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2. פיצול תאים בכל יום שני על-ידי זריעת 2 x10 6 תאים/תאי מ"ל במבחנון T75 חדש.
    הערה: תאי THP-1 שאינם מובדילים גדלים כמו מונוציטים בהשעיה.
    1. הבדיל את תאי THP-1 באופן הבא. תכולת צנטריפוגה של T75 ב- 300 x g למשך 4 דקות. השליכו את הסופרנטנט, תוסתו מחדש את הכדור במדיום טרי והכניסו T75 חדש. להוסיף 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-אצטט (PMA) אינקובטי התאים RPMI עבור 48 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2 אווירה 15.
      הערה: לאחר ההבידול עם PMA, תאים אינם משגשגים עוד וצורף לסקבוקון.
    2. כדי לנתק תאי THP-1 כמו מקרופאג', לשטוף פעם אחת עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) ב 37 °C דגירה עם 3 מ"ל של פתרון ניתוק תאים (למשל accutase) המכיל 0.5 mM EDTA עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לחפש ניתוק תאים. הוסף 7 מ"ל של מדיום וצנטריפוגה טריים ב-300 x g למשך 4 דקות ב-RT.
      הערה: ניתן גם לנתק מקרופאגים באמצעות trypsin-EDTA, 37 °C למשך 20 דקות. עם זאת, trypsin קשה יותר מקרופאגים מאשר פתרון ניתוק התא שנבחר (ראה טבלת חומרים).
    4. לאחר הסרת supernatant, להשעות מחדש את תאי מקרופאג ב 3 מ"ל של THP-1 בינוני לתוך צינור חרלי 15 מ"ל, לספור את התאים כמתואר ב 1.1.2. ותדגירה לשעה אחת לכל היותר ב- 37°C מתחת ל- 5% CO2 לפני הגדרת התרבות ההתוכלתית.
      הערה: תאי THP-1 בהשעיה יכולים להיות מוכתמים בצבעי קיימא כדי להמשיך ולמצוא את התרבות ההפוכת. בשלב זה, השתמש בהליך שלהלן (שלב 1.2.5).
    5. מקרופאגים כתם עם 10 μM של צבע הכדאיות של התא (מבוסס על ההמרה של moieties אצטט על ידי אסטראזה תאית, ראה טבלת חומרים)שבו 3 μL של צבע הכדאיות של התא מוחל על מתלה התא. דגירה תאים במשך 20 דקות ב 37 ° C, 5% CO2, ולאחר מכן לשטוף 1x עם PBS 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הצבע.
      הערה: צנטריפוגה התאים כדי להסיר את הצבע ב 300 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT).

2. הקמת תרבות שיתוף אפיתל-מקרופאג על תמיכות חדירות

  1. השתמש ב- CFBE41o- שכבות מונו-שכבות ב- ALI עם TEER - 300 Ω×cm² (שלב 1.1.6). מוציאים את המדיום מהתא התחתון, הפוך בזהירות את התמיכה בתוך צלחת פטרי מזכוכית סטרילית (50 מ"מ x 200 מ"מ), והסר את התאים המגודלים דרך נקבוביות הממברנה בצד התחתון של הממברנה באמצעות מגרד תאים.
    הערה: בשל גודל הנקבוביות של 3 μm, תאים אפיתל נוטים לגדול דרך הנקבוביות לכיוון הצד basolateral. לכן, יש להסיר אותם לפני הוספת מקרופאגים בצד זה. CFBE41o- תאי אפיתל ריאות ניתן להכתים בשלב זה. ניתן להשתמש בהליך בשלב 1.2.5; עם זאת, במקום מתלה תא, פתרון הצבע ב MEM מוחל (500 μL צד apical בלבד) על התאים דבקים על תמיכה חדירות.
  2. השתמש 2 x 105 תאים / באר (ב 200 μL של RPMI) מהתלה התא של מקרופאגים THP-1 מופללים PMA ולמקם את התאים בצד basolateral של תוספות הפוכות.
  3. סוגרים בזהירות את מנות פטרי ומדגרים למשך 2 שעות ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO2.
  4. מניחים את התוספות בחזרה לתוך 12-באר microplates ולהוסיף 500 μL של MEM בינוני בצד basolateral של תוספת חדירות כדי לשמור על תנאי ALI. התאים מוכנים כעת לזיהום.

3. זיהום על ידי P. aeruginosa

הערה: כל השלבים הבאים מכאן חייבים להיעשות במעבדה ברמה 2 (BSL2).

  1. לחסן 15 מ"ל של מרק ליסוגני (LB) בתוספת 300 μg / מ"ל אמפוצילין בקבוקון Erlenmeyer (50 מ"ל) עם מושבה אחת של P. aeruginosa PAO1-GFP.
    הערה: זנים אחרים של P. aeruginosa יכול לשמש גם כאן, למשל, PAO1 סוג פראי, PA14, או זנים קליניים, בעקבות פרוטוקולי טיפוח משלהם.
  2. דגירה החיידקים במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 180 סל"ד.
  3. מעבירים את התוכן לאחר 18 שעה לצינור חסונים של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-3850 x g למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והוספו 10 מ"ל PBS סטרילי ב-37°C.
  4. למדוד צפיפות אופטית על ספקטרופוטומטר באורך גל 600 מילימטר ולהתאים את ריכוז החיידקים באמצעות תא תרבות בינונית לריכוז סופי של 2 x 105 CFU / מ"ל. זה מתאים ריבוי של זיהום (MOI) של חיידק אחד לכל תא אפיתל.
  5. להוסיף 100 μL של השעיה חיידקים לצד apical של תמיכה חדירות (שלב 2.4.) וגינור ב 37 °C תחת 5% CO2 עבור 1 h, כדי לאפשר חיידקים מצורף לתאים. לאחר מכן, להסיר נוזל apical בזהירות עם פיפטה כדי לשחזר את תנאי ALI. שמור כמה דגימות נגועות כפקד.
    הערה: בשלב זה, החיידקים המצורפים צריך להיות מצופה LB אגר (ראה שלבים 5.4/5.5) כדי לקבוע את inoculum חיידקים ראשוניים.
  6. דגירה התרופה של עניין לאחר הדבקה חיידקית בתאים. לניסויים בטיפול, להוסיף 500 μL של פתרון תרופה מדוללת במדיום התא (בפרוטוקול זה tobramycin 6 μg / מ"ל שימש) לצד apical. להוסיף 1,500 μL של תא בינוני ללא תרופה בצד basolateral.
    הערה: במקום להחדיר את התרופות כפתרון, המודל יכול להיות מותאם גם לתצהיר אירוסול. למטרות כאלה, התאים ב ALI מוזנים מהצד basolateral עם 500 μL של תא בינוני. לאחר מכן התרופה היא ערפילית הראשונה ומותר להפקיד בתא apical על ידי מכשיר מתאים (לא מתואר כאן). ניתן לבדוק את הדגימה הנגועה והמטופלת עבור נקודות הקצה המתוארות בסעיפים 4-7. ממדרגה זו, ניתן להשתמש בתמינים חדירים כדי ליצור תמונות (סעיף 4) או כדי לקבל תוצאות של צמיחת חיידקים וכדאיות תאים יונקים, בין היתר (סעיפים 5-7).

4. הכנה לדוגמה למיקרוסקופ סריקת לייזר קונקודאלי (CLSM)

  1. לאחר הקמת התרבות ההתפלה, הזיהום והטיפול התרופתי, הסר את כל המדיום מהצד האפאלי והבסולטרלי. לשטוף 1x עם PBS ב 37 ° C ולאחר מכן לתקן את התאים עם 3% paraformaldehyde (PFA) עבור 1 שעה ב RT (300 μL על apical / 600 μL על basolateral). גרעין התא מוכתם עם 5 μg /mL של DAPI-PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    אזהרה: PFA הוא מסוכן.
  2. חותכים את הממברנות באמצעות אזמל ומניחו אותן בין שתי שקופיות כיסוי מיקרוסקופיות של 12 מ"מ באמצעות אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים). תן לו להתייבש בתוך ספסל הזרימה במשך 30 דקות לפני האחסון ב 4 מעלות צלזיוס. דמיין על-ידי מיקרוסקופ סריקה קונפוקל.
    הערה: לאחר התרבות ההתקוטטות ולפני ההרכבה, ניתן לבצע צמתים הדוקים. בשביל זה, תאים קבועים עם paraformaldehyde 3% עבור 30 דקות, נשטף שוב עם PBS, ו permeabilized עם saponin 0.05%/BSA 1% ב PBS. בפרוטוקול זה, חלבון zonula occludens (ZO-1) זוהה באמצעות נוגדן ZO-1 אנטי-אנושי של העכבר (1:400, דגירה ב 4 °C לילה). הדגימות היו אז דגירה במשך 2 שעות ב RT עם נוגדן IgG נגד עיזים אלקסה פלור 633 (1:2000 באדום). גרעין היו מוכתמים DAPI (1 μg / מ"ל) והרכוב עם הרכבה בינונית על כיסויים.
  3. השתמש במיקרוסקופ קונפוקל להדמיית הממברנות המאוחסנות. בחר יעדים ולייזרים של 25x או 63x לטבילה במים ב- 405, 488, 505 או 633 נה"מ לזיהוי. לתמונות צריכה להיות רזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים.
    הערה: הלייזרים נבחרים על פי הכתם המשמש.
  4. רכוש תצוגות apical ורוחב חתך, והשתמש במצב זטה-מחסנית (10-15 ערימות) לבניית מודל תלת מימדי באמצעות תוכנת הדמיה.

5. מדידה של התפשטות חיידקים באמצעות יחידות יוצרי מושבה (CFU)

  1. לאסוף את המדיום apical ו basolateral (המכיל חיידקים) כדי להעריך CFU של חיידקים שאינם מחוברים. לאסוף 500 μL מן הצדדים apical ו basolateral והבריכה אותם.
    הערה: השתמש בהשעיה זו ישירות כדי לספור חיידקים (שלב 5.4) או צנטריפוגה ב- 21,250 x g עבור 10 דקות כדי להעריך את ההירוגנאז של הקטאט (LDH) מהסופרנט (סעיף 6) ו/או מושהה מחדש ב-PBS כדי לספור חיידקים חוץ-תאיים (שלב 5.4).
  2. להעריך את ההישרדות של חיידקים מחוברים ו / או הופנימה בתאים על ידי הוספת 500 μL של מים קרים deionized סטרילי בכל תא של התמיכה חדירות. דגירה תאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתן לתגלח את הדגימות על LB agar (ראה שלב 5.4) או קפוא (כמו לוח הוספה שלם) ב-20 °C עבור ציפוי מאוחר יותר.
  3. להערכת CFU של חיידקים דבקים /פנימיים, להפשיר דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (אם קפוא). באמצעות טיפים פיפטה עבור כל באר, לגרד את משטח קרום פיפטה למעלה ו למטה כדי להסיר את כל התוכן דבק.
    הערה: בשלב זה, כל תאי האפיתל הם lysed חיידקים adherent / פנימי זמינים כמו השעיה להיות מצופה.
  4. עם המתלים החיידקיים משני השברים, לבצע דילול סדרתי 1/10 באמצעות Tween-80 0.05% PBS וצלחת החיידקים על לוחות אגר LB.
    הערה: מומלץ לדללות בין 1 ל- 10. יש לספור את החיידקים באופן הגבוה ביותר, שבו מושבות בודדות מזוהות לראשונה.
  5. דגירה צלחות אגר ב 30 מעלות צלזיוס עבור 16-72 שעות לספור מושבות, ולחשב CFU בהתאם.
    הערה: טמפרטורה של 30°C בזמן הדגירה של צלחת חיונית עבור דגימות מטופלים כדי לצפות בצמיחה מושהית של מושבות.

6. הערכה של ציטוקסיות תא באמצעות לקטאט דהירוגנאז תסיסה

  1. השתמש supernatant של תאים נגועים המכילים חיידקים (מ שלב 5.1) להערכת יכולת הכדאיות של התא עבור LDH assay16. צנטריפוגה supernatant ב 21,250 x g עבור 10 דקות כדי גלולות החיידקים ובסופו של דבר שאר התאים. השתמש supernatant ללא חיידקים כדי למדוד שחרור LDH.
    הערה: אין להקפיא את הסופרנט לפני מדידת LDH על-ידי הודעה זו.
  2. להעביר 100 μL של supernatant לצלחת 96-באר, ולהוסיף 100 μL של פתרון LDH אסאי (ראה את טבלת החומרים). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך, ואז לקרוא ספיגה ב 492 nm.

7. הערכת שחרורו של ציטוקינות אנושיים

  1. לכמת ציטוקין, השתמשו במערך ELISA או במערך חרוזיםציטומטרי 17 (ראה טבלת החומרים). כך, supernatant צנטריפוגה מ שלב 5.1 ב 21,250 x g עבור 10 דקות למדוד באופן מיידי או לאחסן -80 °C עד 15 ימים עד הניתוח.
  2. הערך סופרנטנטים באמצעות ערכת ELISA הזמינה מסחרית.
    הערה: ההליך עוקב אחר הוראות הייצור, הכוללות ציפוי של לוחות עם נוגדן הלכידה, תוספת של הדגימות (100 μL) ותקני ציטוקין, דגירה, כביסה, ותוספת של נוגדן זיהוי כדי לספק מדידה צבעית של נוכחות ציטוקין. לחלופין, ציטומטריית זרימה יכולה לשמש כדי למדוד ציטוקינות באמצעות ערכות זמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

איור 1A מראה את המורפולוגיה של התרבות ההפוכה של תאי אפיתל הסימונכיים האנושיים וקרופאגים לאחר גידול במשך 24 שעות בצד האפי והבסולטרלי של תמיכות חדירות, בהתאמה. שלמות מחסום האפיתל מוצגת על-ידי TEER גבוה יותר (834 Ω×cm2)ו- CLSM על-ידי חיסון עבור חלבון צומת הדוק ZO-1(איור 1B...

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור תרבית 3D של דרכי הנשימה הנגועות, המהווה על ידי סיסטיק פיברוזיס הסימפונת הסימפונת קו תא CFBE41o- ואת קו תא מקרופאג מונוציט אנושי נגזר THP-1. הפרוטוקול מאפשר הערכה של שלמות מחסום אפיתל, תרדת מקרופאג, הישרדות חיידקים, ודלקת, שהם פרמטרים חשובים בעת בדיקת יעילות התרופה ותגוב?...

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו קיבלה מימון מתכנית HORIZON 2020 של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי, והדגמה תחת הסכם מענק מס ' 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - עיצוב, ופיתוח של ננו-תרופות מתקדמות כדי להתגבר על מחסומים ביולוגיים ולטייסת במחלות קשות. אנו מודים לד"ר אנה קוסטה וד"ר ג'ני Juntke על התמיכה הגדולה על הפיתוח של התרבות ההפוכת, אולגה הרטוויג, על האיור המדעי, אניה Honecker, עבור ELISA assays, פטרה König, יאנה Westhues וד"ר קיארה דה רוסי על התמיכה בתרבות התא, ניתוח, ומיקרוסקופיה. אנחנו גם מודים לצ'לסי ת'ורן על הגהה של כתב היד שלנו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AccutaseAccutaseAT104
AmpicillinCarl Roth, GermanyHP62.1
CASY TT Cell Counter and AnalyzerOLS Omni Life Sciences-
CellTrace Far RedThermo FischerC34564
Centrifuge Universal 320RHettich, Germany1406
CFBE41o- cells1. Gruenert Cell Line Distribution Program
2. Sigma-Aldrich		1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert
2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mmWorld Precision Instruments, Sarasota, USASTX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSMLeica, Mannheim, GermanyTCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kitsAffymetrix eBioscience, USA15541037
Cytokines Panel I and IILEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)Roche11644793001
D-(+) GlucoseMerck47829
Dako Fluorescence Mounting MediumDAKOS3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo FischerD1306
Epithelial voltohmmeterWorld Precision Instruments, Sarasota, USAEVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, SterileCorning, Amsterdam, Netherlands353181
Fetal calf serumLonza, Basel, SwitzerlandDE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633InvitrogenA-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscleRoche, Mannheim, Germany10127230001
LB brothSigma-Aldrich, GermanyL2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.11140050
P. aeruginosa strain PAO1American Type Culture Collection47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFPAmerican Type Culture Collection10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%EMS DIASUM15710-S
Phosphate buffer solution bufferThermo Fischer10010023
Petri dishesGreiner664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma, GermanyP8139-1MG
Precision Cover GlassesThorLabsCG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibodyBD Transduction Laboratories610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumGibco by Lifetechnologies, Paisley, UK11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)Normax, Portugal5058561
SaponinSigma-Aldrich, GermanyS4521
T75 culture flasksThermo Fischer156499
THP-1 cellsDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)No. ACC-16
Tobramycin sulfate saltSigmaT1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%Thermo Fischer25300054
Tween80Sigma-Aldrich, GermanyP1754

References

  1. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
  2. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  3. Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  4. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
  5. Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
  6. Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
  7. Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
  8. Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
  9. Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
  10. Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
  11. Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  12. Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
  13. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
  14. Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
  15. Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
  16. Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
  17. Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
  18. Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
  19. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
  20. Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
  21. Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  22. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
  23. Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  24. Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
  25. Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
  26. Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
  27. Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
  28. Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
  29. Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
  30. Ho, D. -. K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE160BiofilmsinterleukinsTEER

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved