植物圈和蔬菜发酵微生物群研究的侏儒生物系统

摘要

一种种植无细菌的纳帕卷心菜的方法已经开发出来，使研究人员能够评估单一微生物物种或多物种微生物群落在卷心菜叶表面是如何相互作用的。还提出了一种无菌蔬菜提取物，可用于测量蔬菜发酵过程中社区成分的变化。

摘要

植物层是植物的地上部分，可以由微生物殖民，是一个有用的模型系统，用于识别微生物群落的组装过程。该协议概述了一个系统，用于研究纳帕卷心菜植物植物圈中的微生物群落动力学。它描述了如何在试管中用钙化粘土和养分汤基质种植无细菌植物。接种具有特定微生物培养物的无细菌植物为测量植物圈中的微生物生长和社区动力学提供了机会。也可以评估，通过使用从卷心菜中产生的无菌蔬菜提取物在发酵过程中发生的微生物群落中发生的变化。该系统在实验室中设置相对简单且价格低廉，可用于解决微生物群落中的关键生态问题。它还提供了了解植物圈群落组成如何影响蔬菜发酵的微生物多样性和质量的机会。这种发展侏儒大白菜植物群落的方法可以应用于其他野生和农业植物物种。

引言

植物层的多样性在维持植物健康方面起着重要作用，也会影响植物承受^{环境压力的能力,}1、2、3、4、5。^2,3,4,5反过来，作物的健康直接影响到食品安全和质量^。,7植物在生态系统功能中起着一定的作用，它们相关的微生物群落既影响植物开展这些活动的能力，又直接影响^{环境本身。}虽然科学家已经开始破译植物圈的功能和组成，但影响植物圈微生物群落群的生态过程尚未完全了解^。,10植物层微生物群是研究微生物群落生态学的优良实验^系统。这些社区相对简单，许多社区成员可以在标准实验室媒体^{10，12，13,12,上成长}。

发酵蔬菜是植物圈社区结构具有重要后果的一个系统。在酸菜和泡菜中，自然存在于蔬菜叶子上的微生物（布拉西卡物种 的 植物层）是发酵^{14，15的孵化。}乳酸菌（LAB）被认为是植物微生物群落中无处不在的成员，然而它们在植物圈¹⁶中丰度低。发酵过程中强烈的非生物选择驱动微生物群落成分的变化，使乳酸菌的丰度增加。随着实验室的成长，他们生产乳酸，从而创造了发酵蔬菜产品的酸性^环境。植物层和发酵之间的联系提供了一个机会，利用蔬菜作为模型，以了解微生物群系的结构。

我们已经开发出了种植无细菌的纳帕卷心菜的方法，并使用喷雾瓶用特定的微生物群落为它们接种。这是一种廉价而可靠的方法，用单个微生物或混合群落均匀地接种卷心菜。无菌蔬菜提取物（SVE）也从三种不同的卷心菜类型/品种开发:红色和绿色卷心菜（布拉西卡油菜菜）和纳帕卷心菜（B.拉帕）。向这些 SVEs 添加盐可复制发酵环境，并允许对发酵微生物群组装进行小规模和相对较高的实验性研究。这些方法可用于研究植物圈中的微生物群落，以及如何将植物圈中的微生物群落动力学与植物发酵的成功联系在一起。

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研究方案

1. 种植无细菌卷心菜

1. 准备种植无菌卷心菜的设备
   1. 清洁烧结粘土以去除细小的灰尘颗粒
      1. 用自来水冲洗钙化粘土（材料表）至少3倍;排水。
         注意:钙化粘土产生非常细的灰尘，建议在洗涤时戴上防护面罩（材料表）。
      2. 将烧结粘土作为薄层（±4厘米）铺入自动包装托盘，并在干燥循环（121°C加热20分钟和20分钟干燥时间）上进行解洗，进行灭菌。
      3. 在使用前，将烧结粘土摊开，放入温暖的培养箱（30~37 °C）中至少一周，使烧结粘土完全干燥。搅拌每3天混合完全干燥烧结粘土，这样它将吸收均匀数量的Murashige和Skoog（MS）营养汤（第1.2节）。
         注:干燥也有助于保持钙化粘土的体积，即使它被称入管中。通过其他方式（如烘干炉）干燥也适用。
   2. 清洁玻璃器皿，种植无细菌卷心菜
      1. 每次使用时彻底清洁和消毒玻璃管（材料表）。在 30% 漂白剂中浸泡管 30 分钟，然后用自来水冲洗，然后用酸洗法在细菌学环境中清洗。酸洗双向试管盖（材料表）在用途之间。
   3. 表面消毒卷心菜种子
      1. 将多达100个纳帕卷心菜（B.拉帕瓦尔·佩基宁西斯）种子放在1.5 mL微离心管中。
         注:将100多个种子添加到一个微离心管或改变管的大小可能会影响种子的发芽率，由于缺乏种子涂层去除。
      2. 在种子中加入1 mL的70%乙醇，涡流5分钟，使用移液器丢弃乙醇。
      3. 加入 1 mL 的 50% 漂白剂和涡流 5 分钟。使用移液器丢弃漂白剂溶液。
      4. 加入1 mL的自动脱化水和涡流5分钟。用移液器丢弃脱化水。
      5. 重复步骤 1.1.3.4 3x 以冲洗掉所有漂白剂。在种植前将种子浸泡在无菌脱水中2~8小时，以软化种子涂层。
2. 种植无细菌卷心菜
   注:纳帕卷心菜（B.拉帕瓦尔佩基宁西斯）生长在玻璃管（15厘米x2.5厘米），含有钙化粘土浸泡在村山和Skoog（MS）营养汤（图1）。
   1. 将 10 g 清洁钙化粘土重到干净的玻璃管中（15 厘米 x 2.5 厘米）。
   2. 在1L的去ion化水中溶解4.4克MS介质，准备MS营养汤。将 MS 营养汤（±9 mL）添加到每个玻璃管中，使用移液器覆盖钙化粘土。
      注:在管中站立的液体将防止种子发芽，因此可能需要向某些管中添加稍微少一些MS汤。
   3. 松散盖玻璃管，带 22 mm 双向试管盖和自动参见写器（121 °C，60 分钟）。将其从自动保护器中卸下时，将盖推到玻璃管上以密封它们。使用前将管子冷却至室温。
   4. 使用无菌的超长（25.4 厘米）钳子轻轻地将一个无菌卷心菜种子放入每个管的中心。将管子放在一个 7 路托盘中，然后放在灯架下（全光谱 T5 荧光灯泡或其他照明设置，用于植物生长），在 24 °C 下 16 小时光循环。
      注:种子在一夜之间发芽，5天后发展出第一片真叶。真正的叶子是科蒂龙形成后的第一个血管叶。它有一个更皱纹的边缘，在 布拉西卡拉 被覆盖在三叶色。
3. 无菌卷心菜无菌测试
   注:要测试卷心菜是否无菌，请从每批中选择几（5~10）个卷心菜，然后盘出，以确定是否有可培养的菌落。
   1. 用消毒钳抓住植物底部并将其拉出，轻轻地将卷心菜从玻璃管中取出。在将卷心菜完全从管子中去除之前，使用消毒解剖剪刀小心切开根部。将卷心菜叶压缩成1.5 mL微离心管。
      注:较大的卷心菜可能需要去除一两个较大的叶子，而卷心菜仍然在管中，使卷心菜更容易进入1.5 mL微离心管。如果需要将卷心菜放入管中，这些较大的叶子可以添加到 1.5 mL 管中。
   2. 在每个 1.5 mL 微离库管中加入 400 μL 1x 磷酸盐缓冲液盐水 （PBS）。使用无菌的微虫，通过虫害30倍使卷心菜均质化。
   3. 板 100 μL 的卷心菜均质到加糖板上，以确定样品中是否存在任何污染物。在植物圈中发现的大多数细菌都会生长在大豆（TS）的阿加盘子里。当电镀卷心菜均质时，使用宽孔移液器尖端，因为卷心菜均质很厚，可以堵塞常规移液器尖端。

2. 用微生物溶液接种植物圈

1. 使接种菌株的甘油储存
   注 :表 1 列出了可用于此步骤的微生物分离物。这里也可以使用其他植物层分离物。
   1. 密集地从新的条纹中条纹出单个殖民地， 到同一介质的两 / 三个新板块上， 以获得许多殖民地。
   2. 让条纹生长2~5天，然后刮菌从所有板的菌落到含有15mL15%甘油的15mL锥形管，和涡流彻底混合。
   3. 将混合良好的甘油库存的1 mL等分转移到1.5 mL微离心管中，并在-80°C下储存甘油库存，直到使用。将剩余的 14 mL 甘油储存在 -80°C 下保存，因为接种卷心菜时需要相对大量的接种溶液。
   4. 使用前一周 在几个不同的稀释液（例如，10-4、10-5和10-6）的冰、稀释和板上解冻含有1 mL甘油储存（从步骤2.1.3）^-4的1.5 mL^管管，以确定14^-6mL接种溶液的浓度（形成单位[CFU]每μL）。
2. 消毒接种喷雾瓶
   1. 拆解琥珀色圆形波士顿泵瓶（59 mL），将所有部件（泵、管、盖和瓶）浸泡在30%漂白溶液中，在带紧密贴合盖的大型塑料容器中浸泡30分钟。
   2. 浸泡后，只需抬起容器盖的一角，小心地从容器中倒出所有漂白剂。
   3. 通过用自动洗脱水（根据容器大小，±1 L）对塑料容器进行冲洗，然后小心地倒出除尼水，再次在一角提起盖子。
   4. 使用 70% 乙醇溶液喷洒并打开紫外线 30 分钟，对生物安全柜进行消毒。
      注:在生物安全柜中继续这项工作，这样瓶子在风干时不会受到微生物污染的风险。
   5. 从大型塑料容器中取出瓶子，并使用移液器将每个瓶子装满自动洗脱水。重新组装泵，并在每个瓶子中放置一个泵。将去气化水泵过每个瓶子（每瓶10次喷雾），以去除瓶子泵组件中的漂白剂。
   6. 重复步骤 2.2.5 以确保从玻璃瓶中去除所有漂白剂。
   7. 通过在每个瓶子上放置一个数字（在瓶子完全干燥时将实验室胶带粘在瓶子侧面）上，测试瓶子是否无菌，然后在每个瓶子上加入 10 mL 的 1x PBS，并将 3 次喷雾泵送到 TS agar 板上。喷洒后，在室温下孵育板一周。如果任何菌落生长在盘子上，则表示相应的瓶子不是无菌的，不应用于实验。
   8. 在存放无菌瓶之前，请取出所有剩余的 PBS，让瓶子在生物安全柜中彻底干燥。将无菌瓶存放在无菌塑料容器中（通常是用于漂白瓶子的容器），直到使用。
3. 制备微生物孵化和喷洒无细菌卷心菜
   注意:所有步骤都应在生物安全柜中执行，因为喷洒气溶胶会污染工作表面或在实验室工作台上进行时造成健康风险。
   注:白菜将在5天后形成真正的叶子，因此建议在种植卷心菜后等待一周，然后再接种任何微生物溶液。由于管子是密封的，所以不需要给卷心菜浇水。实验最好在种植后一个月内进行，因为小管子会限制卷心菜的生长。
   1. 将甘油在冰上储存，在1x PBS中稀释至所需的接种浓度（在步骤2.1.4中通过解冻和电镀1 mL等分确定浓度）。
      注:可以使用多种不同的接种水平，但植物圈分离物可以在10天内从10⁴ 至10⁸ C4U/mL的卷心菜浆生长。
   2. 将 10 mL 稀释的甘油库存添加到无菌泵瓶中，并将 5 个喷雾泵泵入大型废物收集杯中，以去除瓶泵组件中残留的 PBS。
   3. 从卷心菜管上取下盖子，将卷心菜向喷雾瓶倾斜，然后用3个接种溶液泵喷洒每个卷心菜，提供±600μL的接种液。
   4. 接种后，收获一部分卷心菜，以评估实际输入的接种浓度。用消毒钳从管子上取出卷心菜。用无菌解剖剪刀切开根部，然后小心地将卷心菜放在预重无菌1.5 mL微离心管中。如果需要白菜的 CFP/g 计算，记录卷心菜的重量以进行将来的计算。
   5. 将 400 μL 的 1x PBS 添加到每个含有卷心菜的 1.5 mL 微离心管中，并使用无菌微壳虫将卷心菜均匀化到 1x PBS 中，研磨 30 倍。
   6. 稀释卷心菜均质（如果需要），并盘出被害的卷心菜混合物。使用宽孔尖端移液卷心菜浆，因为它会厚，充满了植物组织片。

3. 制备无菌蔬菜提取物

注:该方法是大白菜无菌介质生产的改版^{18、19。18,}

1. 从超市买卷心菜。在实验室中，取出并丢弃卷心菜的最外层叶子。切所有剩余的卷心菜，放入搅拌机和同质化卷心菜到细浆，即，卷心菜不会得到任何更精细的进一步混合。
   注:任何可以将卷心菜切成光滑均质纸浆的搅拌机应适合此方法。
2. 称量混合卷心菜均质，每克卷心菜加入2 mL的蒸馏水。通过两层篮子咖啡过滤器（未漂白的纸张）过滤混合卷心菜浆。
3. 将卷心菜浆分配到离心管中（尺寸取决于离心机）。将过滤的卷心菜浆以 20，000 x g 离心 20 分钟，直到大颗粒从溶液中沉淀出来。
   注:由于卷心菜颗粒会迅速堵塞过滤器消毒器，因此必须长时间使卷心菜浆离心。
4. 使用血清移液器，从颗粒卷心菜碎屑中去除上流液，注意不要打扰颗粒卷心菜。如果旨在重现使用标准盐浓度的发酵条件，请在此步骤（即滤芯灭菌前）添加 2% w/v NaCl。
5. 使用连接到真空的 0.2 μm 过滤器（500 mL 或 1 L）对蔬菜提取物进行灭菌。放入无菌管（50 mL离心管或15 mL离心管）中，并在-80°C下冷冻，直到使用。

4. 无菌蔬菜提取物的接种

1. 将 SVE 解冻并分配 490 μL 到 1.5 mL 微离心管中。使用足够的管子，每个时间点每个处理至少有五个复制，因为每次时间点测量都是破坏性的。
2. 在冰上分离微生物的甘油混合物，用1x PBS稀释至所需的浓度。乳酸菌的浓度可低至每ML的5，000CFU。为了达到这种浓度，将库存稀释至250 CU/μL，因为10μL将用于接种总体积为500μL。
3. 用 10 μL 的稀释微生物分离物接种 SVE。上下移液几次，以彻底混合。在所需温度下孵育（泡菜生产温度为14°C，最热酸菜发酵为24°C）。
4. 通过在第1天、第2天、第4天、第7天和第14天采集复制管，测量SVE中微生物分离物的生长速率。
   注:发酵在开始时会快速进行，并随着时间的推移而减慢。因此，拥有更多的初始时间点可以更解析发酵如何进行的动态。
5. 在每个时间点，混合接种的SVE井通过上下移液几次。连续稀释接种的 SVE 在 1x PBS 和板到阿加板。在计算菌落之前，孵育的加糖板4~7天。
   注:人，罗戈萨和夏普（MRS）的阿加应该用于列举所有的乳酸菌，酵母肽葡萄糖（YPD）应该用于酵母，TS加糖用于大多数其他细菌从植物圈分离。
6. 使用微 pH 探头在每个时间点记录样品的 pH 值。
   注:此步骤应在电镀后执行，因为 pH 探针将在管/处理之间转移细胞。

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结果

纳帕卷心菜的增长率
种子灭菌方法测试了几个不同的纳帕卷心菜（B. 拉帕瓦尔佩基尼斯; 补充图1）来自多个不同供应商，且增长率一直持续。然而，用不同种类的布拉西 卡测试 方法（B. 拉帕: 萝卜紫顶; B. 奥莱拉西亚: 开罗杂交， 热带巨人杂交; B. 露营者: 朴崔玩具崔混合; B. juncea: 芥末红巨人） 给有限?...

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讨论

无细菌的纳帕卷心菜植物已被用来研究纳帕卷心菜植物圈17中乳酸菌的分散^性限制。无细菌的纳帕卷心菜也可以用来测试植物圈中的个体或成对生长（图1）。对三种不同品种的卷心菜进行了无菌蔬菜提取物的制作方法:红、绿、纳帕三种。每个 SVES 都充当可靠的增长介质;接种的微生物在不同的介质中持续生长。SVE的单株增长率（图2）?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	20170-650
15 mL conical tubes	Falcon	352096
7-way tray tray	Sigma Magenta	T8654
Amber Round Boston Glass Bottle		GPS 712OZSPPK12BR	Ordered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filters	If you care		(unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free)	Austin's	50-010-45
Borosilicate Glass tubes	VWR	47729-586
Calcined clay	Turface	MVP	Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blender	Cuisinart		Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors	7-389-A	American Educational Products	Ordered on Amazon.com
Ethanol	VWR	89125-172
Forceps	Aven	18434	Ordered on Amazon.com
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5
KleenGuard M10	Kimberley-Clark	64240
Large plastic container	Rubbermaid		Ordered on Amazon.com
Light racks	Gardner's Supply	39-357	full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way caps	Millipore Sigma	C1934
Man, Rogosa, and Sharpe	Fisher Scientific	DF0881-17-5	This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probe	Thermo Scientific	8220BNWP
Micropestle	Carolina	215828	Also called Pellet Pestle
MS nutrient broth	Millipore Sigma	M5519	Murashige and Skoog Basal Medium
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
Napa cabbage seeds	Johnny's Select Seeds	2814G	B. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Used to make agar plates
Phosphate buffer saline	Fisher Scientific	50-842-941	Teknova
Plant tissue culture box	Sigma	Magenta GA-7
Serologial pipettes	VWR	89130-900
Sterile dowel	Puritan	10805-018	Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filter	Nalgene	974103
Tryptic soy agar	Fisher Scientific	DF0370-17-3	This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tips	Rainin	17007102
Yeast, peptone and dextrose	Fisher Scientific	DF0428-17-5	This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates