Un sistema gnotobiotico per studiare l'assemblaggio del microbioma nella Phyllosphere e nella fermentazione vegetale

Riepilogo

È stato sviluppato un metodo per coltivare cavoli Napa privi di germi che consente ai ricercatori di valutare come singole specie microbiche o comunità microbiche multispecie interagiscono sulle superfici delle foglie di cavolo. Viene inoltre presentato un estratto vegetale sterile che può essere utilizzato per misurare i cambiamenti nella composizione della comunità durante la fermentazione vegetale.

Abstract

La fillosfera, la parte sotterranea della pianta che può essere colonizzata dai microbi, è un utile sistema modello per identificare i processi di assemblaggio della comunità microbica. Questo protocollo delinea un sistema per studiare le dinamiche della comunità microbica nella filosfera delle piante di cavolo Napa. Descrive come coltivare piante prive di germi in provette con un substrato di brodo di argilla e nutrienti. L'inoculazione di piante prive di germi con colture microbiche specifiche offre l'opportunità di misurare la crescita microbica e le dinamiche della comunità nella fillosfera. Attraverso l'uso di estratto vegetale sterile prodotto da cavoli si sposta nelle comunità microbiche che si verificano durante la fermentazione può anche essere valutato. Questo sistema è relativamente semplice ed economico da configurare in laboratorio e può essere utilizzato per affrontare le principali questioni ecologiche nell'assemblaggio della comunità microbica. Fornisce inoltre l'opportunità di capire in che modo la composizione della comunità della fillosfera può influire sulla diversità microbica e sulla qualità delle fermentazioni vegetali. Questo approccio per lo sviluppo di comunità di filosfera gnotobiotica potrebbe essere applicato ad altre specie vegetali selvatiche e agricole.

Introduzione

La diversità microbica della fillosfera svolge un ruolo importante nel mantenimento della salute delle piante e può anche influenzare la capacità delle piante di resistere allo stress ambientale^1,2,3,4,5. A sua volta, la salute delle colture influisce direttamente sulla sicurezza alimentare e sulla qualità^6,7. Le piante svolgono un ruolo nel funzionamento dell'ecosistema e i microbiomi associati influenzano entrambi la capacità delle piante di svolgere queste attività, sia influenzando direttamente l'ambiente stesso⁸. Mentre gli scienziati hanno iniziato a decifrare la funzione e la composizione della fillosfera, i processi ecologici che influenzano l'assemblaggio della comunità microbica della fillosfera non sono pienamente compresi^9,10. Il microbioma della fillosfera è un ottimo sistema sperimentale per studiare l'ecologia dei microbiomi¹¹. Queste comunità sono relativamente semplici e molti dei membri della comunità possono essere coltivati su^supportidi laboratorio standard 10^,12,13.

Le verdure fermentate sono un sistema in cui la struttura comunitaria della fillosfera ha conseguenze importanti. Sia nei crauti che nei kimchi, i microbi che si verificano naturalmente sulle foglie vegetali (la filosfera delle specie di Ottone) servono come inoculum per la fermentazione^14,15. I batteri dell'acido lattico (LAB) sono considerati membri onnipresenti di microbiomi vegetali, tuttavia possono essere in bassa abbondanza nella fillosfera¹⁶. Una forte selezione abiotica durante la fermentazione favorisce uno spostamento nella composizione della comunità microbica che consente ai batteri dell'acido lattico di aumentare in abbondanza. Man mano che LAB cresce, producono acido lattico che crea l'ambiente acido dei prodotti vegetali fermentati¹⁷. Il legame tra la fillosfera e il fermento offre l'opportunità di utilizzare le verdure come modello per capire come sono strutturati i microbiomi.

Abbiamo sviluppato metodi per coltivare cavoli Napa privi di germi e per inocularli con specifiche comunità microbiche utilizzando bottiglie spray. Questo è un metodo economico e affidabile per inoculare uniformemente il cavolo con microbi individuali o comunità miste. Un estratto vegetale sterile (SVE) è stato sviluppato anche da tre diversi tipi di cavolo/varietà: cavolo rosso e verde (Brassica oleracea) e cavolo Napa (B. rapa). L'aggiunta di sale a queste SVI replica l'ambiente di fermentazione e consente studi sperimentali su piccola scala e relativamente ad alto velocità possibile di assemblaggio del microbioma di fermentazione. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare l'assemblaggio della comunità microbica nella fillosfera e come le dinamiche della comunità microbica nella fillosfera possono essere collegate al successo della fermentazione vegetale.

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Protocollo

1. Cavoli senza germi in crescita

1. Preparazione di attrezzature per la crescita di cavoli senza germi
   1. Pulizia dell'argilla calcificata per rimuovere le particelle di polvere fine
      1. Risciacquare l'argilla calcinata (Tabella dei materiali) almeno 3x con acqua del rubinetto; drenare l'acqua.
         AVVISO: L'argilla calciata produce polveri molto sottili e si consiglia di indossare una maschera protettiva (Tabella dei materiali) durante il lavaggio.
      2. Stendere l'argilla calciata come uno strato sottile (4 cm) in un vassoio autoclave e autoclave su un ciclo asciutto (121 gradi centigradi per 20 min e 20 min tempo di essiccazione sterile) per
      3. Lasciare asciugare completamente l'argilla calcina prima dell'uso stendendosi su vassoi e mettendoin un'incubatrice calda (30-37 gradi centigradi) per almeno una settimana. Mescolare per mescolare ogni 3 giorni per asciugare completamente l'argilla calcinata in modo che assorba una quantità uniforme di brodo nutriente Divietto e Skoog (MS) (sezione 1.2).
         NOTA: L'essiccazione aiuta anche a mantenere il volume di argilla calciata anche quando viene pesata in tubi. Anche l'essiccazione con altri mezzi, come un forno di essiccazione, sarebbe adatta.
   2. Pulizia della vetreria per la coltivazione di cavoli senza germi
      1. Pulire e sterilizzare accuratamente i tubi di vetro (Tabella dei materiali) tra ogni utilizzo. Immergere i tubi per 30 min nella soluzione di candeggina 30% e risciacquare bene con acqua del rubinetto prima di pulire in un lavaggio acido su un ambiente batteriologia. Tappi di provetta a doppio lavaggio acidi (Tabella dei materiali) tra gli usi.
   3. Semi di cavolo sterilizzanti per la superficie
      1. Mettere fino a 100 semi di cavolo Napa (B. rapa var pekinensis) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
         NOTA: L'aggiunta di più di 100 semi a un tubo di microcentrifuga o la modifica delle dimensioni del tubo può influenzare i tassi di germinazione dei semi a causa della mancanza di rimozione del mantello di semi.
      2. Aggiungere 1 mL di 70% di etanolo ai semi e vortice per 5 min. Scartare l'etanolo con una pipetta.
      3. Aggiungere 1 mL di 50% candeggina e vortice per 5 min. Scartare la soluzione di candeggina utilizzando una pipetta.
      4. Aggiungere 1 mL di acqua e vortice autoclaved deionizzato e vortice per 5 min. Scartare l'acqua deionizzata utilizzando una pipetta.
      5. Ripetere il passaggio 1.1.3.4 3x per risciacquare tutta la candeggina. Immergere i semi in acqua sterile deionizzata per 2/8 h prima di piantare per ammorbidire il mantello del seme.
2. Cavoli senza germi in crescita
   NOTA: i cavoli napa (B. rapa var pekinensis) sono coltivati in tubi di vetro (15 cm x 2,5 cm) contenenti argilla calcificata imbevuta di Murashige e Skoog (MS) brodo nutritivo (Figura 1).
   1. Pesare 10 g di argilla calcina pulita in un tubo di vetro pulito (15 cm x 2,5 cm).
   2. Preparare il brodo nutritivo MS sciogliendo 4,4 g di mezzo MS in 1 L di acqua deionizzata. Aggiungete il brodo nutriente MS (9 mL) ad ogni tubo di vetro per coprire l'argilla calcinata utilizzando una pipetta.
      NOTA: Il liquido permanente nel tubo impedirà al seme di germinare, quindi potrebbe esserenecessario aggiungere un po 'meno brodo MS ad alcuni tubi.
   3. Tubi di vetro a cappuccio libero con tappi di provetta bidirezionali da 22 mm e autoclave (121 gradi centigradi per 60 min). Quando li rimuove dall'autoclave, spingere i tappi sui tubi di vetro per sigillarli. Raffreddare i tubi a temperatura ambiente prima dell'uso.
   4. Posizionare delicatamente un seme di cavolo sterile al centro di ogni tubo utilizzando pinze sterili e extra-lunghe (25,4 cm). Posizionare i tubi in un vassoio a 7 vie quindi posizionarli sotto i rack luminosi (lampadine fluorescenti T5 a spettro pieno o altre impostazioni di illuminazione per la crescita delle piante) con un ciclo di luce di 16 h a 24 .
      NOTA: I semi germinano durante la notte e sviluppano la loro prima vera foglia dopo 5 giorni. Una vera foglia è la prima foglia vascolare dopo che i cotiledoni si sono formati. Ha un bordo più rugoso e in Brassica rapa è coperto di tricomi.
3. Test per la sterilità dei cavoli privi di germi
   NOTA: per verificare se i cavoli sono privi di germi, selezionare alcuni (5-10) cavoli da ogni lotto e scegliere se sono presenti colonie di cultura.
   1. Rimuovere delicatamente il cavolo dai tubi di vetro afferrando la base della pianta con pinze sterilizzate ed estraendola. Prima di rimuovere completamente il cavolo dal tubo, tagliare con attenzione le radici utilizzando forbici sterilizzate. Compattare le foglie di cavolo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
      NOTA: i cavoli più grandi potrebbero richiedere la rimozione di una o due delle foglie più grandi mentre il cavolo è ancora nel tubo per rendere più facile ottenere il cavolo nel tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Queste foglie più grandi possono essere aggiunte al tubo da 1,5 mL dopo che il resto del cavolo è stato inserito nel tubo se è necessario l'intero cavolo.
   2. Aggiungere 400 lofani di 1x 1x di salina da cuscinetto fosfato (PBS) ad ogni tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Utilizzando un micropestle sterile, omogeneizzare il cavolo da pestlare 30x.
   3. Piastra 100 L del cavolo omogeneo su piastre di agar per determinare se ci sono contaminanti presenti nel campione. La maggior parte dei batteri trovati nella fillosfera crescerà su piastre di soia a tritarie (TS). Utilizzare punte di pipetta orifice largo durante la placcatura cavolo omogeneo come l'omogeneizzato cavolo è spesso e può ostiare le punte pipette regolari.

2. Inoculare la fillosfera con soluzioni microbiche

1. Fare scorte di glicerolo di ceppi di inoculazione
   NOTA: la Tabella 1 elenca gli isolati microbici che possono essere utilizzati in questo passaggio. Altri isolati di phyllosphere potrebbero essere utilizzati anche qui.
   1. Densamente sfrecciare fuori singole colonie da una striscia fresca, su due/tre nuove piastre dello stesso supporto per ottenere molte colonie.
   2. Lascia che le striature crescano per 2-5 giorni, poi raschia colonie da tutte le piastre in un tubo conico di 15 mL contenente 15 mL del 15% di glicerolo, e vortice per mescolare accuratamente.
   3. Trasferire un'aliquota di 1 mL dello stock di glicerolo ben miscelato in un tubo di microcentrifuga di 1,5 ml e conservare le scorte di glicerolo a -80 gradi centigradi fino all'uso. Conservare i restanti 14 mL di brodo di glicerolo a -80 gradi centigradi, poiché sono necessari volumi relativamente grandi di soluzione di inoculazione durante l'inoculazione dei cavoli.
   4. Una settimana prima dell'uso, scongelare il tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di brodo di glicerolo (dal punto 2.1.3) su ghiaccio, diluire e piastra a diverse diluizioni (ad esempio, 10^-4, 10^-5e 10^-6)per determinare la concentrazione (unità di formazione della colonia [CFU] per soluzione di inocL.
2. Sterilizzare le bottiglie spray per l'inoculazione
   1. Smontare le bottiglie di pompaggio ambrate di Boston (59 mL) e immergere tutti i componenti (pompa, tubo, tappo e bottiglia) in soluzione di candeggina 30% per 30 min in un grande contenitore di plastica con un coperchio strettamente adatto.
   2. Dopo l'ammollo, versare con attenzione tutta la candeggina dal contenitore sollevando un solo angolo del coperchio del contenitore.
   3. Sciacquare le bottiglie riempiendo il contenitore di plastica con acqua autoclaved dionizzata (1 L a seconda delle dimensioni del contenitore) e versare con attenzione l'acqua deionizzata, ancora una volta sollevando il coperchio ad un angolo.
   4. Sterilizzare un armadio di biosicurezza spruzzando con soluzione di etanolo al 70% e accendendo la luce UV per 30 min.
      NOTA: Continuare questo lavoro nell'armadio di biosicurezza in modo che non vi sia alcun rischio di contaminazione microbica delle bottiglie mentre si asciugano l'aria.
   5. Rimuovere le bottiglie dal grande contenitore di plastica e riempire ogni bottiglia con acqua autoclaved deionizzata utilizzando una pipetta. Rimontare le pompe e posizionarne una in ogni bottiglia. Pompare l'acqua deionizzata attraverso ogni bottiglia (10 spray per bottiglia) per rimuovere la candeggina dal componente pompa della bottiglia.
   6. Ripetere il passaggio 2.2.5 per assicurarsi che tutta la candeggina venga rimossa dalle bottiglie di vetro.
   7. Verificare se le bottiglie sono sterili posizionando un numero su ogni bottiglia (attaccando il nastro da laboratorio sul lato della bottiglia quando è completamente asciutto) quindi aggiungere 10 mL di 1x PBS a ciascuna delle bottiglie e pompare 3 spray su una piastra di agar TS. Dopo l'irrorazione, incubare le piastre per una settimana a temperatura ambiente. Se le colonie crescono su un piatto indica che la rispettiva bottiglia non era sterile e non deve essere utilizzata per esperimenti.
   8. Prima di conservare le bottiglie sterili, rimuovere tutti i PBS rimanenti e lasciare asciugare accuratamente le bottiglie nell'armadio di biosicurezza. Conservare le bottiglie sterili in un contenitore di plastica sterile (in genere il contenitore utilizzato per sbiancare le bottiglie) fino all'uso.
3. Preparazione dell'inoculo microbico e spruzzo di cavoli privi di germi
   AVVISO: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in un armadio di biosicurezza, come irrorazione aerosolizza le soluzioni microbiche che potrebbero contaminare le superfici di lavoro o rappresentare un rischio per la salute se effettuate su un banco di laboratorio.
   NOTA: I cavoli formeranno foglie vere dopo 5 giorni, quindi è consigliabile attendere una settimana dopo aver piantato il cavolo prima di inoculare con qualsiasi soluzione microbica. Poiché i tubi sono sigillati, non c'è bisogno di innaffiare i cavoli. Gli esperimenti sono meglio eseguiti entro un mese dalla semina, in quanto i piccoli tubi limitano la crescita del cavolo.
   1. Scongelare glicerolo sul ghiaccio e diluire in 1x PBS alla concentrazione di inoculazione desiderata (concentrazione determinata dallo scongelamento e dalla placcatura di un 1 mL nel passaggio 2.1.4).
      NOTA: È possibile utilizzare una varietà di diversi livelli di inoculazione, ma gli isolati di fillosfera possono crescere da 10⁴ a 10⁸ CFU/mL di liquami di cavolo in 10 giorni.
   2. Aggiungere 10 mL di brodo di glicerolo diluito alla bottiglia sterile della pompa e pompare 5 spruzzi in un grande becher di raccolta dei rifiuti per rimuovere qualsiasi PBS residuo dal componente della pompa della bottiglia.
   3. Togliere il coperchio dal tubo del cavolo, inclinare il cavolo verso la bottiglia spray e spruzzare ogni cavolo con 3 pompe della soluzione di inoculazione, che fornisce 600 dollari lof inoculum.
   4. Dopo l'inoculazione, raccogliere un sottoinsieme dei cavoli per valutare la concentrazione di inoculazione effettiva dell'input. Rimuovere il cavolo da un tubo con pinze sterilizzate. Tagliare le radici con feccia sterile di scarico e quindi posizionare con cura il cavolo in un tubo di microcentrifuga sterile prepesato da 1,5 mL. Registrare il peso del cavolo per i calcoli futuri se Per i calcoli sono necessari CSU/g di cavolo.
   5. Aggiungere 400 luna di 1x PBS ad ogni tubo di microcentrifuga da 1,5 ml contenente cavolo e utilizzare un micropestle sterile per omogeneizzare il cavolo nel 1x PBS macinandolo 30x.
   6. Diluire cavolo omogeneo (se necessario) e piastrare la miscela di cavolo pested. Utilizzare punte di orifice larghe per pipettare i liquami di cavolo perché sarà spesso e pieno di pezzi di tessuto vegetale.

3. Preparazione dell'estratto di verdura sterile

NOTA: Questo metodo è una versione modificata della produzione di supporti sterili di cavolo^18,19.

1. Acquistare un cavolo da un supermercato. In laboratorio, rimuovere e scartare le foglie più esterne del cavolo. Tritare tutto il cavolo rimanente per adattarsi a un frullatore e omogeneizzare il cavolo ad una polpa fine, cioè, il cavolo non otterrà alcuna fine con ulteriore miscelazione.
   NOTA: Qualsiasi frullatore in grado di tritare il cavolo a una polpa omogenea liscia dovrebbe essere adatto a questo metodo.
2. Pesare l'omogenea del cavolo miscelato e aggiungere 2 mL di acqua distillata per grammo di cavolo. Filtrare i liquami di cavolo miscelato attraverso 2 strati di filtri per caffè a cesto (carta non sbiancata).
3. Distribuisci il liquame del cavolo in tubi centrifuga (la dimensione dipende dalla centrifuga). Centrifugare il liquame di cavolo filtrato a 20.000 x g per 20 min fino a quando grandi particelle si stabiliscono fuori soluzione.
   NOTA: È essenziale centrifugare il liquame del cavolo per un lungo periodo di tempo, poiché le particelle di cavolo intasano rapidamente lo sterilizzatore del filtro.
4. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere il supernatante dai detriti di cavolo pelleta avendo cura di non disturbare il cavolo pelletto. Se si mira a ricreare condizioni di fermentazione in cui vengono utilizzate concentrazioni standard di sale, aggiungere il 2% w/v NaCl in questa fase (cioè prima della sterilizzazione del filtro).
5. Filtro sterilizzare l'estratto vegetale utilizzando un filtro di 0,2 m (500 mL o 1 L) attaccato a un vuoto. Distribuisci in tubi sterili (o tubi di centrifuga 50 mL o tubi di centrifuga di 15 mL) e congelati a -80 gradi fino all'uso.

4. Inoculazione dell'estratto vegetale sterile

1. Scongelare sartiame svelto e erogare 490 gradi l in tubi di microcentrifuga da 1,5 ml. Utilizzare tubi sufficienti per avere almeno cinque repliche per trattamento per punto temporale poiché ogni misurazione del punto temporale è distruttiva.
2. Scongelare glicerolo di isolati microbici sul ghiaccio e diluire con 1x PBS alla concentrazione desiderata. La concentrazione di batteri dell'acido lattico può essere a partire da 5.000 CFU per mL di SVE. Per raggiungere questa concentrazione, diluire gli stock a 250 CCU/L perché per l'inoculazione di un volume totale di 500 gradi centigradi.
3. SVE inoculata con 10 gradi di isolare microbico diluito. Pipette su e giù un paio di volte per mescolare a fondo. Incubare alla temperatura desiderata (14 gradi per la temperatura di produzione del kimchi o 24 gradi centigradi per la fermentazione dei crauti più caldi).
4. Misurare il tasso di crescita dell'isolamento microbico nella SVE raccogliendo i tubi replicati il giorno 1, giorno 2, giorno 4, giorno 7 e giorno 14.
   NOTA: La fermentazione procede rapidamente all'inizio e rallenta nel tempo. Pertanto, avere più tempi iniziali dà una maggiore risoluzione alla dinamica di come procede la fermentazione.
5. Ad ogni punto temporale, mescolare bene la SVE inoculata pipettando su e giù un paio di volte. Diluire serialmente l'SVE inoculato in 1x PBS e la piastra sulle piastre di agar. Incubale le piastre di agar per 4-7 giorni prima di contare le colonie.
   NOTA: L'agar Man, Rogosa e Sharpe (MRS) deve essere usato per enumerare tutti i batteri dell'acido lattico, il peptone di lievito dextrose (YPD) deve essere usato per il lievito e l'agar TS per la maggior parte degli altri batteri si isola dalla fillosfera.
6. Registrare il pH dei campioni ad ogni momento utilizzando una sonda micro pH.
   NOTA: Questo passaggio deve essere effettuato dopo la placcatura perché la sonda del pH trasferirà le cellule tra tubi / trattamenti.

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Risultati

Tassi di crescita dei cavoli di Napa
Il metodo di sterilizzazione dei semi è stato testato con diversi cavoli Napa (B. rapa var pekinese; Figura supplementare 1) da un certo numero di fornitori diversi e tutti sono cresciuti costantemente con tassi di crescita simili. Tuttavia, testare i metodi con diverse specie di Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestr...

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Discussione

Le piante di cavolo Napa prive di germi sono state utilizzate per studiare la limitazione della dispersione dei batteri dell'acido lattico nella fillosfera del cavolo di Napa¹⁷. I cavoli Napa privi di germi possono anche essere utilizzati per testare la crescita individuale o a coppie nella fillosfera (Figura 1). I metodi per la produzione di estratto vegetale sterile sono stati testati per tre diverse varietà di cavolo: rosso, verde e Napa. Ognuna di queste SVI agis...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	20170-650
15 mL conical tubes	Falcon	352096
7-way tray tray	Sigma Magenta	T8654
Amber Round Boston Glass Bottle		GPS 712OZSPPK12BR	Ordered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filters	If you care		(unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free)	Austin's	50-010-45
Borosilicate Glass tubes	VWR	47729-586
Calcined clay	Turface	MVP	Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blender	Cuisinart		Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors	7-389-A	American Educational Products	Ordered on Amazon.com
Ethanol	VWR	89125-172
Forceps	Aven	18434	Ordered on Amazon.com
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5
KleenGuard M10	Kimberley-Clark	64240
Large plastic container	Rubbermaid		Ordered on Amazon.com
Light racks	Gardner's Supply	39-357	full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way caps	Millipore Sigma	C1934
Man, Rogosa, and Sharpe	Fisher Scientific	DF0881-17-5	This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probe	Thermo Scientific	8220BNWP
Micropestle	Carolina	215828	Also called Pellet Pestle
MS nutrient broth	Millipore Sigma	M5519	Murashige and Skoog Basal Medium
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
Napa cabbage seeds	Johnny's Select Seeds	2814G	B. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Used to make agar plates
Phosphate buffer saline	Fisher Scientific	50-842-941	Teknova
Plant tissue culture box	Sigma	Magenta GA-7
Serologial pipettes	VWR	89130-900
Sterile dowel	Puritan	10805-018	Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filter	Nalgene	974103
Tryptic soy agar	Fisher Scientific	DF0370-17-3	This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tips	Rainin	17007102
Yeast, peptone and dextrose	Fisher Scientific	DF0428-17-5	This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates