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Résumé

Une méthode de culture de choux Napa sans germes a été mise au point qui permet aux chercheurs d’évaluer comment les espèces microbiennes uniques ou les communautés microbiennes multi-espèces interagissent sur les surfaces des feuilles de chou. Un extrait de légume stérile est également présenté qui peut être utilisé pour mesurer les changements dans la composition communautaire pendant la fermentation végétale.

Résumé

La phyllosphère, la partie au-dessus du sol de la plante qui peut être colonisée par des microbes, est un système modèle utile pour identifier les processus d’assemblage de la communauté microbienne. Ce protocole décrit un système d’étude de la dynamique des communautés microbiennes dans la phyllosphère des plants de choux de Napa. Il décrit comment cultiver des plantes exemptes de germes dans des tubes à essai avec un substrat d’argile calcinée et de bouillon nutritif. L’inoculation de plantes exemptes de germes ayant des cultures microbiennes spécifiques offre des possibilités de mesurer la croissance microbienne et la dynamique communautaire dans la phyllosphère. Grâce à l’utilisation d’extrait de légumes stériles produits à partir de choux, les changements dans les communautés microbiennes qui se produisent pendant la fermentation peuvent également être évalués. Ce système est relativement simple et peu coûteux à mettre en place en laboratoire et peut être utilisé pour répondre à des questions écologiques clés dans l’assemblage de la communauté microbienne. Il offre également des occasions de comprendre comment la composition de la communauté phyllosphère peut avoir un impact sur la diversité microbienne et la qualité des fermentations végétales. Cette approche pour le développement de communautés phyllosphère de chou gnotobiotique pourrait être appliquée à d’autres espèces végétales sauvages et agricoles.

Introduction

La diversité microbienne de la phyllosphère joue un rôle important dans le maintien de la santé des plantes et peut également influencer la capacité des plantes à résister au stress environnemental1,2,3,4,5. À son tour, la santé des cultures a un impact direct sur la salubrité et la qualité des aliments6,7. Les plantes jouent un rôle dans le fonctionnement de l’écosystème et leurs microbiomes associés affectent à la fois la capacité des plantes à mener à bien ces activités ainsi que d’influencer directement l’environnement eux-mêmes8. Alors que les scientifiques ont commencé à déchiffrer la fonction et la composition de la phyllosphère, les processus écologiques qui influencent l’assemblage de la communauté microbienne phyllosphère ne sont pas pleinement compris9,10. Le microbiome de phyllosphère est un excellent système expérimental pour étudier l’écologie des microbiomes11. Ces communautés sont relativement simples et bon nombre des membres de la communauté peuvent être cultivés sur les médias de laboratoire standard10,12,13.

Les légumes fermentés sont un système où la structure communautaire de la phyllosphère a des conséquences importantes. Dans la choucroute et le kimchi, les microbes qui se trouvent naturellement sur les feuilles végétales (la phyllosphère des espèces de Brassica) sert d’inoculum pour la fermentation14,15. Les bactéries lactiques (LAB) sont considérées comme des membres omniprésents des microbiomes végétaux, mais elles peuvent être en faible abondance dans la phyllosphère16. Une forte sélection abiotique pendant la fermentation entraîne un changement dans la composition de la communauté microbienne permettant aux bactéries lactiques d’augmenter en abondance. Au fur et à mesure que LAB se développe, ils produisent de l’acide lactique qui crée l’environnement acide des produits végétaux fermentés17. Le lien entre la phyllosphère et le ferment offre l’occasion d’utiliser les légumes comme modèle pour comprendre comment les microbiomes sont structurés.

Nous avons mis au point des méthodes pour cultiver des choux Napa exempts de germes et les inoculer avec des communautés microbiennes spécifiques à l’aide de bouteilles de pulvérisation. Il s’agit d’une méthode peu coûteuse et fiable d’inoculer uniformément le chou avec des microbes individuels ou des communautés mixtes. Un extrait de légumes stériles (SVE) a également été développé à partir de trois types de choux différents / variétés: chou rouge et vert (Brassica oleracea) et chou Napa (B. rapa). L’ajout de sel à ces SVE reproduit l’environnement de fermentation et permet des études expérimentales à petite échelle et à débit relativement élevé de l’assemblage du microbiome de fermentation. Ces méthodes peuvent être utilisées pour étudier l’assemblage de la communauté microbienne dans la phyllosphère et comment la dynamique de la communauté microbienne dans la phyllosphère peut être liée au succès de la fermentation végétale.

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Protocole

1. Cultiver des choux sans germes

  1. Préparation de l’équipement pour la culture de choux sans germes
    1. Nettoyage de l’argile calcinée pour éliminer les particules fines de poussière
      1. Rincer l’argile calcinée (Table des matériaux)au moins 3x avec l’eau du robinet; égoutter l’eau.
        ATTENTION : L’argile calcinée produit de la poussière très fine et il est recommandé de porter un masque protecteur (Table des matériaux)lors du lavage.
      2. Étendre l’argile calcinée en couche mince (~4 cm) dans un plateau autoclave et autoclave sur un cycle sec (chauffage à 121 °C pendant 20 min et 20 min de temps de séchage) pour stériliser.
      3. Laisser sécher complètement l’argile calcinée avant d’être utilisée en s’étalant sur des plateaux et en les plaçant dans un incubateur chaud (30−37 °C) pendant au moins une semaine. Remuer pour mélanger tous les 3 jours pour sécher complètement l’argile calcinée afin qu’elle absorbe une quantité égale de bouillon nutritif murashige et skoog (MS) (section 1.2).
        REMARQUE : Le séchage aide également à conserver le volume d’argile calcinée même lorsqu’elle est pesée dans des tubes. Le séchage par d’autres moyens, comme un four à séchage, serait également approprié.
    2. Nettoyage de la verrerie pour la culture de choux sans germes
      1. Nettoyer et stériliser soigneusement les tubes de verre (Table des Matériaux)entre chaque utilisation. Tremper les tubes pendant 30 min dans une solution d’eau de Javel à 30 % et bien rincer à l’eau du robinet avant de les nettoyer dans un lavage à l’acide dans un réglage de bactériologie. Bouchons à éprouvez-essai à lavage àl’acide (tableau des matériaux)entre les utilisations.
    3. Graines de chou stérilisantes de surface
      1. Placer jusqu’à 100 graines de chou Napa (B. rapa var pekinensis)dans un tube de microcentrifuge de 1,5 m L.
        REMARQUE : L’ajout de plus de 100 graines à un tube de microcentrifuge ou le changement de la taille du tube peut affecter les taux de germination des graines en raison du manque d’enlèvement de la couche de graines.
      2. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % aux graines et vortex pendant 5 min. Jeter l’éthanol à l’aide d’une pipette.
      3. Ajouter 1 mL de 50% d’eau de Javel et vortex pendant 5 min. Jeter la solution d’eau de Javel à l’aide d’une pipette.
      4. Ajouter 1 mL d’eau déionisée autoclaved et vortex pendant 5 min. Jeter l’eau déionisée à l’aide d’une pipette.
      5. Répétez l’étape 1.1.3.4 3x pour rincer toute l’eau de Javel. Faire tremper les graines dans de l’eau déionisée stérile pendant 2 à 8 h avant la plantation pour adoucir le manteau de graines.
  2. Cultiver des choux sans germes
    REMARQUE : Les choux napa (B. rapa var pekinensis) sont cultivés dans des tubes en verre (15 cm x 2,5 cm) contenant de l’argile calcinée trempée dans le bouillon nutritif de Murashige et Skoog (MS) (figure 1).
    1. Peser 10 g d’argile calcinée propre dans un tube de verre propre (15 cm x 2,5 cm).
    2. Préparer le bouillon nutritif de SP en dissolvant 4,4 g de MS moyen dans 1 L d’eau déionisée. Ajouter le bouillon nutritif de SP (~9 ml) à chaque tube de verre pour couvrir l’argile calcinée à l’aide d’une pipette.
      REMARQUE : Le liquide debout dans le tube empêchera la graine de germer de sorte qu’il pourrait être nécessaire d’ajouter un peu moins de bouillon de SP à certains tubes.
    3. Tubes en verre à capuchon lâche avec bouchons bidirectionniques de 22 mm et autoclave (121 °C pendant 60 min). Lorsque vous les retirez de l’autoclave, poussez les bouchons sur les tubes de verre pour les sceller. Refroidir les tubes à température ambiante avant utilisation.
    4. Placez délicatement une graine de chou stérile au centre de chaque tube à l’aide de forceps stériles et extra-longs (25,4 cm). Placez les tubes dans un plateau à 7 voies puis placez-les sous des supports lumineux (ampoules fluorescentes T5 à spectre complet ou autre configuration d’éclairage pour la croissance des plantes) avec un cycle de lumière de 16 h à 24 °C.
      REMARQUE : Les graines germent pendant la nuit et développent leur première vraie feuille après 5 jours. Une vraie feuille est la première feuille vasculaire après la formation des cotylédons. Il a un bord plus ridé et dans Brassica rapa est couvert de trichomes.
  3. Test de stérilité des choux sans germes
    REMARQUE : Pour vérifier si les choux sont exempts de germes, sélectionnez quelques choux (5−10) de chaque lot et sortez une assiette pour déterminer si des colonies cultivables sont présentes.
    1. Retirez délicatement le chou des tubes de verre en saisissant la base de la plante avec des forceps stérilisés et en le tirant. Avant d’enlever complètement le chou du tube, couper soigneusement les racines à l’aide de ciseaux de dissection stérilisés. Compacter les feuilles de chou en un tube de microcentrifuge de 1,5 m L.
      REMARQUE : Les choux plus gros peuvent nécessiter d’enlever une ou deux des plus grandes feuilles pendant que le chou est encore dans le tube pour faciliter l’accès au chou dans le tube de microcentrifuge de 1,5 m L. Ces feuilles plus grandes peuvent être ajoutées au tube de 1,5 mL après que le reste du chou a été placé dans le tube si le chou entier est nécessaire.
    2. Ajouter 400 μL de saline tampon de phosphate de 1x (PBS) à chaque tube de microcentrifuge de 1,5 m L. À l’aide d’un micropestle stérile, homogénéiser le chou en harcelant 30x.
    3. Plaquez 100 μL de l’homogénéité du chou sur les plaques d’agar afin de déterminer s’il y a des contaminants présents dans l’échantillon. La plupart des bactéries présentes dans la phyllosphère se développeront sur des plaques d’agar de soja tryptique (TS). Utilisez de larges pointes de pipette d’orifice lors du placage de l’homogénéité du chou car l’homogénéité du chou est épaisse et peut obstruer les pointes régulières de pipette.

2. Inoculer la phyllosphère avec des solutions microbiennes

  1. Fabrication de stocks de glycérol de souches d’inoculation
    REMARQUE : Le tableau 1 répertorie les isolats microbiens qui peuvent être utilisés à cette étape. D’autres isolats de phyllosphère pourraient également être utilisés ici.
    1. Densement stries colonies individuelles d’une nouvelle strie, sur deux / trois nouvelles plaques des mêmes médias pour obtenir de nombreuses colonies.
    2. Laissez les stries se développer pendant 2−5 jours, puis gratter les colonies de toutes les plaques dans un tube conique de 15 mL contenant 15 ml de glycérol à 15 %, et vortex pour bien mélanger.
    3. Transférer un aliquot de 1 ml du bouillon de glycérol bien mélangé dans un tube de microcentrifuge de 1,5 m L et stocker les stocks de glycérol à -80 °C jusqu’à l’utilisation. Conservez les 14 mL restants de bouillon de glycérol à -80 °C car des volumes relativement importants de solution d’inoculation sont nécessaires lors de l’inoculation des choux.
    4. Une semaine avant l’utilisation, décongeler le tube de 1,5 m LL contenant 1 ml de glycérol (à partir de l’étape 2.1.3) sur la glace, diluer et plaquer à plusieurs dilutions différentes (p. ex., 10-4, 10-5et 10-6) pour déterminer la concentration (unité de formation de colonies [CFU] par μL) de la solution d’inoculation de 14 mL.-6
  2. Bouteilles de pulvérisation d’inoculation stérilisantes
    1. Démonter les bouteilles de pompe boston rondes ambre (59 mL) et tremper tous les composants (pompe, tube, bouchon et bouteille) dans une solution d’eau de Javel de 30 % pendant 30 min dans un grand contenant en plastique avec un couvercle bien ajusté.
    2. Après trempage, versez soigneusement toute l’eau de Javel du récipient en soulevant un seul coin du couvercle du récipient.
    3. Rincer les bouteilles en remplissant le récipient en plastique d’eau déionisée autoclavée (~1 L selon la taille du récipient) et versez soigneusement l’eau déionisée, encore une fois en soulevant le couvercle à un coin.
    4. Stériliser une armoire de biosécurité en pulvérisant avec une solution d’éthanol à 70 % et en allumant la lumière UV pendant 30 min.
      REMARQUE : Poursuivre ce travail dans l’armoire de biosécurité afin qu’il n’y ait aucun risque de contamination microbienne des bouteilles à l’air sec.
    5. Retirer les bouteilles du grand récipient en plastique et remplir chaque bouteille d’eau déionisée autoclaved à l’aide d’une pipette. Remonter les pompes et en placer une dans chaque bouteille. Pomper l’eau déionisée à travers chaque bouteille (10 pulvérisations par bouteille) pour enlever l’eau de Javel du composant de la pompe de la bouteille.
    6. Répétez l’étape 2.2.5 pour vous assurer que tout l’eau de Javel est retirée des bouteilles en verre.
    7. Testez si les bouteilles sont stériles en plaçant un numéro sur chaque bouteille (coller du ruban de laboratoire sur le côté de la bouteille lorsqu’elle est entièrement sèche), puis ajoutez 10 ml de PBS de 1x à chacune des bouteilles et pompez 3 pulvérisations sur une plaque d’agar TS. Après la pulvérisation, incuber les assiettes pendant une semaine à température ambiante. Si des colonies poussent sur une assiette, cela indique que la bouteille respective n’était pas stérile et ne devrait pas être utilisée pour des expériences.
    8. Avant de stocker les bouteilles stériles, retirez tous les PBS restants et laissez sécher les bouteilles à fond dans l’armoire de biosécurité. Conservez les bouteilles stériles dans un contenant en plastique stérile (généralement le contenant utilisé pour blanchir les bouteilles) jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
  3. Préparation de l’inoculum microbien et pulvérisation de choux sans germes
    ATTENTION : Toutes les étapes doivent être effectuées dans un cabinet de biosécurité, car la pulvérisation d’aérosols les solutions microbiennes qui pourraient contaminer les surfaces de travail ou présenter un risque pour la santé si elle est effectuée sur un banc de laboratoire.
    REMARQUE : Les choux formeront de vraies feuilles après 5 jours, il est donc conseillé d’attendre une semaine après la plantation du chou avant d’inoculer avec des solutions microbiennes. Comme les tubes sont scellés, il n’est pas nécessaire d’arroser les choux. Les expériences sont mieux réalisées dans le mois suivant la plantation, car les petits tubes limitent la croissance du chou.
    1. Décongeler les stocks de glycérol sur la glace et diluer en PBS 1x à la concentration d’inoculation souhaitée (concentration déterminée par le dégel et le placage d’un alquot de 1 mL à l’étape 2.1.4).
      NOTE : Une variété de niveaux d’inoculation différents peut être utilisée, mais les isolats de phyllosphère peuvent se développer de10 4 à 108 CLU/mL de lisier de chou en 10 jours.
    2. Ajouter 10 ml de bouillon de glycérol dilué à la bouteille de pompe stérile et pomper 5 pulvérisations dans un grand bécher de collecte des déchets pour enlever tout PBS résiduel du composant de la pompe à bouteille.
    3. Retirez le couvercle du tube de chou, inclinez le chou vers la bouteille de pulvérisation, et pulvérisez chaque chou avec 3 pompes de la solution d’inoculation, qui fournit ~600 μL d’inoculum.
    4. Après l’inoculation, récoltez un sous-ensemble des choux pour évaluer la concentration réelle d’inoculation des intrants. Retirer le chou d’un tube avec des forceps stérilisés. Couper les racines à l’aide de ciseaux de dissection stériles, puis placer soigneusement le chou dans un tube de microcentrifuge stérile pré pesé de 1,5 m L. Enregistrez le poids du chou pour les calculs futurs si des CVU/g de chou sont nécessaires pour les calculs.
    5. Ajouter 400 μL de 1x PBS à chaque tube de microcentrifuge de 1,5 m L contenant du chou et utiliser un micropestle stérile pour homogénéiser le chou dans le PBS 1x en le broyant 30x.
    6. Diluer l’homogénéité du chou (si nécessaire) et éliminer le mélange de choux ravageurs. Utilisez de larges pointes d’orifice pour piper la boue de chou parce qu’il sera épais et plein de morceaux de tissu végétal.

3. Préparation d’extrait de légumes stériles

NOTE: Cette méthode est une version modifiée de la production de choux stériles médias18,19.

  1. Achetez un chou dans un supermarché. Dans le laboratoire, retirer et jeter les feuilles extérieures du chou. Hacher tout le chou restant pour qu’il s’intègre dans un mélangeur et homogénéiser le chou à une pulpe fine, c’est-à-dire que le chou ne sera pas plus fin avec un autre mélange.
    REMARQUE : Tout mélangeur qui peut hacher le chou à une pulpe homogène lisse doit convenir à cette méthode.
  2. Peser l’homogénéité du chou mélangé et ajouter 2 mL d’eau distillée par gramme de chou. Filtrer la boue de chou mélangée à travers 2 couches de filtres à café panier (papier non blanchi).
  3. Distribuer la boue de chou dans des tubes de centrifugeuse (la taille dépend de la centrifugeuse). Centrifuger la boue de chou filtrée à 20 000 x g pendant 20 min jusqu’à ce que de grandes particules se déposent hors de solution.
    REMARQUE : Il est essentiel de centrifuger la boue du chou pendant une longue période, car les particules de chou obstruent rapidement le stérilisateur du filtre.
  4. À l’aide d’une pipette sérologique, retirer le supernatant des débris de chou granulés en prenant soin de ne pas déranger le chou granulé. Si vous visez à recréer les conditions de fermentation où des concentrations standard de sel sont utilisées, ajoutez 2% w/v NaCl à cette étape (c.-à-d. avant la stérilisation du filtre).
  5. Le filtre stérilise l’extrait de légumes à l’aide d’un filtre de 0,2 μm (500 mL ou 1 L) fixé à un vide. Distribuer dans des tubes stériles (tubes de centrifugeuse de 50 mL ou tubes de centrifugeuse de 15 mL) et congeler à -80 °C jusqu’à l’utilisation.

4. Inoculation d’extrait de légumes stériles

  1. Décongeler le SVE et distribuer 490 μL en tubes de microcentrifuge de 1,5 m L. Utilisez suffisamment de tubes pour avoir au moins cinq répliques par traitement par point de temps car chaque mesure de timepoint est destructrice.
  2. Décongeler les stocks de glycérol d’isolats microbiens sur la glace et diluer avec 1x PBS à la concentration désirée. La concentration de bactéries lactiques peut être aussi faible que 5 000 CFU par mL de SVE. Pour atteindre cette concentration, diluer les stocks à 250 CLU/μL parce que 10 μL seront utilisés pour l’inoculation d’un volume total de 500 μL.
  3. Inoculer SVE avec 10 μL d’isolat microbien dilué. Pipette de haut en bas à quelques reprises pour bien mélanger. Incuber à la température désirée (14 °C pour la température de production de kimchi ou 24 °C pour la fermentation la plus chaude de la choucroute).
  4. Mesurer le taux de croissance de l’isolat microbien dans le SVE en récoltant des tubes de réplique le jour 1, jour 2, jour 4, jour 7 et jour 14.
    REMARQUE : La fermentation se poursuit rapidement dès le début et ralentit avec le temps. Par conséquent, avoir plus de délais initiaux donne une plus grande résolution à la dynamique de la façon dont la fermentation procède.
  5. À chaque point de temps, bien mélanger la SVE inoculée en faisant des pipes de haut en bas à quelques reprises. Diluer en série le SVE inoculé en 1x PBS et la plaque sur les plaques d’agar. Incuber les plaques d’agar pendant 4 à 7 jours avant de compter les colonies.
    REMARQUE : L’agar de l’homme, de Rogosa et de Sharpe (MRS) doit être utilisé pour énumérer toutes les bactéries lactiques, le peptone dextrose de levure (YPD) doit être utilisé pour la levure, et l’agar de TS pour la plupart des autres isolats de bactéries de la phyllosphère.
  6. Enregistrez le pH des échantillons à chaque point de temps à l’aide d’une sonde micro pH.
    REMARQUE : Cette étape doit être effectuée après le placage parce que la sonde de pH transférera des cellules entre les tubes/traitements.

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Résultats

Taux de croissance des choux napa
La méthode de stérilisation des graines a été testée avec plusieurs choux Napa différents (B. rapa var pekinese; Figure supplémentaire 1) d’un certain nombre de fournisseurs différents et tous ont augmenté de façon constante avec des taux de croissance similaires. Cependant, tester les méthodes avec différentes espèces de Brassica (B. rapa: Navet Purple Top; B. oleracea:

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Discussion

Les plants de choux napa exempts de germes ont été utilisés pour étudier la limitation de dispersion des bactéries lactiques dans la phyllosphère du chou napa17. Les choux napa exempts de germes peuvent également être utilisés pour tester la croissance individuelle ou en couple dans la phyllosphère (figure 1). Des méthodes de fabrication d’extrait de légumes stériles ont été testées pour trois variétés différentes de choux : le rouge, le vert et l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention USDA-NIFA : 2017-67013-26520. Tracy Debenport et Claire Fogan ont fourni un soutien technique et Ruby Ye et Casey Cosetta fournissent des commentaires utiles sur les premières versions de ce manuscrit.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesVWR20170-650
15 mL conical tubesFalcon352096
7-way tray traySigma MagentaT8654
Amber Round Boston Glass BottleGPS 712OZSPPK12BROrdered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filtersIf you care(unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free)Austin's50-010-45
Borosilicate Glass tubesVWR47729-586
Calcined clayTurfaceMVPOrdered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blenderCuisinartCuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors7-389-AAmerican Educational ProductsOrdered on Amazon.com
EthanolVWR89125-172
ForcepsAven18434Ordered on Amazon.com
GlycerolFisher Scientific56-81-5
KleenGuard M10Kimberley-Clark64240
Large plastic containerRubbermaidOrdered on Amazon.com
Light racksGardner's Supply39-357full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way capsMillipore SigmaC1934
Man, Rogosa, and SharpeFisher ScientificDF0881-17-5This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probeThermo Scientific8220BNWP
MicropestleCarolina215828Also called Pellet Pestle
MS nutrient brothMillipore SigmaM5519Murashige and Skoog Basal Medium
NaClSigma AldrichS9888
Napa cabbage seedsJohnny's Select Seeds2814GB. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mmFisherFB0875712Used to make agar plates
Phosphate buffer salineFisher Scientific50-842-941Teknova
Plant tissue culture boxSigmaMagenta GA-7
Serologial pipettesVWR89130-900
Sterile dowelPuritan10805-018Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filterNalgene974103
Tryptic soy agarFisher ScientificDF0370-17-3This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tipsRainin17007102
Yeast, peptone and dextroseFisher ScientificDF0428-17-5This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates

Références

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