Um sistema gnotobiótico para estudar a montagem do microbioma na Fistofera e na Fermentação Vegetal

Resumo

Foi desenvolvido um método de cultivo de repolhos Napa sem germes que permite aos pesquisadores avaliar como espécies microbianas únicas ou comunidades microbianas multiespécies interagem em superfícies de folhas de repolho. Também é apresentado um extrato vegetal estéril que pode ser usado para medir mudanças na composição da comunidade durante a fermentação vegetal.

Resumo

A filosfera, a porção acima do solo da planta que pode ser colonizada por micróbios, é um sistema modelo útil para identificar processos de montagem comunitária microbiana. Este protocolo descreve um sistema para estudar a dinâmica da comunidade microbiana na filosfera das plantas de repolho Napa. Descreve como cultivar plantas livres de germes em tubos de ensaio com um substrato de argila calcinada e caldo de nutrientes. A inoculação de plantas livres de germes com culturas microbianas específicas oferece oportunidades para medir o crescimento microbiano e a dinâmica comunitária na filosfera. Através do uso de extrato vegetal estéril produzido a partir de repolhos, também podem ser avaliados os deslocamentos em comunidades microbianas que ocorrem durante a fermentação. Este sistema é relativamente simples e barato de ser criado em laboratório e pode ser usado para abordar questões ecológicas importantes na montagem da comunidade microbiana. Também oferece oportunidades para entender como a composição da comunidade da filosfera pode impactar a diversidade microbiana e a qualidade das fermentações vegetais. Essa abordagem para o desenvolvimento de comunidades de filosfera de repolho gnotobiótico poderia ser aplicada a outras espécies de plantas selvagens e agrícolas.

Introdução

A diversidade microbiana da fisfera desempenha um papel importante na manutenção da saúde vegetal e também pode influenciar a capacidade das plantas de suportar o estresse ambiental^1,,2,3,4,,5. Por sua vez, a saúde das culturas impacta diretamente na segurança alimentar e na qualidade^6,7. As plantas desempenham um papel no funcionamento do ecossistema e seus microbiomas associados afetam tanto a capacidade das plantas de realizar essas atividades como influenciam diretamente o meio ambiente⁸. Embora os cientistas tenham começado a decifrar a função e a composição da filosfera, os processos ecológicos que influenciam a montagem da comunidade microbiana da filosfera não são totalmente compreendidos^9,,10. O microbioma da fisfera é um excelente sistema experimental para estudar a ecologia dos microbiomas¹¹. Essas comunidades são relativamente simples e muitos dos membros da comunidade podem ser cultivados em mídia de laboratório padrão^10,,12,,13.

Vegetais fermentados são um sistema onde a estrutura comunitária da filosfera tem consequências importantes. Tanto no chucrute quanto no kimchi, os micróbios que ocorrem naturalmente nas folhas vegetais (a filosfera da espécie Brassica) servem como o inóculo para a fermentação^14,15. As bactérias do ácido láctico (LAB) são consideradas membros onipresentes de microbiomas vegetais, porém podem estar em baixa abundância na fisfera¹⁶. Uma forte seleção abiótica durante a fermentação impulsiona uma mudança na composição da comunidade microbiana, permitindo que as bactérias do ácido láctico aumentem em abundância. À medida que o LAB cresce, eles produzem ácido láctico que cria o ambiente ácido de produtos vegetais fermentados¹⁷. A ligação entre a fisfera e o fermento proporciona uma oportunidade de usar vegetais como modelo para entender como os microbiomas são estruturados.

Desenvolvemos métodos para cultivar repolhos Napa sem germes e inocula-los com comunidades microbianas específicas usando garrafas de spray. Trata-se de um método barato e confiável de inocular uniformemente o repolho com micróbios individuais ou comunidades mistas. Um extrato vegetal estéril (SVE) também foi desenvolvido a partir de três tipos/variedades diferentes de repolho: repolho vermelho e verde(Brassica oleracea) e repolho Napa (B. rapa). A adição de sal a essas PMEs replica o ambiente de fermentação e permite estudos experimentais de pequena escala e relativamente de alto rendimento da montagem de microbioma de fermentação. Esses métodos podem ser usados para estudar a montagem da comunidade microbiana na filosfera e como a dinâmica da comunidade microbiana na filosfera pode estar ligada ao sucesso da fermentação vegetal.

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Protocolo

1. Repolhos sem germes

1. Preparando equipamentos para o cultivo de repolhos sem germes
   1. Limpeza da argila calcinada para remover partículas de poeira fina
      1. Enxágüe argila calcinada(Tabela de Materiais) pelo menos 3x com água da torneira; drenar água.
         ATENÇÃO: A argila calcinada produz pó muito fino e recomenda-se usar uma máscara protetora(Tabela de Materiais)durante a lavagem.
      2. Espalhe argila calcinada como uma camada fina (~4 cm) em uma bandeja de autoclave e autoclave em um ciclo seco (aquecimento de 121 °C por 20 min e 20 min de tempo de secagem) para esterilizar.
      3. Deixe a argila calcinada secar completamente antes de ser usada, espalhando-se em bandejas e colocando em uma incubadora quente (30-37 °C) por pelo menos uma semana. Mexa para misturar a cada 3 dias para secar totalmente a argila calcinada para que absorva uma quantidade uniforme de caldo de nutrientes Murashige e Skoog (MS) (seção 1.2).
         NOTA: A secagem também ajuda a manter o volume de argila calcinada mesmo quando é pesada em tubos. A secagem por outros meios, como um forno de secagem, também seria adequada.
   2. Limpeza dos vidros para o cultivo de repolhos sem germes
      1. Limpe e esterilize completamente os tubos de vidro(Tabela de Materiais)entre cada uso. Mergulhe os tubos por 30 minutos em solução de alvejante de 30% e enxágue bem com água da torneira antes de limpar em uma lavagem ácida em um ambiente de bacteriologia. As tampas do tubo de ensaio de lavagem a ácido(Tabela de Materiais)entre os usos.
   3. Sementes de repolho esterilizadoras superficiais
      1. Coloque até 100 sementes de repolho Napa(B. rapa var pekinensis) em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
         NOTA: Adicionar mais de 100 sementes a um tubo de microcentrifuuge ou alterar o tamanho do tubo pode afetar as taxas de germinação das sementes devido à falta de remoção do casaco de sementes.
      2. Adicione 1 mL de 70% de etanol às sementes e vórtice por 5 minutos. Descarte o etanol usando uma pipeta.
      3. Adicione 1 mL de alvejante de 50% e vórtice por 5 minutos. Descarte a solução de alvejante usando uma pipeta.
      4. Adicione 1 mL de água deionizada autoclavada e vórtice por 5 minutos. Descarte a água deionizada usando uma pipeta.
      5. Repita o passo 1.1.3.4 3x para enxaguar todo o alvejante. Mergulhe as sementes em água deionizada estéril por 2-8 h antes do plantio para suavizar a camada de sementes.
2. Cultivando repolhos sem germes
   NOTA: Os repolhos napa(B. rapa var pekinensis) são cultivados em tubos de vidro (15 cm x 2,5 cm) contendo argila calcinada encharcada em Murashige e Skoog (MS) caldo de nutrientes(Figura 1).
   1. Pesar 10 g de argila calcinada limpa em um tubo de vidro limpo (15 cm x 2,5 cm).
   2. Prepare o caldo de nutrientes MS dissolvendo 4,4 g de ms médio em 1 L de água deionizada. Adicione caldo de nutrientes MS (~9 mL) a cada tubo de vidro para cobrir a argila calcinada usando uma pipeta.
      NOTA: O líquido em pé no tubo evitará que a semente germinasse para que possa ser necessário adicionar um pouco menos de caldo MS a alguns tubos.
   3. Tampa solta de tubos de vidro com tampas de tubo de ensaio bidireis de 22 mm e autoclave (121 °C por 60 min). Ao removê-los da autoclave, empurre as tampas para os tubos de vidro para selá-las. Esfrie os tubos à temperatura ambiente antes de usar.
   4. Coloque suavemente uma semente de repolho estéril no centro de cada tubo usando fórceps estéreis e longos (25,4 cm). Coloque os tubos em uma bandeja de 7 vias e coloque sob racks de luz (lâmpadas fluorescentes T5 de espectro completo ou outra configuração de iluminação para crescimento da planta) com um ciclo de luz de 16 horas a 24 °C.
      NOTA: As sementes germinam durante a noite e desenvolvem sua primeira folha verdadeira após 5 dias. Uma verdadeira folha é a primeira folha vascular depois que os cotilledons se formaram. Tem uma borda mais enrugada e em Brassica rapa é coberta de trichomes.
3. Testes para esterilidade de repolhos sem germes
   NOTA: Para testar se os repolhos estão livres de germes, selecione alguns repolhos (5-10) de cada lote e placa para determinar se há colônias culturais presentes.
   1. Remova suavemente o repolho dos tubos de vidro, agarrando a base da planta com fórceps esterilizados e puxando-o para fora. Antes de remover o repolho totalmente do tubo, corte cuidadosamente as raízes usando uma tesoura de dissecção esterilizada. Compacte as folhas de repolho em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mL.
      NOTA: Repolhos maiores podem exigir a remoção de uma ou duas das folhas maiores enquanto o repolho ainda está no tubo para facilitar a entrada do repolho no tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Estas folhas maiores podem ser adicionadas ao tubo de 1,5 mL depois que o resto do repolho tiver sido colocado no tubo se todo o repolho for necessário.
   2. Adicione 400 μL de 1x de soro fisiológico tampão fosfato (PBS) a cada tubo de microcentrifus de 1,5 mL. Usando uma micropestle estéril, homogeneize o repolho por importunação de 30x.
   3. Placa 100 μL do repolho homogeneizar em placas de ágar para determinar se há algum contaminante presente na amostra. A maioria das bactérias encontradas na fisosfera crescerá em placas de ágar de soja trippática (TS). Use pontas de pipeta de orifício largo ao emplacar repolho homogeneizar, pois o repolho homogeneado é espesso e pode entupir pontas regulares de pipeta.

2. Vacinar a fisfera com soluções microbianas

1. Fazendo estoques de glicerol de cepas de inoculação
   NOTA: A Tabela 1 lista os isolados microbianos que podem ser usados nesta etapa. Outros isolados da fisfera também podem ser usados aqui.
   1. Densamente, as colônias individuais saem de uma nova raia, em duas ou três novas placas da mesma mídia para obter muitas colônias.
   2. Deixe as listras crescerem por 2-5 dias e raspar colônias de todas as placas em um tubo cônico de 15 mL contendo 15 mL de 15% de glicerol, e vórtice para misturar completamente.
   3. Transfira uma alíquota de 1 mL do estoque de glicerol bem misturado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e armazene os estoques de glicerol a -80 °C até usar. Salve os 14 mL restantes de estoque de glicerol a -80 °C, pois volumes relativamente grandes de solução de inoculação são necessários ao vacinar repolhos.
   4. Uma semana antes do uso, descongele o tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de estoque de glicerol (a partir do passo 2.1.3) no gelo, diluir e chapar em várias diluições diferentes (por exemplo, 10^-4, 10^-5e 10^-6) para determinar a concentração (unidade formadora de colônias [UFC] por μL) da solução de inoculação de 14 mL.
2. Esterilizando garrafas de spray de inoculação
   1. Desmonte as garrafas de bomba em volta âmbar de Boston (59 mL) e mergulhe todos os componentes (bomba, tubo, tampa e garrafa) em solução de alvejante de 30% por 30 minutos em um grande recipiente plástico com uma tampa bem encaixada.
   2. Após a imersão, despeje cuidadosamente todo o alvejante do recipiente levantando apenas um canto da tampa do recipiente.
   3. Enxágüe as garrafas enchendo o recipiente de plástico com água deionizada autoclaved (~1 L, dependendo do tamanho do recipiente) e despeje cuidadosamente água desionizada, novamente levantando a tampa em um canto.
   4. Esterilize um armário de biossegurança pulverizando com solução de 70% de etanol e ligando a luz UV por 30 minutos.
      NOTA: Continue este trabalho no armário de biossegurança para que não haja risco de contaminação microbiana das garrafas à medida que secam o ar.
   5. Retire as garrafas do grande recipiente plástico e encha cada garrafa com água deionizada autoclaved usando uma pipeta. Remonte as bombas e coloque uma em cada garrafa. Bombeie a água deionizada através de cada garrafa (10 sprays por garrafa) para remover alvejante do componente da bomba da garrafa.
   6. Repita o passo 2.2.5 para garantir que todo o alvejante seja removido das garrafas de vidro.
   7. Teste se as garrafas são estéreis colocando um número em cada garrafa (colando fita de laboratório ao lado da garrafa quando estiver totalmente seca) em seguida, adicione 10 mL de 1x PBS a cada uma das garrafas e bombeie 3 sprays em uma placa de ágar TS. Depois de pulverizar, incubar as placas por uma semana em temperatura ambiente. Se alguma colônia crescer em uma placa, indica que a respectiva garrafa não era estéril e não deve ser usada para experimentos.
   8. Antes de armazenar as garrafas estéreis, remova todos os PBS restantes e deixe as garrafas secarem completamente no armário de biossegurança. Armazene garrafas estéreis em um recipiente plástico estéril (tipicamente o recipiente usado para branquear as garrafas) até usar.
3. Preparando o inóculo microbiano e pulverizando repolhos sem germes
   ATENÇÃO: Todas as etapas devem ser executadas em um armário de biossegurança, pois a pulverização aerossóola as soluções microbianas que podem contaminar superfícies de trabalho ou representar um risco para a saúde se realizadas em um banco de laboratório.
   NOTA: Os repolhos formarão folhas verdadeiras após 5 dias, por isso é aconselhável esperar uma semana após o plantio do repolho antes de vacinar com quaisquer soluções microbianas. Como os tubos estão selados, não há necessidade de regar os repolhos. Os experimentos são melhor realizados dentro de um mês após o plantio, pois os pequenos tubos restringem o crescimento do repolho.
   1. Descongelar os estoques de glicerol no gelo e diluir em 1x PBS à concentração de inoculação desejada (concentração determinada por descongelamento e revestimento de uma alíquota de 1 mL na etapa 2.1.4).
      NOTA: Uma variedade de diferentes níveis de inoculação pode ser usada, mas os isolados da filosfera podem crescer de 10⁴ a^{10 8} UFC/mL de chorume de repolho em 10 dias.
   2. Adicione 10 mL de caldo de glicerol diluído ao frasco de bomba estéril e bombeie 5 sprays em um grande béquer de coleta de lixo para remover qualquer PBS residual do componente da bomba de garrafa.
   3. Retire a tampa do tubo de repolho, incline o repolho em direção à garrafa de spray e pulverize cada repolho com 3 bombas da solução de inoculação, que fornece ~600 μL de inóculo.
   4. Após a inoculação, colher um subconjunto dos repolhos para avaliar a concentração real de inoculação de entrada. Remova o repolho de um tubo com fórceps esterilizados. Corte as raízes com uma tesoura de dissecção estéril e, em seguida, coloque cuidadosamente o repolho em um tubo de microcentrifuge estéril pré-varrido de 1,5 mL. Registo o peso do repolho para cálculos futuros se as CFUs/g de repolho forem necessárias para os cálculos.
   5. Adicione 400 μL de 1x PBS a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo repolho e use uma micropestle estéril para homogeneizar o repolho no PBS 1x moendo-o 30x.
   6. Diluir o repolho homogeneizar (se necessário) e aplacar a mistura de repolho pestled. Use pontas de orifícios largos para tubos de chorume de repolho, pois ele será espesso e cheio de pedaços de tecido vegetal.

3. Preparar extrato vegetal estéril

NOTA: Este método é uma versão modificada da produção de mídia estéril de repolho^18,19.

1. Compre um repolho de um supermercado. No laboratório, remova e descarte as folhas mais externas do repolho. Pique todo o repolho restante para caber em um liquidificador e homogeneizar o repolho a uma polpa fina, ou seja, o repolho não ficará mais fino com mais mistura.
   NOTA: Qualquer liquidificador que possa cortar repolho a uma polpa homogênea lisa deve ser adequado para este método.
2. Pesar o repolho misturado homogeneizar e adicionar 2 mL de água destilada por grama de repolho. Filtre o chorume de repolho misturado através de 2 camadas de filtros de café cesta (papel não abatado).
3. Distribua o chorume de repolho em tubos de centrífuga (o tamanho depende da centrífuga). Centrifugar o chorume filtrado de repolho a 20.000 x g por 20 minutos até que grandes partículas se acalmem fora da solução.
   NOTA: É essencial centrifugar o chorume de repolho por um longo período de tempo, pois as partículas de repolho entupiram rapidamente o esterilizador do filtro.
4. Usando uma pipeta sorológica, remova o sobrenante dos detritos de repolho pelleted tomando cuidado para não perturbar o repolho pelleted. Se tiver o objetivo de recriar condições de fermentação onde as concentrações de sal padrão são usadas, adicione 2% de c/v NaCl nesta etapa (ou seja, antes da esterilização do filtro).
5. O filtro esteriliza o extrato vegetal usando um filtro de 0,2 μm (500 mL ou 1 L) ligado a um vácuo. Dispense em tubos estéreis (tubos centrífugas de 50 mL ou tubos de centrífugas de 15 mL) e congele a -80 °C até usar.

4. Inoculação de extrato vegetal estéril

1. Descongele SVE e dispense 490 μL em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Use tubos suficientes para ter pelo menos cinco réplicas por tratamento por ponto de tempo, pois cada medição de ponto de tempo é destrutiva.
2. Descongelar os estoques de glicerol de isolados microbianos no gelo e diluir com 1x PBS à concentração desejada. A concentração de bactérias de ácido láctico pode ser tão baixa quanto 5.000 UFC por mL de SVE. Para alcançar essa concentração, diluir os estoques para 250 UFC/μL, pois 10 μL serão utilizados para a inoculação de um volume total de 500 μL.
3. SVE inoculada com 10 μL de isolante microbiano diluído. Pipeta para cima e para baixo algumas vezes para misturar completamente. Incubar a temperatura desejada (14 °C para temperatura de produção de kimchi ou 24 °C para fermentação mais quente de chucrute).
4. Medir a taxa de crescimento do isolado microbiano na SVE por meio da colheita de tubos de réplica no dia 1, dia 2, dia 4, dia 7 e dia 14.
   NOTA: A fermentação prossegue rapidamente no início e diminui com o tempo. Portanto, ter mais pontos de tempo iniciais dá maior resolução à dinâmica de como proceder a fermentação.
5. A cada ponto de tempo, misture bem o SVE inoculado por pipetting para cima e para baixo algumas vezes. Diluir em série o SVE inoculado em 1x PBS e placa em placas de ágar. Incubar as placas de ágar por 4-7 dias antes de contar colônias.
   NOTA: O ágar man, Rogosa e Sharpe (MRS) deve ser usado para enumerar todas as bactérias de ácido láctico, levedura peptone dextrose (YPD) deve ser usado para levedura, e ágar TS para a maioria das outras bactérias isoladas da fisfera.
6. Registo o pH das amostras em cada ponto de tempo usando uma sonda micro pH.
   NOTA: Esta etapa deve ser realizada após o revestimento, pois a sonda pH irá transferir células entre tubos/tratamentos.

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Resultados

Taxas de crescimento de repolhos Napa
O método de esterilização de sementes foi testado com vários repolhos Napa diferentes (B. rapa var pekinese; Figura Suplementar 1) de vários fornecedores diferentes e todos cresceram consistentemente com taxas de crescimento semelhantes. No entanto, testando os métodos com diferentes espécies de Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Híbrido Giga...

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Discussão

As plantas de repolho Napa livres de germes têm sido usadas para estudar a limitação dispersa de bactérias de ácido láctico na fisfera de repolho napa¹⁷. Repolhos Napa sem germes também podem ser usados para testar o crescimento individual ou par-wise na fisfera (Figura 1). Métodos para a fabricação de extrato vegetal estéril foram testados para três variedades diferentes de repolho: vermelho, verde e napa. Cada uma dessas SVEs atuam como uma mídia de cre...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	20170-650
15 mL conical tubes	Falcon	352096
7-way tray tray	Sigma Magenta	T8654
Amber Round Boston Glass Bottle		GPS 712OZSPPK12BR	Ordered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filters	If you care		(unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free)	Austin's	50-010-45
Borosilicate Glass tubes	VWR	47729-586
Calcined clay	Turface	MVP	Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blender	Cuisinart		Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors	7-389-A	American Educational Products	Ordered on Amazon.com
Ethanol	VWR	89125-172
Forceps	Aven	18434	Ordered on Amazon.com
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5
KleenGuard M10	Kimberley-Clark	64240
Large plastic container	Rubbermaid		Ordered on Amazon.com
Light racks	Gardner's Supply	39-357	full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way caps	Millipore Sigma	C1934
Man, Rogosa, and Sharpe	Fisher Scientific	DF0881-17-5	This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probe	Thermo Scientific	8220BNWP
Micropestle	Carolina	215828	Also called Pellet Pestle
MS nutrient broth	Millipore Sigma	M5519	Murashige and Skoog Basal Medium
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
Napa cabbage seeds	Johnny's Select Seeds	2814G	B. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Used to make agar plates
Phosphate buffer saline	Fisher Scientific	50-842-941	Teknova
Plant tissue culture box	Sigma	Magenta GA-7
Serologial pipettes	VWR	89130-900
Sterile dowel	Puritan	10805-018	Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filter	Nalgene	974103
Tryptic soy agar	Fisher Scientific	DF0370-17-3	This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tips	Rainin	17007102
Yeast, peptone and dextrose	Fisher Scientific	DF0428-17-5	This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates