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摘要

组蛋白乙酰转移酶（HATs，也称为碱基乙酰转移酶）的抑制剂，如CBP/p300，是治疗癌症的潜在疗法。然而，需要严格的方法来验证这些抑制剂。三种体外验证方法包括使用重组乙酰转移酶进行帽子检测、细胞培养中组蛋白乙酰化的免疫印迹和ChIP-qPCR。

摘要

莱辛乙酰转移酶（KATs）催化蛋白酶和其他蛋白质上的乳氨酸残留物的乙酰化，以调节染色质动力学和基因表达。KAT，如CBP/p300，由于它们在多种癌症的肿瘤发生中起着关键作用，正在作为治疗对象进行紧张的研究。针对KATS的组蛋白乙酰转移酶（HAT）功能开发新型小分子抑制剂是具有挑战性的，需要可靠的测定，以验证潜在抑制剂的特异性和效力。

本文概述了三种方法的管道，为新型 HAT 抑制剂 （HATi） 提供严格的体外验证。这些方法包括试管 HAT 测定、染色质超乙酰化抑制（ChHAI）测定和染色质免疫沉淀-定量 PCR （ChIP-qPCR）。在 HAT 检测中，重组的 HATs 在试管反应中用组蛋白孵育，允许组蛋白尾部的特定莱辛残留物乙酰化。这种反应可以通过HATi阻断，可以通过免疫印迹测量位点特异性组蛋白乙酰化的相对水平。在 HAT 检测中识别的抑制剂需要在细胞环境中得到确认。

ChHAI 测定使用免疫印迹来筛选新型 HATi，该哈蒂能够衰减由组蛋白脱乙酰酶抑制剂 （HDACi） 诱导的组蛋白的强健超乙酰化。添加HDACi是有帮助的，因为组蛋白乙酰化的基础水平可能很难通过免疫印迹检测。

HAT 和 ChHAI 测定测量组蛋白乙酰化的全球变化，但没有提供有关特定基因组区域乙酰化的信息。因此，ChIP-qPCR用于研究HATi对基因调控元素组蛋白乙酰化水平的影响。这是通过选择性免疫沉淀组蛋白-DNA复合物和通过qPCR分析纯化DNA实现的。这三种分析方法合在一起，可以仔细验证新HATi的特异性、效力和作用机制。

引言

莱辛乙酰转移酶（KATs）催化了组蛋白和非组,蛋白1、2、3、4上的乳,2氨酸残留物的3乙酰化。最近的研究表明，KATS及其乙酰转移酶功能可以促进实体肿瘤的生长4，5，6，7，8，9。,5,6,7,8,9例如，CREB结合蛋白（CBP）/p300是两个准体KAT，调节癌症2，3中的许多信号通路。CBP/p300具有良好的表观乙酰转移酶（HAT）功能和催化组蛋白3莱辛27乙酰化（H3K27ac）2，4，5，10，11，一个重要的标记活性增强剂，启动子区域和活性基因转录2,4,5,10,111212，13，14。,13,14CBP/p300通过组蛋白和其他转录因子,,,4、9、15、16、17、18激活肿瘤的转录,174，9作为实体肿瘤中促进生长信号通路的关键联合活性剂。1516由于CBP/p300在肿瘤进展中的作用，CBP/p300和其他KAT正在研究开发新的抑制剂，阻止其肿瘤功能44，5，6，7，8，9，18，19，20。,5,6,7,8,9,18,19,20A-485和GNE-049代表了两个成功的尝试，以开发有效的和特定的抑制剂CBP/p30044，99。目前正在对CBP/p300和其他KAT的其他抑制剂进行调查。

前面描述的KAT抑制剂（KATi）的质量受到质疑，许多抑制剂表现出靶向效应和不良表征21。因此，对新药候选药物进行严格的鉴定和验证对于开发高质量的化学探针至关重要。此处概述的三种协议构成了筛选和严格验证新型 KATi 的效力和特异性的管道，具体侧重于抑制 KAT 的 HAT 功能 （HATi）。CBP/p300 及其抑制剂用作示例，但这些协议可适用于具有 HAT 功能7的其他 KAT。

第一个协议是体外组蛋白转移酶（HAT）测定，利用纯化重组p300和组蛋白在受控试管反应。这种测定操作简单，性价比高，可用于在低通量环境中筛选化合物，不需要放射性物质。在该协议中，重组p300催化组蛋白尾部的乳氨酸乙酰化在短暂的潜伏期，组蛋白乙酰化水平使用标准的免疫印迹程序测量。酶反应可以在CBP/p300抑制剂存在或不存在的情况下进行，以筛选减少组蛋白乙酰化的化合物。此外，HAT测定可用于通过评估新化合物与其他纯化KAT（如PCAF）的活性，来验证新化合物是否对CBP/p300具有选择性。HAT 测定是研究新型抑制剂的极好起点，因为它简单、成本低，并且能够确定抑制剂的功效/选择性。事实上，这个协议经常在文献中用作体外屏幕5,5，10。然而，在帽子检测中识别的抑制剂并不总是有效的细胞培养，因为试管反应比活细胞系统简单得多。因此，在细胞培养实验22、23中进一步描述抑制剂是十分必要的。

管道中的第二个协议是染色质超乙酰抑制（ChHAI）测定。这种基于细胞的测定利用组蛋白去乙酰酶抑制剂（HDACi）作为工具，在与HATi 24共同孵化之前，在染色质中超乙酰化组蛋白。基础组蛋白乙酰化在细胞培养中可能很低，因此如果不添加HDACi来增加乙酰化，就很难通过免疫印迹进行探查。ChHAI测定的目的是确定新的HATi，可以抑制HDAC抑制引起的组蛋白乙酰化的增加。这种测定的优点包括成本低，相对易于执行，以及细胞在培养中的使用，这提供了比试管帽子检测更多的生理相关性。与 HAT 检测类似，此协议使用标准免疫印迹进行数据收集。

HAT 和 ChHAI 检测提供了有关新化合物抑制全球组蛋白乙酰化效力的数据，但没有提供这些化合物如何影响特定基因组区域的修饰的见解。因此，最终的协议，染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）是一个细胞培养实验，研究DNA-蛋白质相互作用在基因组的特定区域。在ChIP协议中，染色质是交联的，以保持DNA蛋白相互作用。然后从细胞中提取染色质，DNA-蛋白质复合物对感兴趣的蛋白质进行选择性免疫沉淀（例如，使用H3K27ac特异性抗体）。然后使用 qPCR 对 DNA 进行纯化和分析。例如，ChIP-qPCR 可用于确定一种新的 HATi 是否对单个肿瘤的组蛋白乙酰化进行调节，例如 Cyclin D125。虽然ChIP-qPCR是该领域常用的技术，但很难优化4、10、26。,264,该协议提供了避免执行 ChIP-qPCR 过程时可能发生的潜在陷阱的提示，包括应对数据执行的质量控制检查。

当一起使用时，这三种协议允许对新型HATi进行严格的表征和验证。此外，这些方法提供了许多优点，因为它们易于执行，相对便宜，并提供全球和区域组蛋白乙酰化的数据。

研究方案

1. 体外帽子测定

  1. 缓冲准备
    注:有关缓冲区配方，请参阅表 1。
    1. 准备5x测定缓冲液和6x硫酸钠（SDS），并在-20°C下储存。 1 mL 等分中的等分 Sds。
    2. 准备 10 倍 SDS 凝胶运行缓冲液和 10 倍 TBST，并在室温下储存。
    3. 准备 1x 传输缓冲液，并在 4 °C 下存放。
      注意:检查本协议中使用的所有化学品的安全数据手册。SDS、DTT 和蓝个兄弟酚是有毒的，不应摄入、吸入或暴露在皮肤或眼睛中。有关正确处理程序，请参阅安全数据手册。请使用化学烟罩处理危险化学品。
  2. 帽子反应
    注:Anacardic酸是一种已知的p300抑制剂3，用作演示 HAT 测定如何识别新型 p300 抑制剂的示例。有关步骤1.2.1的示意图，请参阅补充协议 （ 示意图 1 ）。
    1. 在 0.2 mL PCR 管中制备以下酶反应:2 μL 的 5x 测定缓冲液， 1 μL 的纯化 p300 （0.19 μg/μL），1 μL 的亚硫酸 （HATi） 或 DMSO 控制在 1x 测定缓冲液中稀释，2 μL 的自动处理 ddH2O. 在室温下预孵育该混合物 10 分钟。然后加入3 μL的100μM乙酰-CoA和1μL的纯化H3.1（0.2μg/μL）到反应中。
    2. 在PCR热循环器中，在30°C下孵育完整反应混合物1小时。
    3. 与 6x SDS 样品缓冲液的 1:10 比率添加 2-二甲醇。
    4. 从 PCR 热循环器中去除样品，并将 2 μL 的 6x SDS（加入 2-mercaptoethanol）添加到反应混合物中。
      注意:2-二甲醇是有毒的，应在化学烟气罩内使用。有关正确处理，请参阅安全数据手册。
    5. 在 95 °C 下加热样品，在热块上加热 5 分钟，在冰上冷却。将样品储存在-20或-80°C，或进行凝胶电泳和免疫印迹，详见下文。
  3. 凝胶电泳和免疫印迹
    注:如果不熟悉凝胶电泳和免疫印迹，请参阅本标准程序27，了解如何执行步骤 1.3.1-1.3.17 的其他详细信息。其他信息可在此找到28，,29，,30， 31,31，32，33。
    1. 移液 10 μL 样品（从步骤 1.2.5.）进入 4-20% 梯度聚丙烯酰胺凝胶的孔中。移液器5μL的蛋白质梯进入其中一口作为分子量参考。使用凝胶罐以 120 V 运行凝胶 90 分钟。
    2. 使用转移罐以 100 V 将凝胶以 100 V 将其转移到聚乙烯二氟化物 （PVDF） 膜上 70 分钟。
    3. 从传输装置上取下膜，并将其放在塑料容器中。将 1x TBST（含 5% 牛奶）加入容器，在室温下轻轻摇动 1 小时，从而堵塞膜。
    4. 从步骤 1.3.3 中卸下 1x TBST。在4°C下用选定的点特异性乙酰抗体（例如，H3K18ac或H3K27ac原抗体在含有5%牛奶的1x TBST中稀释1:5，000稀释时）孵育膜过夜。
    5. 去除原抗体溶液。在室温下用1x TBST（无牛奶）清洗膜2x，每次洗涤15分钟轻轻摇晃。
    6. 在 1x TBST（含 5% 牛奶）中稀释二次抗体，并在室温下通过轻轻摇动孵育膜 1 小时。
    7. 去除二级抗体溶液。在室温下用1x TBST（无牛奶）清洗膜2x，每次洗涤15分钟轻轻摇晃。
    8. 从膜中排出 1x TBST。将HRP基板过氧化物溶液和HRP基板发光醇溶液以1:1的比例（每种1 mL）和移液器2 mL混合到膜表面。
    9. 在室温下用膜孵育溶液5分钟。
    10. 将多余的化学发光基板从膜中排入纸巾，将膜用塑料包装放在 X 射线盒支架内。
    11. 移动到专用于 X 射线胶片处理的暗室。将膜放在膜顶部并关闭盒式磁带 30 s，将膜暴露在 X 射线膜上。
      注:膜和膜的接触时间必须以实验方法确定。强信号需要短曝光（秒），弱信号可能需要更长的曝光时间。
    12. 从盒式磁带上取下 X 射线胶片，并通过 X 射线胶片处理器进行处理。有关如何处理 X 射线膜的详细说明，请参阅制造商手册。
    13. 从塑料包装上取下膜，用 ddH2O 在室温下用轻轻摇动洗涤 5 分钟。
    14. 在室温下用0.2 M NaOH孵育膜5分钟，轻轻摇动。
    15. 在室温下用 ddH2O 清洗膜 5 分钟，轻轻摇动。
    16. 将 1x TBST（含 5% 牛奶）加入容器，在室温下轻轻摇动 1 小时，从而堵塞膜。
    17. 加入下一个原抗体稀释（例如，如果使用的第一个抗体是H3K18ac，则探针H3K27ac），并在4°C下过夜。 重复步骤 1.3.4-1.3.17，直到所有抗体探针完成。

2. 查伊测定

  1. 体外药物治疗及乙酰基基组胃分析
    注: A-485 是一种有力且具有良好特征的 p300 HATi2,4 .由于该抑制剂在细胞培养中的功效和特异性，将在剩余的测定中使用。MS-275 （恩蒂诺斯塔特）24 是一种 HDACi，显著增加组蛋白乙酰化水平，用于促进乙酰化探针与标准免疫印迹的更容易检测。看到 补充议定书 (示意图 2）用于步骤 2.1 中使用的药物稀释的示意图。
    1. 种子100，000 MCF-7细胞在12个井板，并允许细胞生长到80-90%汇合在1mL的细胞培养培养。标记井进行以下实验设计:井1:DMSO控制（参考点）;井2:A-485（3μM）;井3:A-485（10μM）;井 4: MS-275 （3 μM）;井 5: MS-275 （3 μM） = A-485 （3 μM）;井 6: MS-275 （3 μM） = A-485 （10 μM）。
      注:对于培养MCF-7细胞，使用完整的DMEM介质，并允许细胞在37°C下生长，5%的CO2。有关 完整的 DMEM 配方 ，请参阅表 1。
    2. 播种后24小时，移液器4mL的完整DMEM介质到无菌的15mL锥形管。MS-275的移液器 2 μL（DMSO 中的 6 mM）至 4 mL 的介质，最终浓度为 3 μM MS-275。
    3. 在单独的无菌 15 mL 锥形管中，将 2 μL 的 DMSO 到 4 mL 介质。
      注意:请检查安全数据表是否正确处理 DMSO。某些手套类型没有额定处理 DMSO。
    4. 将细胞培养培养素从孔4-6和移液器1 mL的3μM MS-275中（步骤2.1.2）吸入每个孔。丢弃未使用的稀释 MS-275。
    5. 将细胞培养基从孔1-3和移液器1 mL稀释的DMSO（步骤2.1.3）吸进每个井。丢弃未使用的稀释 DMSO。
    6. 将细胞返回到培养箱并孵育4小时，以允许在暴露于MS-275（井4-6）的细胞中积累乙酰基酮。
      注:MS-275是HDACi，会导致组蛋白超乙酰化24。这种4小时预孵育是必要的，使MS-275诱导超乙酰化之前添加的 A-485，这减少了组蛋白乙酰化2，44。
    7. 使用MS-275孵育4小时后，通过移液在单独的无菌1.5 mL管中制备以下稀释:1.0μL的DMSO至1 mL的DMEM介质;0.5 μL 的 DMSO 和 0.5 μL 的 A-485 （6 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质;0.5 μL 的 DMSO 和 0.5 μL 的 A-485 （20 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质;0.5 μL 的 DMSO 和 0.5 μL 的 MS-275 （6 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质;0.5 μL 的 A-485 （6 mM） 和 0.5 μL 的 MS-275 （6 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质;0.5 μL 的 A-485 （20 mM） 和 0.5 μL 的 MS-275 （6 mM） 至 1 mL 的 DMEM 介质。
    8. 将细胞培养培养从井1-6和移液器1mL稀释1到井1，稀释2到井2，稀释3到井3，稀释4到井4，稀释5到井5，稀释6到井6。
      注:一般规则是平衡实验组之间的DMSO（溶剂）含量，不要超过细胞培养中的0.1%DMSO含量，以避免细胞毒性和增殖变化。
    9. 将细胞返回培养箱并培养20小时。
    10. 20小时后，从井1-6中吸出细胞培养培养。
    11. 通过将 1 mL 的 PBS 移液到井 1-6 洗涤细胞。吸气 PBS 。
    12. 将 100 μL 的 1x 无源解液缓冲液（参见 表 1）添加到井 1-6 中。将细胞培养板（样品储存在无源解液缓冲液中）在+80°C下过夜，用于细胞的冷冻和解冻。
      注意:在制作缓冲液之前，请检查所有化学品的安全数据表。CDTA 可引起严重的眼部损伤和刺激。
    13. 在室温下解冻样品，轻轻摇动10分钟。将样品转移到单独的 1.5 mL 管中，并立即放在冰上。
    14. 测量每个样品的蛋白质浓度。蛋白质浓度可以通过几个成熟的协议34确定。
    15. 使用1x无源解液缓冲液，必要时在样品1-6（同等体积）之间平衡蛋白质浓度以稀释。
    16. 以 1:10 比 6 倍 SDS 样品缓冲液添加 2-美甲乙醇。
    17. 将 6x SDS 样品缓冲液与 2-墨二甲醇添加到样品 1-6 中，最终浓度为 1x SDS 样品缓冲液。
    18. 在 95 °C 下加热样品，在热块上加热 5 分钟，在冰上冷却。样品可储存在-20°C或-80°C，直到步骤2.1.19。
    19. 在4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶中，将含有30μg蛋白质的体积移液，用于样品1-6到孔中。根据协议1中描述的协议执行免疫印迹程序。

3. ChIP-qPCR

注:以下协议以p300的抑制剂为例。

  1. 缓冲准备
    注:有关缓冲区配方，请参阅表 1。下面的 ChIP 协议的一般步骤（例如缓冲配方、洗涤时间和离心时间）根据制造商对商用套件的建议（参见材料表）和文献 35、36进行了修改和调整。
    1. 准备ChIP稀释缓冲液、核膨胀缓冲液、低盐洗液缓冲液、高盐洗液缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和TE缓冲液。储存在4°C。
    2. 准备 SDS 解液缓冲液、10 倍甘氨酸缓冲液和 ChIP 洗脱缓冲液。在室温下储存。
      注意:在制作缓冲液之前，请检查所有化学品的安全数据表，以确保正确处理。
  2. 药物治疗
    注:有关步骤3.2中使用的药物稀释的示意图，请参阅补充协议（示意图3）。
    1. 种子MCF-7细胞在两个15厘米培养皿和生长细胞到90%汇合在12mL的完整DMEM介质。标记菜盘进行以下实验设计:菜1:DMSO控制（参考点）;菜 2: A-485 （3 μM）。
      注:对于培养MCF-7细胞，使用完整的DMEM介质，并在37°C下生长，5%的CO2。有关 完整的 DMEM 配方 ，请参阅表 1。
    2. 在无菌 15 mL 锥形管中，移液器 12 mL 的 DMEM 介质和移液器 6 μL 的 DMSO。混合得很好。
    3. 在单独的无菌 15 mL 锥形管中，移液器 12 mL 的 DMEM 介质和移液器 6 μL 的 A-485（DMSO 中的 6 mM）获得最终浓度为 3 μM A-485。混合得很好。
    4. 从 Dish 1 和 2 中吸出媒体。
    5. 在 DMEM 中添加 12 mL 稀释的 DMSO（步骤 3.2.2.）添加到 Dish 1 中。
    6. 在 DMEM 中添加 3 μM A-485 的 12 mL（步骤 3.2.3.）添加到 Dish 2 中。
    7. 将细胞培养皿返回孵化器并孵育24小时。
  3. 细胞固定
    1. 将37%甲醛移液 330 μL（每 mL 27.5 μL）到完整介质，轻轻旋转板进行混合。
      注意:甲醛是有毒的。有关正确处理程序，请参阅安全数据手册。
    2. 在室温下孵育10分钟。
    3. 移液 2 mL 的 10 倍甘氨酸到板和漩涡混合。
    4. 在室温下孵育5分钟。
    5. 孵育后，将菜肴放在冰上，并解冻一杯蛋白酶抑制剂鸡尾酒。
    6. 使用步骤 3.1 中准备的缓冲区，为 DMSO 和 A-485 样本准备以下解决方案。
      1. 2 mL 的 PBS 与 1:1，000 稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒
      2. 1 mL 的核膨胀缓冲液，1:1，000 稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒
      3. 0.5 mL SDS Lysis 缓冲液，1:1，000 稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒
    7. 从细胞培养皿中吸出介质，用 15 mL 的冷 PBS 洗两次细胞。
    8. 用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（步骤3.3.6.1）对细胞培养皿进行2 mL的移液。使用细胞刮刀将细胞提起溶液。
    9. 将细胞悬浮液转移到微离心管。如有必要，使用额外的 PBS 收集剩余单元格。
    10. 在 4 °C 下以 800 x g 旋转管 5 分钟，以对细胞进行颗粒。
    11. 用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（步骤3.3.6.2）将上流剂和移液器1 mL的核膨胀缓冲液吸到颗粒中。重新暂停颗粒，在冰上孵育10分钟。
    12. 在 4 °C 下以 2，700 x g 将管离心 5 分钟，以颗粒核。
    13. 用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（步骤3.3.6.3）吸进上流液和移液器0.5 mL的SDS解菌缓冲液。重新暂停颗粒，在冰上孵育10分钟。
    14. 将染色质样品储存在-80°C，直到步骤3.4.1，或立即继续执行步骤3.4。
  4. DNA 声波
    1. 使用移液器将 130 μL 的染色质从 DMSO 样品（步骤 3.3.14）转移到两个 DNA 声波管（每个 130 μL）。
    2. 使用移液器将 130 μL 的染色质从 A-485 样品（步骤 3.3.14）转移到两个 DNA 声波管（每个 130 μL）。
    3. 使用以下声波器设置将DNA声波化为大约150-200个碱基对片段:峰值事件功率（W）为175，占空比为10%，每突发200个周期和430个治疗时间。
      注:不同型号的声波设置可能不同，可能需要调整设置，以实现适合不同细胞系的片段大小。
    4. 声波后将样品放在冰上。
    5. 使用移液器将声波染色质转移到 1.5 mL 管中，并在 4 °C 下以 10，000 x g 的离心机进行 10 分钟，以颗粒碎屑。
    6. 将上流液（含有声波染色质）移到新管中，然后丢弃碎屑。声波染色质可储存在-80°C。
  5. 染色质免疫沉淀（ChIP）
    注:有关步骤3.5 中IP 组原理图，请参阅补充协议 （ 架构图 3 ）。
    1. 测量步骤 3.4.6 中 DMSO 和 A-485 样品的声波染色质的蛋白质含量。蛋白质含量可以用成熟的协议34进行测量。
      注:为简单起见，该协议将假定蛋白质含量相等，并将使用100μL的声波染色质。否则，蛋白质含量需要以相等的体积在所有样品之间平衡。
    2. 将 DMSO 声波染色质移液 100 μL 到两个 1.5 mL 管（每个 100 μL）。滴管 400 μL 的 ChIP 稀释缓冲液（包含 1:1，000 稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒）到每个管，使总体积高达 500 μL。
    3. 将 A-485 声波染色质移液 100 μL 到两个 1.5 mL 管（每个 100 μL）。将400μL的ChIP稀释缓冲液（含1:1000稀释蛋白酶抑制剂鸡尾酒）到每个管中，使总体积达到500μL。
    4. 使用移液器，将免疫沉淀（IP）抗体（例如非特异性IgG控制或H3K27ac特异性抗体）添加到DMSO和A-485样品的相应管中:IP #1 DMSO染色质与IgG抗体（5-10μg）;IP #2 H3K27ac抗体（5-10 μg）的DMSO染色质;IP #3 A-485染色质与IgG抗体（5-10μg）;IP #4 A-485 染色质，具有 H3K27ac 抗体（5-10 μg）。
    5. 在每个管中加入20μL的蛋白质 A 磁珠。确保珠子重新暂停。
    6. 在4°C下将样品旋转一夜。
    7. 使用磁性分离器将蛋白质分解为磁性珠，然后取出上清液。不要打扰珠子。
    8. 用 500 μL 至 1 mL 的低盐洗涤缓冲液清洗珠子，并在 4 °C 下旋转 5 分钟。 快速旋转，使用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后取出上流水线。
    9. 用 500 μL 至 1 mL 的高盐洗液缓冲液清洗珠子，在 4 °C 下旋转 5 分钟。 快速旋转，使用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后取出上流水线。
    10. 用 500 μL 至 1 mL 的 LiCl 洗涤缓冲液清洗珠子，并在 4 °C 下旋转 5 分钟。 快速旋转，使用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后取出上流水线。
    11. 用 500 μL 至 1 mL 的 TE 缓冲液清洗珠子，并在 4 °C 下旋转 5 分钟。 执行快速旋转。将磁珠放在 TE 缓冲器中，直到步骤 3.5.14。
    12. 从冰柜中取出输入样品（从步骤 3.5.2 和 3.5.3）中，并保持在冰上。
    13. 解冻蛋白酶K的等分。
    14. 使用磁性分离器将珠子取出，然后从磁珠上取出TE缓冲液（从步骤3.5.11中）。
    15. 在每个样品中加入100μL ChIP洗脱缓冲液=1μL蛋白酶K，包括输入样品。使用热循环器在62°C下摇动样品2小时。
    16. 2小时后，使用热循环器将样品加热至95°C10分钟。
    17. 将样品冷却至室温。
    18. 使用磁性分离器将上一个（包含感兴趣的DNA）转移到新的1.5 mL管中。
    19. 使用标准的 PCR 清理套件净化 DNA。
    20. 纯化DNA可储存在-20°C，可作为标准qPCR协议的模板。按照制造商协议运行 qPCR。
  6. ChIP-qPCR 数据分析
    注:分析ChIP-qPCR结果的两种常用方法是在IgG抗体和1%输入法上折叠富集。商业源为两种分析方法提供了出色的模板，可用于快速计算每个IP抗体/目标37的折叠富集。
    1. 要计算折叠富集和百分比输入，请复制并将每个抗体（非特异性IgG、IP H3K27ac抗体和1%输入）获得的qPCR数据中的+Ct值粘贴到分析模板中的相应区域中，折叠富集和产量百分比输入将自动填充。

结果

体外组蛋白乙酰转移酶（HAT）测定可用于探寻抑制p300 HAT活性的化合物对组蛋白基质。图 1A提供了 HAT 测定的实验原理图。Anacardic酸，一种已知的HATi3，38，在12.5-100μM的浓度范围内被用于此测定。3,在100μM时，甲酸下调节p300催化组蛋白乙酰化在组酮3，Lysines 9和18对控制DMSO处理（图1B，车道5对车道1）。这种测?...

讨论

莱辛乙酰转移酶（KATs）乙酰酸酯在组蛋白尾部和转录因子上有几个莱辛残留物，以调节基因转录2，3。2过去二十年的工作显示，KAT，如CBP/p300，PCAF和GCN5，与致癌转录因子相互作用，并有助于推动肿瘤生长在几个实体肿瘤类型4，5，9，15，16，17，18。,5,9,15

披露声明

作者没有利益冲突或披露。

致谢

这项工作得到了詹姆斯和埃丝特·金生物医学研究计划（6JK03和20K07）以及Bankhead-Coley癌症研究计划（4BF02和6BC03）、佛罗里达州卫生部、佛罗里达州乳腺癌基金会和UF健康癌症中心的赠款的支持。此外，我们要感谢扎卡里·奥斯金博士和安德里亚·林博士在出版过程中给予的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubeFisher Scientific05-408-129For all methods
10 cm dishSarstedt AG & Co.83.3902For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tipsFisher Scientific02-707-454For all Methods
1000 ul tipsCorning4846For all Methods
10X Glycine bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running BufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBSTFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plateCorning3513For Method 2
15 cm dishSarstedt AG & Co.83.3903For Method 3
15 ml conical tubeSanta Cruz Biotechnologysc-200249For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium AzideFor Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milkFor Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tipsCorning4844For all Methods
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gelThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXFor Methods 1 and 2
5X Assay bufferFor Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis bufferFor Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibodyCell Signaling Technology4771For Method 1
Acetyl-CoASigma-AldrichA2056for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)Cell Signaling TechnologyCST 8173antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)Cell Signaling TechnologyCST 9675antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibodyMillipore SigmaT5168For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acidCayman Chemical13144For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibodyCell Signaling Technology7076For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibodyJackson ImmunoResearch711-035-152For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography filmMIDSCIBX810For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating PlatformStovall Life Science Incorporatednot availableFor Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)HyCloneSH30072.03cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153for buffer preparation
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for SDS sample buffer preparation
CDTASpectrum Chemical125572-95-4For buffer preparation
cell scraperMillipore SigmaCLS3010For Method 3
ChIP dilution bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution BufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 CellsFor Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBECovaris520045Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicatorCovarisS220DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich41639for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815for SDS sample buffer preparation
DMEMCorning10-013-CVcell culture media
EDTAFisher ScientificBP120-1for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatusBio-rad1704070For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation KitMillipore Sigma17-10086For Method 3
FK228 (Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solutionSigma-AldrichF8775for cell fixation
glycerolFisher ScientificBP229-1For buffer preparation
glycineSigma-AldrichG7126for buffer preparation
HEPESSigma-Aldrich54457for buffer preparation
High salt wash bufferFor Method 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP SubstrateMillipore SigmaWBKLS0500For Methods 1 and 2
KClFisher ScientificBP366-500for buffer preparation
LiClSigma-AldrichL9650For buffer preparation
LiCl wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic SeparatorPromegaZ5341For use in Method 3
MethanolSigma-Aldrich494437For buffer preparation
Mini gel tankInvitrogenA25977For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaClFisher Scientific7647-14-5for buffer preparation
NaOHFisher ScientificS318-100for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgGBethyl LaboratoriesP120-101Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup KitQiagen28104For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100XCorning30-002-CIcell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CVFor Methods 2 and 3
PIPESSigma-Aldrich80635for buffer preparation
powdered milkNestle CarnationFor Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transferBio-radFor Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel runningBio-radFor Methods 1 and 2
Prestained Protein LadderThermo Fisher26616For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor CocktailSigma-AldrichPI8340for use in Method 3
Protein A Magentic BeadsNew England BioLabsS1425SFor use in Method 3
Proteinase KNew England BioLabsP8107SFor use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal ControllerMJ Research Inc.PTC-100For Method 1
PVDF Transfer MembraneMillipore SigmaIEVH00005For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1New England BioLabsM2503Sfor use in Method 1
Recombinant p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium AzideFisher Scientific26628-22-8For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500for buffer preparation
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich71725for SDS sample buffer preparation
Standard HeatblockVWR Scientific ProductsMPN: 949030For Methods 1 and 2
Table top centrifugeEppendorf5417RFor all methods
TE bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer bufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin ACayman Chemical58880-19-6HDAC Inhibitor for use in Method 2
TrisFisher ScientificBP152-5for buffer preparation
Triton X-100Sigma-AldrichT8787for buffer preparation
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processorKonica Minolta Medical & Graphic, Inc.SRX-101AFor Methods 1 and 2

参考文献

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. . Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020)
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020)
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

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