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Resumo

Inibidores de acetiltransferases de histona (HATs, também conhecidos como acetiltransferases de lisina), como CBP/p300, são potenciais terapêuticos para o tratamento do câncer. No entanto, são necessários métodos rigorosos para validar esses inibidores. Três métodos in vitro para validação incluem ensaios HAT com acetiltransferases recombinantes, imunoblotting para acetilação de histona na cultura celular, e ChIP-qPCR.

Resumo

Acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam acetilação de resíduos de lisesina em histones e outras proteínas para regular a dinâmica da cromatina e a expressão genética. Os TRTs, como o CBP/p300, estão sob intensa investigação como alvos terapêuticos devido ao seu papel crítico na tumorgênese de diversos cânceres. O desenvolvimento de novos inibidores de moléculas pequenas visando a função histone acetyltransferase (HAT) dos KATs é desafiador e requer ensaios robustos que podem validar a especificidade e potência dos inibidores potenciais.

Este artigo descreve um pipeline de três métodos que fornecem rigorosa validação in vitro para novos inibidores de HAT (HATi). Estes métodos incluem um ensaio hat do tubo de ensaio, ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI) e PCR quantitativo de imunoprecipitação de Chromatina (ChIP-qPCR). No ensaio hat, hats recombinantes são incubados com histones em uma reação de tubo de ensaio, permitindo acetilação de resíduos específicos de lisesina nas caudas de histona. Esta reação pode ser bloqueada por um HATi e os níveis relativos de acetilação de histona específica do local podem ser medidos através de imunoblotação. Os inibidores identificados no ensaio hat precisam ser confirmados no ambiente celular.

O ensaio chhai usa imunoblotting para tela para o novo HATi que atenua a robusta hiperacetilação de histones induzidos por um inibidor de histon deacetilase (HDACi). A adição de um HDACi é útil porque os níveis basais de acetilação de histona podem ser difíceis de detectar através da imunoblotação.

Os ensaios HAT e ChHAI medem as mudanças globais na acetilação de histona, mas não fornecem informações sobre acetilação em regiões genômicas específicas. Portanto, o ChIP-qPCR é usado para investigar os efeitos do HATi nos níveis de acetilação de histona em elementos regulatórios genéticos. Isso é realizado através da imunoprecipitação seletiva de complexos histono-DNA e análise do DNA purificado através de qPCR. Juntos, esses três ensaios permitem a validação cuidadosa da especificidade, potência e mecanismo de ação da nova HATi.

Introdução

As acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam a acetilação de resíduos de lisesina nas proteínas histona e não histona1,,2,,3,,4. Pesquisas recentes revelam que os KATs e sua função acetiltransferase podem promover o crescimento sólido do tumor4,5,6,7,8,9. Por exemplo, a proteína de ligação CREB (CBP)/p300 são dois KATs paralogos que regulam inúmeras vias de sinalização no câncer2,,3. CBP/p300 tem uma função de acetiltransferase de histona bem caracterizada (HAT) e catalisa histone 3 Lysine 27 acetilação (H3K27ac)2,,4,,5,10,,11, um marcador importante para melhoradores ativos, regiões promotoras e transcrição genética ativa12,,13,,14. CBP/p300 servem como co-ativadores críticos para vias de sinalização pró-crescimento em tumores sólidos, ativando a transcrição de oncogenes através da acetilação de histones e outros fatores de transcrição4,,9,,15,,16,,17,18. Devido ao seu papel na progressão do tumor, CBP/p300 e outros KATs estão sob investigação para o desenvolvimento de novos inibidores que bloqueiam sua função oncogênica4,,5,6,,7,,8,,9,,18,,19,20. A-485 e GNE-049 representam duas tentativas bem sucedidas de desenvolver inibidores potentes e específicos para CBP/p3004,9. Inibidores adicionais estão atualmente sob investigação para CBP/p300 e outros KATs.

A qualidade dos inibidores kat previamente descritos (KATi) está sendo questionada, com muitos inibidores mostrando efeitos-alvo e má caracterização21. Portanto, a caracterização rigorosa e validação de novos candidatos a medicamentos é essencial para o desenvolvimento de sondas químicas de alta qualidade. Delineados aqui estão três protocolos que formam um pipeline para triagem e validando rigorosamente a potência e especificidade do novo KATi, com foco específico em inibir a função HAT (HATi) de KATs. CBP/p300 e seus inibidores são usados como exemplos, mas esses protocolos podem ser adaptados para outros KATs que possuem uma função HAT7.

O primeiro protocolo é um ensaio in vitro de acetiltransferase de histona (HAT) que utiliza p300 recombinantes purificados e histones em uma reação controlada do tubo de ensaio. Este ensaio é simples de executar, é econômico, pode ser usado para tela compostos em uma configuração de baixo rendimento, e não requer materiais radioativos. Neste protocolo, p300 recombinante catalisa acetilação de lise em caudas de histona durante um breve período de incubação e os níveis de acetilação de histona são medidos usando procedimentos padrão de imunoblotação. A reação enzimática pode ser realizada na presença ou ausência de inibidores CBP/p300 para testar compostos que reduzem a acetilação de histona. Além disso, o ensaio HAT pode ser usado para verificar se novos compostos são seletivos para CBP/p300, avaliando sua atividade contra outros KATs purificados, como o PCAF. O ensaio hat é um excelente ponto de partida para investigar novos inibidores devido à sua simplicidade, baixo custo e capacidade de determinar a potência/seletividade de um inibidor. De fato, este protocolo é frequentemente usado na literatura como uma tela in vitro5,10. No entanto, os inibidores identificados no ensaio hat nem sempre são eficazes na cultura celular porque uma reação do tubo de ensaio é muito mais simples do que um sistema celular vivo. Portanto, é essencial caracterizar ainda mais os inibidores nos experimentos de cultura celular22,23.

O segundo protocolo no pipeline é o ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI). Este ensaio baseado em célula utiliza inibidores de histona deacetilase (HDACi) como uma ferramenta para hiperacetilar histones em cromatina antes da co-incubação com um HATi24. A acetilação de histona basal pode ser baixa na cultura celular, dificultando a sondagem para via imunoblotação sem a adição de um HDACi para aumentar a acetilação. O objetivo do ensaio chhai é identificar o novo HATi que pode atenuar o aumento da acetilação de histona causada pela inibição do HDAC. As vantagens deste ensaio incluem seu baixo custo, relativa facilidade de execução, e o uso de células na cultura, o que proporciona mais relevância fisiológica do que o ensaio hat do tubo de ensaio. Semelhante ao ensaio hat, este protocolo usa imunoblotting padrão para coleta de dados.

Os ensaios HAT e ChHAI fornecem dados sobre a potência de novos compostos para inibir a acetilação global de histona, mas não fornecem informações sobre como esses compostos afetam modificações em regiões genômicas específicas. Portanto, o protocolo final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) é um experimento de cultura celular que investiga interações DNA-proteína em regiões específicas do genoma. No protocolo ChIP, a cromatina é interligada para preservar as interações DNA-proteína. A cromatina é então extraída das células e o complexo DNA-proteína sofre imunoprecipitação seletiva para a proteína de interesse (por exemplo, usando um anticorpo específico para H3K27ac). O DNA é então purificado e analisado usando qPCR. Por exemplo, o ChIP-qPCR pode ser usado para determinar se um novo HATi diminui a acetilação de histona em oncogenes individuais, como Cyclin D125. Embora o ChIP-qPCR seja uma técnica comum usada no campo, pode ser difícil otimizar4,,10,26. Este protocolo fornece dicas para evitar possíveis armadilhas que podem ocorrer durante a realização do procedimento ChIP-qPCR e inclui verificações de controle de qualidade que devem ser realizadas nos dados.

Quando utilizados em conjunto, esses três protocolos permitem a caracterização rigorosa e validação do novo HATi. Além disso, esses métodos oferecem muitas vantagens porque são fáceis de executar, relativamente baratos e fornecem dados sobre acetilação de histona global e regional.

Protocolo

1. Ensaio in vitro HAT

  1. Preparação de buffer
    NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter receitas de tampão.
    1. Prepare 5x tampão de ensaio e 6x Sulfato de Dodecyl de Sódio (SDS) e armazene a -20 °C. Aliquot SDS em alíquotas de 1 mL.
    2. Prepare o tampão de corrida de gel SDS 10x e 10x TBST e armazene à temperatura ambiente.
    3. Prepare 1x tampão de transferência e armazene a 4 °C.
      ATENÇÃO: Verifique a ficha técnica de segurança de todos os produtos químicos utilizados neste protocolo. SDS, DTT e azul bromofenol são tóxicos e não devem ser ingeridos, inalados ou expostos à pele ou aos olhos. Consulte a ficha técnica de segurança para obter os procedimentos adequados de manuseio. Por favor, use uma capa de fumaça química para manusear produtos químicos perigosos.
  2. Reação hat
    NOTA: O ácido anacárico é um inibidor p300 conhecido3 e é usado como exemplo para demonstrar como o ensaio hat pode identificar novos inibidores p300. Consulte o Protocolo Suplementar ( Esquema1)para um esquema da etapa 1.2.1.
    1. Prepare a seguinte reação enzimática em um tubo PCR de 0,2 mL: 2 μL de tampão de ensaio 5x, 1 μL de p300 purificado (0,19 μg/μL), 1 μL de ácido anacárico (HATi) ou controle DMSO diluído em tampão de ensaio 1x e 2 μL de ddH2O. Pré-incubar esta mistura por 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 3 μL de acetil-CoA de 100 μM e 1 μL de H3.1 purificado (0,2 μg/μL) à reação.
    2. Incubar a mistura completa de reação a 30 °C por 1 h em um ciclo térmico PCR.
    3. Adicione 2-mercaptoetanol a uma proporção de 1:10 para o buffer de amostra SDS de 6x.
    4. Remova amostras do ciclor térmico PCR e adicione 2 μL de SDS de 6x (com 2 mercaptoetanol adicionado) à mistura de reação.
      ATENÇÃO: O 2-mercaptoetanol é tóxico e deve ser usado dentro de uma capa de fumaça química. Consulte a ficha técnica de segurança para o manuseio adequado.
    5. Aqueça amostras a 95 °C por 5 minutos em um bloco de calor e esfrie no gelo. Armazene as amostras a -20 ou -80 °C ou realize eletroforese de gel e imunoblotting conforme detalhado abaixo.
  3. Eletroforese em gel e imunoblotting
    NOTA: Se não estiver familiarizado com eletroforese de gel e imunoblotting, consulte este procedimento padrão27 para obter detalhes adicionais sobre como executar as etapas 1.3.1-1.3.17. Informações adicionais podem ser encontradas aqui28,29,30,31,32,33.
    1. Pipeta 10 μL de amostras (a partir da etapa 1.2.5.) para os poços de um gel de poliacrilamida de 4-20% gradiente. Pipeta 5 μL de escada proteica em um dos poços como referência de peso molecular. Execute o gel a 120 V por 90 min usando um tanque de gel.
    2. Transfira o gel para uma membrana de difluoreto de polivinilidene (PVDF) a 100 V por 70 min usando um tanque de transferência.
    3. Remova a membrana do aparelho de transferência e coloque-a em um recipiente plástico. Bloqueie a membrana adicionando 1x TBST (contendo 5% de leite) ao recipiente e agite suavemente por 1h à temperatura ambiente.
    4. Remova o 1x TBST da etapa 1.3.3. Incubar a membrana durante a noite com anticorpos acetilais selecionados no local (por exemplo, H3K18ac ou anticorpos primários H3K27ac a uma diluição de 1:5.000 em 1x TBST contendo 5% de leite) a 4 °C com agitação suave.
    5. Remova a solução de anticorpos primária. Lave a membrana 2x com 1x TBST (sem leite) em temperatura ambiente com agitação suave por 15 minutos cada lavagem.
    6. Diluir o anticorpo secundário em 1:20.000 em 1x TBST (contendo 5% de leite) e incubar a membrana por 1h à temperatura ambiente com agitação suave.
    7. Remova a solução de anticorpos secundários. Lave a membrana 2x com 1x TBST (sem leite) em temperatura ambiente com agitação suave por 15 minutos cada lavagem.
    8. Escorra o 1x TBST da membrana. Misture a solução de peróxido de substrato HRP e a solução de luminol substrato HRP em uma proporção de 1:1 (1 mL de cada) e pipeta 2 mL da solução combinada para a superfície da membrana.
    9. Incubar a solução com a membrana por 5 minutos em temperatura ambiente.
    10. Escorra o substrato de quimiluminescente em excesso da membrana em uma toalha de papel e coloque a membrana em plástico dentro de um porta-fitas de raio-x.
    11. Mude-se para uma sala escura dedicada ao processamento de filme de raios-X. Exponha a membrana a uma filme de raio-x colocando o filme em cima da membrana e fechando o por 30 s.
      NOTA: O tempo de contato entre o filme e a membrana deve ser determinado experimentalmente. Sinais fortes precisarão de exposições curtas (segundos) e sinais mais fracos podem precisar de exposições mais longas.
    12. Remova o filme de raio-x do e processe o filme executando-o através de um processador de filme de raio-x. Consulte os manuais do fabricante para obter instruções específicas sobre como processar a filme de raio-x.
    13. Remova a membrana do plástico e lave-a com ddH2O por 5 minutos à temperatura ambiente com agitação suave.
    14. Incubar a membrana com 0,2 M NaOH por 5 min a temperatura ambiente com agitação suave.
    15. Lave a membrana com ddH2O por 5 min a temperatura ambiente com agitação suave.
    16. Bloqueie a membrana adicionando 1x TBST (contendo 5% de leite) ao recipiente e agite suavemente por 1h à temperatura ambiente.
    17. Adicione a próxima diluição de anticorpos primários (por exemplo, teste para H3K27ac se o primeiro anticorpo usado for H3K18ac) e agite durante a noite a 4 °C. Repetição de passos 1.3.4-1.3.17 até que todas as sondas de anticorpos sejam concluídas.

2. Ensaio chhai

  1. Tratamentos in vitro de medicamentos e análise de histones acetilados
    NOTA: A-485 é um p300 HATi potente e bem caracterizado2,4 . Este inibidor será utilizado nos ensaios restantes devido à sua eficácia e especificidade na cultura celular. MS-275 (Entinostat)24 é um HDACi que aumenta significativamente os níveis de acetilação de histona e é usado para facilitar a detecção de sondas de acetilação com imunoblotação padrão. Ver Protocolo Suplementar (Esquema 2), para um esquema das diluições da droga utilizadas na etapa 2.1.
    1. Semente 100.000 células MCF-7 em uma placa de 12 poços e permitem que as células cresçam até 80-90% de confluência em 1 mL de meio de cultura celular. Marque os poços para o seguinte design experimental: bem 1: controle DMSO (ponto de referência); bem 2: A-485 (3 μM); bem 3: A-485 (10 μM); bem 4: MS-275 (3 μM); bem 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); bem 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      NOTA: Para cultivar células MCF-7, use mídia DMEM completa e permita que as células cresçam a 37 °C com 5% de CO2. Consulte a Tabela 1 para obter a receita completa do DMEM.
    2. Às 24 horas após a semeadura, pipeta 4 mL de mídia DMEM completa para um tubo cônico estéril de 15 mL. Pipeta 2 μL de MS-275 (6 mM em DMSO) para os 4 mL de médio para uma concentração final de 3 μM MS-275.
    3. Pipeta 2 μL de DMSO a 4 mL de meio em um tubo cônico separado estéril de 15 mL.
      ATENÇÃO: Verifique a ficha de dados de segurança para obter o manuseio adequado do DMSO. Alguns tipos de luvas não são classificados para o manuseio de DMSO.
    4. Aspire o meio de cultura celular dos poços 4-6 e pipeta 1 mL de 3 μM MS-275 em média (passo 2.1.2) para cada poço. Descarte MS-275 diluído nãouado.
    5. Aspire o meio de cultura celular dos poços 1-3 e pipeta 1 mL de DMSO diluído (passo 2.1.3) para cada poço. Descarte DMSO diluído nãoutado.
    6. Devolva as células à incubadora e incubar por 4h para permitir o acúmulo de histonas acetiladas em células expostas à MS-275 (poços 4-6).
      NOTA: MS-275 é um HDACi e causará hiperacetilação histona24. Esta pré-incubação de 4h é necessária para permitir que o MS-275 induza a hiperacetilação antes da adição de A-485, que reduz a acetilação histona2,4.
    7. Após 4h de incubação com MS-275, prepare as seguintes diluições em tubos estéreis separados de 1,5 mL por tubulação: 1,0 μL de DMSO a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de DMSO e 0,5 μL A-485 (6 mM) a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de DMSO e 0,5 μL de A-485 (20 mM) a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de DMSO e 0,5 μL de MS-275 (6 mM) a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de A-485 (6 mM) e 0,5 μL de MS-275 (6 mM) a 1 mL de mídia DMEM; 0,5 μL de A-485 (20 mM) e 0,5 μL de MS-275 (6 mM) a 1 mL de mídia DMEM.
    8. Aspirar o meio de cultura celular dos poços 1-6 e pipeta 1 mL de diluição 1 a poço 1, diluição 2 a poço 2, diluição 3 a poço 3, diluição 4 a poço 4, diluição de 5 a poço 5, e diluição 6 a poço 6.
      NOTA: Uma regra geral é equilibrar o conteúdo DMSO (solvente) entre grupos experimentais e não exceder 0,1% de teor de DMSO na cultura celular para evitar toxicidade celular e mudanças na proliferação.
    9. Devolva as células à incubadora e cultura por 20 h.
    10. Após 20 h, aspire o meio de cultura celular dos poços 1-6.
    11. Lave as células tubondo 1 mL de PBS para poços 1-6. Aspire a PBS.
    12. Adicione 100 μL de 1x tampão de lise passiva (ver Tabela 1) aos poços 1-6. Armazene a placa de cultura celular (com amostras em tampão de lise passiva) a −80 °C durante a noite para congelamento e lise das células.
      ATENÇÃO: Verifique a ficha de dados de segurança de todos os produtos químicos antes de fazer buffers. O CDTA pode causar sérios danos oculares e irritação.
    13. Descongele amostras em temperatura ambiente com agitação suave por 10 minutos. Transfira amostras para separar tubos de 1,5 mL e coloque imediatamente no gelo.
    14. Meça a concentração proteica de cada amostra. A concentração de proteínas pode ser determinada usando vários protocolos bem estabelecidos34.
    15. Concentração de proteína equilibrada entre as amostras 1-6 (em volume igual) utilizando 1x tampão de lise passiva para diluir, conforme necessário.
    16. Adicione 2-mercaptoetanol a uma proporção de 1:10 para 6x tampão de amostra SDS.
    17. Adicione 6x tampão de amostra SDS com 2 mercaptoetanol às amostras 1-6 a uma concentração final de 1x tampão de amostra SDS.
    18. Aqueça amostras a 95 °C por 5 minutos em um bloco de calor e esfrie no gelo. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C ou -80 °C até o passo 2.1.19.
    19. Pipeta um volume contendo 30 μg de proteína para amostras 1-6 para os poços em um gel de poliacrilamida de 4-20% gradiente. Realizar o procedimento de imunoblotação de acordo com o protocolo descrito no Protocolo 1.

3. ChIP-qPCR

NOTA: O protocolo abaixo é descrito para inibidores do p300 como exemplo.

  1. Preparação de buffer
    NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter receitas de tampão. As etapas gerais do protocolo ChIP (por exemplo, receitas tampão, tempos de lavagem e tempos de centrifugação) abaixo são modificadas e adaptadas das recomendações do fabricante de um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) e da literatura35,36.
    1. Prepare o tampão de diluição chip, tampão de inchaço dos núcleos, tampão de lavagem de sal baixo, tampão de lavagem de sal alto, tampão de lavagem LiCl e tampão DE TE. Armazenar a 4 °C.
    2. Prepare o tampão de lise SDS, o tampão de glicina de 10x e o tampão de elução ChIP. Armazene à temperatura ambiente.
      ATENÇÃO: Verifique a ficha de dados de segurança de todos os produtos químicos antes de fazer buffers para garantir o manuseio adequado.
  2. Tratamento medicamentoso
    NOTA: Consulte o Protocolo Suplementar ( Esquema3) para um esquema das diluições de medicamentos utilizadas na etapa 3.2.
    1. Células seed MCF-7 em dois pratos de cultura de 15 cm e crescer células para 90% de confluência em 12 mL do meio DMEM completo. Marque os pratos para o seguinte design experimental: Prato 1: Controle DMSO (ponto de referência); Prato 2: A-485 (3 μM).
      NOTA: Para cultivar células MCF-7, use mídia DMEM completa e cresça a 37 °C com 5% de CO2. Consulte a Tabela 1 para obter a receita completa do DMEM.
    2. Em um tubo cônico estéril de 15 mL, pipeta 12 mL de mídia DMEM e pipeta 6 μL de DMSO. Misture bem.
    3. Em um tubo cônico estéril separado de 15 mL, pipeta 12 mL de mídia DMEM e pipeta 6 μL de A-485 (6 mM em DMSO) para obter uma concentração final de 3 μM A-485. Misture bem.
    4. Aspire a mídia do Prato 1 e 2.
    5. Adicione os 12 mL de DMSO diluídos no DMEM (etapa 3.2.2.) ao Prato 1.
    6. Adicione os 12 mL de 3 μM A-485 em DMEM (etapa 3.2.3.) ao Prato 2.
    7. Devolva os pratos da cultura celular à incubadora e incubar por 24 horas.
  3. Fixação celular
    1. Pipeta 330 μL (27,5 μL por mL) de 37% de formaldeído para a mídia completa e girar suavemente a placa para misturar.
      ATENÇÃO: O formaldeído é tóxico. Consulte a ficha técnica de segurança para obter os procedimentos adequados de manuseio.
    2. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
    3. Pipeta 2 mL de 10x de glicina na placa e redemoinho para misturar.
    4. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
    5. Após a incubação, coloque pratos no gelo e descongele uma alíquota de coquetel inibidor de protease.
    6. Prepare as seguintes soluções para as amostras DMSO e A-485 utilizando os buffers preparados na etapa 3.1.
      1. 2 mL de PBS com diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease
      2. 1 mL de tampão de inchaço de núcleos com diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease
      3. 0,5 mL de tampão de lise SDS com diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease
    7. Aspire a mídia dos pratos de cultura celular e lave as células duas vezes com 15 mL de PBS frio.
    8. Pipeta 2 mL de PBS com o coquetel inibidor de protease (passo 3.3.6.1) aos pratos de cultura celular. Levante as células em solução usando um raspador de células.
    9. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga. Colete células remanescentes com PBS adicional, se necessário.
    10. Gire tubos a 800 x g a 4 °C por 5 minutos para pelotar as células.
    11. Aspire o supernasal e pipeta 1 mL de tampão de inchaço de núcleos com o coquetel inibidor de protease (passo 3.3.6.2) à pelota. Resuspend a pelota e incubar no gelo por 10 minutos.
    12. Centrifugar os tubos a 2.700 x g a 4 °C por 5 min para os núcleos de pelotas.
    13. Aspire o supernasal e pipeta 0,5 mL de tampão de lise SDS com o coquetel inibidor de protease (passo 3.3.6.3) à pelota. Resuspend a pelota e incubar no gelo por 10 minutos.
    14. Armazene as amostras de cromatina a -80 °C até o passo 3.4.1 ou proceda imediatamente para a etapa 3.4.
  4. Sônica de DNA
    1. Transfira 130 μL de cromatina da amostra DMSO (etapa 3.3.14) para dois tubos de sônica de DNA usando uma pipeta (130 μL cada).
    2. Transfira 130 μL de cromatina da amostra A-485 (etapa 3.3.14) para dois tubos de sônica de DNA usando uma pipeta (130 μL cada).
    3. Sonicate o DNA para cerca de 150-200 fragmentos de par de base usando as seguintes configurações de sonicator: Peak Incident Power (W) de 175, Duty Factor de 10%, 200 Ciclos por Explosão e 430 s tempo de tratamento.
      NOTA: As configurações de sônica podem diferir entre modelos e as configurações podem precisar ser ajustadas para alcançar o tamanho adequado do fragmento para diferentes linhas celulares.
    4. Mantenha amostras no gelo após a sônicação.
    5. Transfira a cromatina sônica para um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta e centrífuga a 10.000 x g a 4 °C por 10 minutos para pelotas de detritos.
    6. Pipeta o sobrenante (contém cromatina sônica) a um novo tubo e descartar os detritos. A cromatina sônica pode ser armazenada a -80 °C.
  5. Imunoprecipitação de cromatina (ChIP)
    NOTA: Consulte o Protocolo Suplementar ( Esquema3) para um esquema dos grupos IP na Etapa 3.5.
    1. Meça o teor proteico da cromatina sônica para as amostras DMSO e A-485 da Etapa 3.4.6. O teor de proteínas pode ser medido usando protocolos bem estabelecidos34.
      NOTA: Para simplificar, este protocolo assumirá que o teor de proteínas é igual e serão utilizados 100 μL de cromatina sônica. Caso contrário, o conteúdo proteico precisará ser equilibrado entre todas as amostras em um volume igual.
    2. Pipeta 100 μL de cromatina sônica DMSO para dois tubos de 1,5 mL (100 μL cada). Pipeta 400 μL de tampão de diluição chIP (contendo uma diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease) para cada tubo para trazer volume total até 500 μL. Remova 5 μL da solução de um dos tubos e armazene a -20 °C como Entrada DMSO.
    3. Pipeta 100 μL de cromatina sônica A-485 para dois tubos de 1,5 mL (100 μL cada). Pipeta 400 μL de tampão de diluição chIP (contendo uma diluição de 1:1000 do coquetel inibidor de protease) para cada tubo para trazer volume total até 500 μL. Remova 5 μL da solução de um dos tubos e armazene a -20 °C como Entrada A-485.
    4. Usando uma pipeta, adicione o anticorpo de imunoprecipitação (IP) (por exemplo, controle IgG não específico ou anticorpo específico H3K27ac) aos tubos correspondentes para as amostras DMSO e A-485: IP #1 cromatina DMSO com anticorpo IgG (5-10 μg); IP #2 cromatina DMSO com anticorpo H3K27ac (5-10 μg); IP #3 cromatina A-485 com anticorpo IgG (5-10 μg); IP #4 cromatina A-485 com anticorpo H3K27ac (5-10 μg).
    5. Adicione 20 μL de proteína A contas magnéticas a cada tubo. Certifique-se de que as contas estão bem resuspendidas.
    6. Gire as amostras durante a noite a 4 °C.
    7. Pellte a proteína Uma conta magnética usando um separador magnético e remova o supernasce. Não perturbe as contas.
    8. Lave as contas com 500 μL a 1 mL do tampão de lavagem de sal baixo e gire por 5 min a 4 °C. Faça um giro rápido para baixo, pelota as contas usando um separador magnético, e remova o supernatante.
    9. Lave as contas com 500 μL a 1 mL do tampão de lavagem de sal alto e gire por 5 min a 4 °C. Faça um giro rápido para baixo, pelota as contas usando um separador magnético, e remova o supernatante.
    10. Lave as contas com 500 μL a 1 mL do tampão de lavagem LiCl e gire por 5 min a 4 °C. Faça um giro rápido para baixo, pelota as contas usando um separador magnético, e remova o supernatante.
    11. Lave as contas com 500 μL a 1 mL de tampão te e gire por 5 min a 4 °C. Faça uma rápida rotação para baixo. Mantenha as contas no buffer TE até o passo 3.5.14.
    12. Remova as amostras de entrada (da etapa 3.5.2 e 3.5.3) do congelador e mantenha no gelo.
    13. Descongele uma alíquota de Proteinase K.
    14. Pelota as contas usando um separador magnético e remova o tampão te das contas (a partir da etapa 3.5.11).
    15. Adicione 100 μL chIP elution buffer + 1 μL de Proteinase K a cada amostra, incluindo as amostras de entrada. Incubar amostras com agitação a 62 °C por 2 h usando um termociclador.
    16. Após 2h, aqueça amostras a 95 °C por 10 minutos usando um termociclador.
    17. Esfrie as amostras à temperatura ambiente.
    18. Contas magnéticas de pelotas usando um separador magnético e transferem supernascentes (contém o DNA de interesse) para um novo tubo de 1,5 mL.
    19. Purifique o DNA usando um kit de limpeza PCR padrão.
    20. O DNA purificado pode ser armazenado a -20 °C e pode ser usado como modelos em protocolos qPCR padrão. Siga os protocolos do fabricante para executar qPCR.
  6. Análise de dados chIP-qPCR
    NOTA: Dois métodos comuns para analisar os resultados do ChIP-qPCR são o enriquecimento de dobras sobre o anticorpo IgG e o método de entrada de 1%. Um excelente modelo para ambos os métodos de análise é fornecido por uma fonte comercial pode ser usado para calcular rapidamente o enriquecimento de dobras para cada anticorpo IP/alvo de interesse37.
    1. Para calcular o enriquecimento do fold e % Entrada, copie e cole os valores ΔCt dos dados qPCR obtidos para cada anticorpo (IgG não específico, o anticorpo IP H3K27ac e o Insumo de 1%) na região correspondente no modelo de análise e a Entrada de Enriquecimento e Rendimento do Fold será preenchida automaticamente.

Resultados

O ensaio in vitro histone acetyltransferase (HAT) pode ser usado para sondar compostos que inibem a atividade p300 HAT em direção a um substrato de histona. A Figura 1A fornece um esquema experimental para o ensaio hat. O ácido anacácárico, um conhecido HATi3,38, foi utilizado neste ensaio em uma faixa de concentração de 12,5-100 μM. A 100 μM, o ácido anacárico diminui a p300 catalisada acetilação histona em Histone 3, L...

Discussão

Acetiltransferases de lysina (KATs) acetilamam vários resíduos de lisesina nas caudas de histona e fatores de transcrição para regular a transcrição genética2,3. O trabalho nas últimas duas décadas revelou que os KATs, como CBP/p300, PCAF e GCN5, interagem com fatores de transcrição oncogênica e ajudam a impulsionar o crescimento do tumor em vários tipos de tumores sólidos4,5,,

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse ou divulgações para fazer.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa de Pesquisa Biomédica James e Esther King (6JK03 e 20K07), e do Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 e 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation e UF Health Cancer Center. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Dr. Zachary Osking e à Dra.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubeFisher Scientific05-408-129For all methods
10 cm dishSarstedt AG & Co.83.3902For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tipsFisher Scientific02-707-454For all Methods
1000 ul tipsCorning4846For all Methods
10X Glycine bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running BufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBSTFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plateCorning3513For Method 2
15 cm dishSarstedt AG & Co.83.3903For Method 3
15 ml conical tubeSanta Cruz Biotechnologysc-200249For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium AzideFor Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milkFor Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tipsCorning4844For all Methods
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gelThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXFor Methods 1 and 2
5X Assay bufferFor Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis bufferFor Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibodyCell Signaling Technology4771For Method 1
Acetyl-CoASigma-AldrichA2056for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)Cell Signaling TechnologyCST 8173antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)Cell Signaling TechnologyCST 9675antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibodyMillipore SigmaT5168For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acidCayman Chemical13144For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibodyCell Signaling Technology7076For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibodyJackson ImmunoResearch711-035-152For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography filmMIDSCIBX810For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating PlatformStovall Life Science Incorporatednot availableFor Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)HyCloneSH30072.03cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153for buffer preparation
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for SDS sample buffer preparation
CDTASpectrum Chemical125572-95-4For buffer preparation
cell scraperMillipore SigmaCLS3010For Method 3
ChIP dilution bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution BufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 CellsFor Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBECovaris520045Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicatorCovarisS220DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich41639for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815for SDS sample buffer preparation
DMEMCorning10-013-CVcell culture media
EDTAFisher ScientificBP120-1for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatusBio-rad1704070For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation KitMillipore Sigma17-10086For Method 3
FK228 (Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solutionSigma-AldrichF8775for cell fixation
glycerolFisher ScientificBP229-1For buffer preparation
glycineSigma-AldrichG7126for buffer preparation
HEPESSigma-Aldrich54457for buffer preparation
High salt wash bufferFor Method 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP SubstrateMillipore SigmaWBKLS0500For Methods 1 and 2
KClFisher ScientificBP366-500for buffer preparation
LiClSigma-AldrichL9650For buffer preparation
LiCl wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic SeparatorPromegaZ5341For use in Method 3
MethanolSigma-Aldrich494437For buffer preparation
Mini gel tankInvitrogenA25977For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaClFisher Scientific7647-14-5for buffer preparation
NaOHFisher ScientificS318-100for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgGBethyl LaboratoriesP120-101Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup KitQiagen28104For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100XCorning30-002-CIcell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CVFor Methods 2 and 3
PIPESSigma-Aldrich80635for buffer preparation
powdered milkNestle CarnationFor Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transferBio-radFor Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel runningBio-radFor Methods 1 and 2
Prestained Protein LadderThermo Fisher26616For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor CocktailSigma-AldrichPI8340for use in Method 3
Protein A Magentic BeadsNew England BioLabsS1425SFor use in Method 3
Proteinase KNew England BioLabsP8107SFor use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal ControllerMJ Research Inc.PTC-100For Method 1
PVDF Transfer MembraneMillipore SigmaIEVH00005For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1New England BioLabsM2503Sfor use in Method 1
Recombinant p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium AzideFisher Scientific26628-22-8For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500for buffer preparation
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich71725for SDS sample buffer preparation
Standard HeatblockVWR Scientific ProductsMPN: 949030For Methods 1 and 2
Table top centrifugeEppendorf5417RFor all methods
TE bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer bufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin ACayman Chemical58880-19-6HDAC Inhibitor for use in Method 2
TrisFisher ScientificBP152-5for buffer preparation
Triton X-100Sigma-AldrichT8787for buffer preparation
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processorKonica Minolta Medical & Graphic, Inc.SRX-101AFor Methods 1 and 2

Referências

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