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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Gli inibitori dei l'acetiltransferasi dell'istone (HAT, noto anche come lisina acetiltransferasi), come CBP/p300, sono potenziali terapie per il trattamento del cancro. Tuttavia, sono necessari metodi rigorosi per convalidare questi inibitori. Tre metodi in vitro per la convalida includono i saggi HAT con acetiltransferasi ricombinanti, l'immunoblotting per l'acetilazione degli istoni nella coltura cellulare e ChIP-qPCR.

Abstract

L'acetiltransferasi della lniina (KAT) catalizzare l'acetilazione dei residui di litina sugli istoni e su altre proteine per regolare la dinamica della cromatina e l'espressione genica. I T-A, come il CBP/p300, sono oggetto di un'intensa indagine in quanto obiettivi terapeutici a causa del loro ruolo critico nella tumorigenesi di diversi tipi di cancro. Lo sviluppo di nuovi inibitori di piccole molecole che prendono di mira la funzione dell'acetiltransferasi istone (HAT) dei KAT è impegnativo e richiede robusti saggi in grado di convalidare la specificità e la potenza dei potenziali inibitori.

Questo articolo descrive una pipeline di tre metodi che forniscono una rigorosa convalida in vitro per i nuovi inibitori HAT (HATi). Questi metodi includono un test tube di prova HAT, chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) saggio, e Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). Nel saggio HAT, i TEST ricombinanti vengono incubati con istoni in una reazione in provetta, consentendo l'acetilazione di specifici residui di litina sulle code istonese. Questa reazione può essere bloccata da un HATi e i livelli relativi di acetilazione istone specifica del sito possono essere misurati tramite immunoblotting. Gli inibitori identificati nel saggio HAT devono essere confermati nell'ambiente cellulare.

Il saggio ChHAI utilizza l'immunoblotting per lo screening per i nuovi HATi che attenuano la robusta iperacetilazione degli istoni indotti da un inibitore della deacetilase istonea (HDACi). L'aggiunta di un HDACi è utile perché i livelli basali di acetilazione istone può essere difficile da rilevare tramite immunoblotting.

I saggi HAT e ChHAI misurano i cambiamenti globali nell'acetilazione degli itoni, ma non forniscono informazioni sull'acetilazione in specifiche regioni genomiche. Pertanto, ChIP-qPCR viene utilizzato per studiare gli effetti di HATi sui livelli di acetilazione degli itoni a elementi regolatori genici. Ciò si ottiene attraverso l'immunoprecipizione selettiva dei complessi istone-DNA e l'analisi del DNA purificato attraverso il qPCR. Insieme, questi tre saggi permettono un'attenta convalida della specificità, della potenza e del meccanismo d'azione del nuovo HATi.

Introduzione

L'acetiltransferasi di l'acetilsina (KAT) catalizzare l'acetilazione dei residui di lino sia sulle proteine istonesine che su proteine non istonese1,2,3,4. Recenti ricerche rivelano che i KAT e la loro funzione di acetiltransferase possono promuovere la crescita del tumoresolido 4,5,6,7,8,9. Ad esempio, la proteina legante CREB (CBP)/p300 sono due KA paralogo che regolano numerose vie di segnalazione nelcancro 2,3. CBP/p300 hanno una funzione acetiltransferasi istone ben caratterizzata (HAT) e catalizzare Histone 3 Lysine 27 acetilazione (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marcatore importante per potenziatori attivi, regioni promotori e trascrizione genica attiva12,13,14. CBP/p300 servono come co-attivatori critici per le vie di segnalazione pro-crescita nei tumori solidi attivando la trascrizione degli oncogeni attraverso l'acetilazione degli istoni e altri fattori di trascrizione4,9,15,16,17,18. A causa del loro ruolo nella progressione del tumore, CBP/p300 e altri KAT sono sotto inchiesta per lo sviluppo di nuovi inibitori che bloccano la loro funzione oncogenica4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 e GNE-049 rappresentano due tentativi riusciti di sviluppare inibitori potenti e specifici per CBP/p3004,9. Ulteriori inibitori sono attualmente in fase di esame per CBP/p300 e altri KAT.

La qualità degli inibitori KAT precedentemente descritti (KATi) viene messa in discussione, con molti inibitori che mostrano effetti bersaglio e scarsa caratterizzazione21. Pertanto, una rigorosa caratterizzazione e convalida di nuovi farmaci candidati è essenziale per lo sviluppo di sonde chimiche di alta qualità. Qui delineati sono tre protocolli che formano una pipeline per lo screening e convalidano rigorosamente la potenza e la specificità del nuovo KATi, con un focus specifico sull'inibizione della funzione HAT (HATi) dei KAT. CBP/p300 e i loro inibitori sono utilizzati come esempi, ma questi protocolli possono essere adattati per altri KAT che hanno una funzione HAT7.

Il primo protocollo è un saggio di acetiltransferasi istone in vitro (HAT) che utilizza p300 ricombinante purificato e istoni in una reazione controllata in provetta. Questo saggio è semplice da eseguire, è conveniente, può essere utilizzato per lo screening dei composti in un ambiente a bassa produttività e non richiede materiali radioattivi. In questo protocollo, il ricombinante p300 catalizza l'acetilazione della lliina sulle code dell'istone durante un breve periodo di incubazione e i livelli di acetilazione dell'istone vengono misurati utilizzando procedure standard di immunoblotting. La reazione enzimatica può essere eseguita in presenza o assenza di inibitori CBP/p300 per lo screening di composti che riducono l'acetilazione istonea. Inoltre, l'analisi HAT può essere utilizzata per verificare se i nuovi composti sono selettivi per CBP/p300 valutando la loro attività rispetto ad altri KAT purificati, come PCAF. Il test HAT è un ottimo punto di partenza per studiare nuovi inibitori grazie alla sua semplicità, basso costo e alla capacità di determinare la potenza/selettività di un inibitore. Infatti, questo protocollo è spesso utilizzato nella letteratura come uno schermo in vitro5,10. Tuttavia, gli inibitori identificati nel saggio HAT non sono sempre efficaci nella coltura cellulare perché una reazione in provetta è molto più semplice di un sistema cellulare vivente. Pertanto, è essenziale caratterizzare ulteriormente gli inibitori negli esperimenti di colturacellulare 22,23.

Il secondo protocollo in cantiere è il saggio Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI). Questo saggio basato su cellule utilizza inibitori della deacetilase istone (HDACi) come strumento per iperacetizzare gli istoni in cromatina prima della co-incubazione con un HATi24. L'acetilazione dell'istone basale può essere bassa nella coltura cellulare, rendendo difficile la ricerca tramite immunoblotting senza l'aggiunta di un HDACi per aumentare l'acetilazione. Lo scopo del saggio ChHAI è quello di identificare nuovi HATi che possono attenuare l'aumento dell'acetilazione istonea causata dall'inibizione dell'HDAC. I vantaggi di questo saggio includono il suo basso costo, relativa facilità di esecuzione, e l'uso di cellule in coltura, che fornisce più rilevanza fisiologica rispetto al test tube HAT saggio. Simile al saggio HAT, questo protocollo utilizza l'immunoblotting standard per la raccolta dei dati.

I test HAT e ChHAI forniscono dati sulla potenza dei nuovi composti per inibire l'acetilazione degli itoni globali, ma non forniscono informazioni su come questi composti influenzano le modifiche in specifiche regioni genomiche. Pertanto, il protocollo finale, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) è un esperimento di coltura cellulare che studia le interazioni DNA-proteina in specifiche regioni del genoma. Nel protocollo ChIP, la cromatina è interconnessa per preservare le interazioni DNA-proteina. La cromatina viene quindi estratta dalle cellule e il complesso DNA-proteina subisce un'immunoprecipizione selettiva per la proteina di interesse (ad esempio, utilizzando un anticorpo specifico per H3K27ac). Il DNA viene quindi purificato e analizzato utilizzando qPCR. Ad esempio, ChIP-qPCR può essere utilizzato per determinare se un nuovo haTi downregulates histone acetylation at individual oncogenes, come Cyclin D125. Mentre ChIP-qPCR è una tecnica comune utilizzata nel campo, può essere difficile ottimizzare4,10,26. Questo protocollo fornisce suggerimenti per evitare potenziali insidie che possono verificarsi durante l'esecuzione della procedura ChIP-qPCR e include controlli di qualità che devono essere eseguiti sui dati.

Se utilizzati insieme, questi tre protocolli consentono la rigorosa caratterizzazione e convalida del nuovo HATi. Inoltre, questi metodi offrono molti vantaggi perché sono facili da eseguire, relativamente a buon mercato e forniscono dati sull'acetilazione istonea globale e regionale.

Protocollo

1. Analisi HAT in vitro

  1. Preparazione del buffer
    NOTA: vedere la tabella 1 per le ricette del buffer.
    1. Preparare 5x buffer di analisi e 6x Sodio Dodecyl Sulfate (SDS) e conservare a -20 gradi centigradi. Aliquot SDS in aliquots da 1 mL.
    2. Preparare 10x SDS gel in esecuzione buffer e 10x TBST e memorizzare a temperatura ambiente.
    3. Preparare il buffer di trasferimento 1x e conservarlo a 4 gradi centigradi.
      CAUTION: Controllare la scheda dati di sicurezza per tutte le sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo. SDS, DTT e blu bromofenolo sono tossici e non devono essere ingeriti, inalati o esposti alla pelle o agli occhi. Consultare la scheda dati di sicurezza per le procedure di movimentazione adeguate. Si prega di utilizzare un cappuccio di fumi chimici per la manipolazione di sostanze chimiche pericolose.
  2. Reazione HAT
    NOTA: L'acido anacardico è un noto inibitore p3003 e viene utilizzato come esempio per dimostrare come il saggio HAT possa identificare nuovi inibitori p300. Per uno schema del passaggio 1.2.1, vedere Protocollo supplementare (Schematico1 ).
    1. Preparare la seguente reazione ezimatica in un tubo PCR da 0,2 mL: 2 L di buffer di analisi 5x, 1 L di p300 purificato (0,19 g/L), 1 L di acido anacardico (HATi) o di controllo DMSO diluito in 1x buffer di analisi e 2 L di ddHautoclaved 2O. Pre-incubare questa miscela per 10 min a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 3 L di 100 M Acetyl-CoA e 1 L di H3.1 purificato (0,2 g/L) alla reazione.
    2. Incubare la miscela di reazione completa a 30 gradi centigradi per 1 h in un ciclo termico PCR.
    3. Aggiungere 2-mercaptoethanol a un rapporto 1:10 al buffer di esempio SDS 6x.
    4. Rimuovere i campioni dal ciclo termico PCR e aggiungere 2 L di 6x SDS (con 2-mercaptoethanol aggiunto) al mix di reazione.
      CAUTION: 2-mercaptoethanol è tossico e deve essere utilizzato all'interno di un cappuccio di fumi chimici. Si prega di consultare la scheda dati di sicurezza per una corretta gestione.
    5. Riscaldare i campioni a 95 gradi centigradi per 5 minuti su un blocco di calore e raffreddare sul ghiaccio. Conservare i campioni a -20 o -80 gradi centigradi o eseguire l'elettroforesi gel e l'immunoblotting come descritto di seguito.
  3. Elettroforesi gel e immunoblotting
    NOTA: Se non si ha familiarità con l'elettroforesi e l'immunoblotting del gel, vedere questa procedura standard27 per ulteriori dettagli su come eseguire i passaggi 1.3.1-1.3.17. Ulteriori informazioni sono disponibili qui28,29,30,31,32,33.
    1. Pipetta 10 L di campioni (dal punto 1.2.5.) nei pozzetti di un gel poliacrilammide sfumato del 4-20%. Pipette 5 L di scala proteica in uno dei pozzi come riferimento di peso molecolare. Eseguire il gel a 120 V per 90 min utilizzando un serbatoio di gel.
    2. Trasferire il gel in una membrana di difluoride polivinilidena (PVDF) a 100 V per 70 min utilizzando un serbatoio di trasferimento.
    3. Rimuovere la membrana dall'apparato di trasferimento e posizionarla in un contenitore di plastica. Bloccare la membrana aggiungendo 1x TBST (contenente il 5% di latte) al contenitore e agitare delicatamente per 1 h a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il TBST 1x dal passaggio 1.3.3. Incubare la membrana durante la notte con anticorpi acetil specifici del sito selezionati (ad esempio, anticorpi primari H3K18ac o H3K27ac a una diluizione di 1:5.000 in 1x TBST contenenti 5% latte) a 4 gradi centigradi con agitazione delicata.
    5. Rimuovere la soluzione anticorpo primaria. Lavare la membrana 2x con 1x TBST (senza latte) a temperatura ambiente con agitazione delicata per 15 min ogni lavaggio.
    6. Diluire l'anticorpo secondario a 1:20.000 in 1x TBST (contenente il 5% di latte) e incubare la membrana per 1 h a temperatura ambiente con agitazione delicata.
    7. Rimuovere la soluzione di anticorpi secondari. Lavare la membrana 2x con 1x TBST (senza latte) a temperatura ambiente con agitazione delicata per 15 min ogni lavaggio.
    8. Scolare l'1x TBST dalla membrana. Mescolare la soluzione di perossido di substrato HRP e la soluzione di substrato HRP in un rapporto 1:1 (1 mL ciascuno) e pipetta 2 mL della soluzione combinata alla superficie della membrana.
    9. Incubare la soluzione con la membrana per 5 minuti a temperatura ambiente.
    10. Scolare il substrato chemiluminescente in eccesso dalla membrana su un tovagliolo di carta e posizionare la membrana in un involucro di plastica all'interno di un supporto di cassette a raggi X.
    11. Spostati in una stanza buia dedicata all'elaborazione di film a raggi X. Esporre la membrana a una pellicola a raggi X posizionando la pellicola sopra la membrana e chiudendo la cassetta per 30 s.
      NOTA: Il tempo di contatto tra la pellicola e la membrana deve essere determinato sperimentalmente. I segnali forti avranno bisogno di esposizioni brevi (secondi) e i segnali più deboli potrebbero richiedere esposizioni più lunghe.
    12. Rimuovere la pellicola a raggi X dalla cassetta ed elaborare la pellicola eseguendola attraverso un processore di pellicola a raggi X. Consultare i manuali del produttore per istruzioni specifiche su come elaborare la pellicola a raggi-X.
    13. Togliere la membrana dall'involucro di plastica e lavarla con ddH2O per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
    14. Incubare la membrana con 0,2 M NaOH per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
    15. Lavare la membrana con ddH2O per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
    16. Bloccare la membrana aggiungendo 1x TBST (contenente il 5% di latte) al contenitore e agitare delicatamente per 1 h a temperatura ambiente.
    17. Aggiungere la successiva diluizione dell'anticorpo primario (ad esempio, sonda per H3K27ac se il primo anticorpo utilizzato era H3K18ac) e agitare durante la notte a 4 gradi centigradi. Ripetere i passaggi 1.3.4-1.3.17 fino al completamento di tutte le sonde anticorpehe.

2. Analisi ChHAI

  1. Trattamenti farmacologici in vitro e analisi degli istoni acetilati
    NOTA: A-485 è un potente e ben caratterizzato p300 HATi2,4 . Questo inibitore sarà utilizzato nei saggi rimanenti a causa della sua efficacia e specificità nella coltura cellulare. MS-275 (Entinostat)24 è un HDACi che aumenta notevolmente i livelli di acetilazione degli istoni e viene utilizzato per facilitare il rilevamento delle sonde di acetilazione con immunoblotting standard. Vedere Protocollo supplementare (Schematico 2) per uno schema delle diluizioni di droga utilizzate al punto 2.1.
    1. Seme 100.000 cellule MCF-7 in una piastra di 12 pozzo e consentire alle cellule di crescere a 80-90% confluenza in 1 mL di media coltura cellulare. Contrassegnare i pozzetti per il seguente progetto sperimentale: ben 1: controllo DMSO (punto di riferimento); pozzo 2: A-485 (3 M); pozzo 3: A-485 (10 M); pozzo 4: MS-275 (3 M); pozzo 5: MS-275 (3 M) - A-485 (3 M); pozzo 6: MS-275 (3 M) - A-485 (10 M).
      NOTA: per la tattura delle cellule MCF-7, utilizzare supporti DMEM completi e consentire alle cellule di crescere a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Vedere la tabella 1 per la ricetta DMEM completa.
    2. A 24 h dopo la semina, pipetta 4 mL di supporto DMEM completo ad un tubo conico sterile 15 mL. Pipetta 2 L di MS-275 (6 mM in DMSO) al 4 mL di mezzo per una concentrazione finale di 3 M MS-275.
    3. Pipetta da 2 a 4 mL di media in un tubo conico sterile separato da 15 mL.
      CAUTION: Si prega di controllare la scheda dati di sicurezza per una corretta gestione di DMSO. Alcuni tipi di guanti non sono classificati per la gestione di DMSO.
    4. Aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi 4-6 e pipetta 1 mL di 3 M MS-275 in media (passo 2.1.2) ad ogni pozzo. Eliminare l'MS-275 diluito inutilizzato.
    5. Aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi 1-3 e pipetta 1 mL di DMSO diluito (passo 2.1.3) ad ogni pozzo. Eliminare il DMSO diluito inutilizzato.
    6. Riportare le cellule all'incubatrice e incubare per 4 h per consentire l'accumulo di istoni acetilati nelle cellule esposte a MS-275 (pozzi 4-6).
      NOTA: MS-275 è un HDACi e causerà iperacetilazione istone24. Questa pre-incubazione di 4 h è necessaria per consentire a MS-275 di indurre l'iperacetilazione prima dell'aggiunta di A-485, che riduce l'acetilazioneistonea 2,4.
    7. Dopo 4 h di incubazione con MS-275, preparare le seguenti diluizioni in tubi sterili separati da 1,5 mL mediante pipettaggio: da 1,0 L di DMSO a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di DMSO e 0,5 L A-485 (6 mM) a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di DMSO e 0,5 L di A-485 (20 mM) a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di DMSO e 0,5 L di MS-275 (6 mM) a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di A-485 (6 mM) e 0,5 L di MS-275 (6 mM) a 1 mL di supporti DMEM; 0,5 L di A-485 (20 mM) e 0,5 L di MS-275 (6 mM) a 1 mL di supporti DMEM.
    8. Aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi 1-6 e pipetta 1 mL di diluizione 1 a bene 1, diluizione 2 a bene 2, diluizione 3 a bene 3, diluizione 4 a bene 4, diluizione 5 a bene 5, e diluizione 6 a bene 6.
      NOTA: Una regola generale è bilanciare il contenuto di DMSO (solvente) tra gruppi sperimentali e non superare lo 0,1% del contenuto DISO nella coltura cellulare per evitare la tossicità cellulare e i cambiamenti nella proliferazione.
    9. Riportare le cellule all'incubatore e alla coltura per 20 h.
    10. Dopo 20 h, aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi 1-6.
    11. Lavare le cellule pipettando 1 mL di PBS a pozzi 1-6. Aspirare il PBS.
    12. Aggiungere 100 L di 1x buffer di lisi passiva (vedere la tabella 1) ai pozzi 1-6. Conservare la piastra di coltura cellulare (con campioni in buffer di lisi passiva) a 80 gradi centigradi durante la notte per il congelamento-disgelo e l'lisi delle cellule.
      CAUTION: Si prega di controllare la scheda dati di sicurezza per tutte le sostanze chimiche prima di fare buffer. CDTA può causare gravi danni agli occhi e irritazione.
    13. Scongelare i campioni a temperatura ambiente con agitazione delicata per 10 min. Trasferire i campioni in tubi separati da 1,5 mL e posizionarli immediatamente sul ghiaccio.
    14. Misurare la concentrazione proteica di ogni campione. La concentrazione di proteine può essere determinata utilizzando diversi protocolli benconsolidati 34.
    15. Equilibrare la concentrazione di proteine tra i campioni 1-6 (in un volume uguale) utilizzando 1x tampone di lisi passiva per diluire, se necessario.
    16. Aggiungere 2-mercaptoethanol a un rapporto 1:10 a 6x buffer di esempio SDS.
    17. Aggiungere 6x buffer di campione SDS con 2-mercaptoethanol ai campioni 1-6 ad una concentrazione finale di 1x buffer di campione SDS.
    18. Riscaldare i campioni a 95 gradi centigradi per 5 minuti su un blocco di calore e raffreddare sul ghiaccio. I campioni possono essere conservati a -20 gradi centigradi o a -80 gradi centigradi fino al punto 2.1.19.
    19. Pipetta un volume contenente 30 g di proteine per i campioni da 1 a 6 ai pozzi in un gel di poliacrilammide a gradiente del 4-20%. Eseguire la procedura di immunoblotting in base al protocollo descritto nel Protocollo 1.

3. ChIP-qPCR

NOTA: Il protocollo riportato di seguito è descritto come esempio per gli inibitori di p300.

  1. Preparazione del buffer
    NOTA: vedere la tabella 1 per le ricette del buffer. Le fasi generali del protocollo ChIP (ad esempio ricette tampone, tempi di lavaggio e tempi di centrifugazione) riportate di seguito sono modificate e adattate dalle raccomandazioni del produttore di un kit disponibile in mercato (c'è la tabella dei materiali)edalla letteratura 35,36.
    1. Preparare il buffer di diluizione ChIP, il buffer di gonfiore dei nuclei, il buffer di lavaggio a basso contenuto di sale, il buffer di lavaggio ad alto contenuto di sale, il buffer di lavaggio LiCl e il buffer TE. Conservare a 4 gradi centigradi.
    2. Preparare il buffer di lysis SDS, il buffer glicina 10x e il buffer di eluizione ChIP. Conservare a temperatura ambiente.
      CAUTION: Si prega di controllare la scheda dati di sicurezza per tutte le sostanze chimiche prima di fare buffer per garantire una corretta gestione.
  2. Trattamento farmacologico
    NOTA: vedere il protocollo supplementare (Schematico 3) per uno schema delle diluizioni di droga utilizzate nel passaggio 3.2.
    1. Semina le cellule MCF-7 in due piatti di coltura di 15 cm e coltiva le cellule al 90% di confluenza in 12 mL del mezzo DMEM completo. Contrassegnare i piatti per il seguente disegno sperimentale: Piatto 1: controllo DMSO (punto di riferimento); Piatto 2: A-485 (3 M).
      NOTA: per la tattura delle cellule MCF-7, utilizzare supporti DMEM completi e crescere a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Vedere la tabella 1 per la ricetta DMEM completa.
    2. In un tubo conico sterile da 15 mL, pipette da 12 mL di supporti DMEM e pipette 6 L di DMSO. Mescolare bene.
    3. In un tubo conico sterile separato da 15 mL, pipette da 12 mL di supporti DMEM e pipette 6 L di A-485 (6 mM in DMSO) per ottenere una concentrazione finale di 3 M A-485. Mescolare bene.
    4. Aspirare i media dai piatti 1 e 2.
    5. Aggiungere i 12 mL di DMSO diluiti in DMEM (passaggio 3.2.2.) al piatto 1.
    6. Aggiungete il 12 mL di 3 M A-485 in DMEM (passaggio 3.2.3.) al piatto 2.
    7. Restituire i piatti di coltura cellulare all'incubatrice e incubare per 24 h.
  3. Fissazione cellulare
    1. Pipetta 330 L (27,5 L per mL) di 37% di formaldeide al supporto completo e ruota delicatamente la piastra da mescolare.
      CAUTION: La formaldeide è tossica. Consultare la scheda dati di sicurezza per le procedure di movimentazione adeguate.
    2. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    3. Pipette 2 mL di glicina 10x alla piastra e turbina per mescolare.
    4. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    5. Dopo l'incubazione, mettere i piatti sul ghiaccio e scongelare un aliquot di cocktail inibitore della proteasi.
    6. Preparare le seguenti soluzioni per gli esempi DMSO e A-485 utilizzando i buffer preparati nel passaggio 3.1.
      1. 2 mL di PBS con una diluizione di 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi
      2. 1 mL di tampone di gonfiore nuclei con una diluizione 1:1,000 del cocktail inibitore della proteasi
      3. 0,5 mL di cuscinetto di lysi SDS con una diluizione di 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi
    7. Aspirare i media dai piatti di coltura cellulare e lavare le cellule due volte con 15 mL di PBS freddo.
    8. Pipetta 2 mL di PBS con il cocktail inibitore della proteasi (punto 3.3.6.1) ai piatti di coltura cellulare. Sollevare le cellule in soluzione utilizzando un raschietto cellulare.
    9. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuge. Raccogliere le celle rimanenti con PBS aggiuntivo, se necessario.
    10. Ruotare i tubi a 800 x g a 4 gradi centigradi per 5 minuti per pellet le cellule.
    11. Aspirare il supernatant e la pipetta 1 mL di tampone di gonfiore dei nuclei con il cocktail inibitore della proteasi (punto 3.3.6.2) al pellet. Rispendere il pellet e incubare sul ghiaccio per 10 min.
    12. Centrifugare i tubi a 2.700 x g a 4 gradi centigradi per 5 minuti a pellet nuclei.
    13. Aspirare il supernatant e pipette 0,5 mL di cuscinetto di lysi SDS con il cocktail inibitore della proteasi (passo 3.3.6.3) al pellet. Rispendere il pellet e incubare sul ghiaccio per 10 min.
    14. Conservare i campioni di cromatina a -80 gradi centigradi fino al punto 3.4.1 o procedere immediatamente al punto 3.4.
  4. Sonicazione del DNA
    1. Trasferire 130 L di cromatina dal campione DMSO (passaggio 3.3.14) a due tubi di sonicazione del DNA utilizzando una pipetta (130 L ciascuno).
    2. Trasferire 130 L di cromatina dal campione A-485 (punto 3.3.14) a due tubi di sonicazione del DNA utilizzando una pipetta (130 L ciascuno).
    3. Sonicate il DNA a circa 150-200 frammenti di coppia di base utilizzando le seguenti impostazioni sonicatori: Peak Incident Power (W) di 175, Duty Factor del 10%, 200 Cicli per Burst e 430 s tempo di trattamento.
      NOTA: le impostazioni di sonicazione possono differire tra i modelli e potrebbe essere necessario regolare le impostazioni per ottenere le dimensioni appropriate del frammento per le diverse linee di cella.
    4. Conservare i campioni sul ghiaccio dopo la sonicazione.
    5. Trasferire la cromatina sonicata in un tubo da 1,5 mL utilizzando una pipetta e una centrifuga a 10.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min a pellet detriti.
    6. Pipette il supernatant (contiene cromatina sonicata) a un nuovo tubo e scartare i detriti. La cromatina sonicata può essere conservata a -80 gradi centigradi.
  5. Immunoprecipizione della cromatina (ChIP)
    NOTA: vedere il protocollo supplementare (Schematico 3) per uno schema dei gruppi IP nel passaggio 3.5.
    1. Misurare il contenuto proteico della cromatina sonicata per i campioni DMSO e A-485 del punto 3.4.6. Il contenuto proteico può essere misurato utilizzando protocolli consolidati34.
      NOTA: Per semplicità, questo protocollo presupporrà che il contenuto proteico sia uguale e che venga utilizzato 100 L di cromatina sonicata. In caso contrario, il contenuto proteico dovrà essere equilibrato tra tutti i campioni in un volume uguale.
    2. Pipette 100 L di cromatina srotomatica srotomatica DMSO a due tubi da 1,5 mL (100 L ciascuno). Pipette 400 L del buffer di diluizione ChIP (contenente una diluizione 1:1.000 del cocktail inibitore della proteasi) ad ogni tubo per portare il volume totale fino a 500 L. Rimuovere 5 L della soluzione da uno dei tubi e conservare a -20 gradi centigradi come INGRESSO DMSO.
    3. Pipette 100 L di a-485 di cromatina sonicata a due tubi da 1,5 mL (100 l L ciascuno). Pipette 400 L di buffer di diluizione ChIP (contenente una diluizione 1:1000 del cocktail inibitore della proteasi) ad ogni tubo per portare il volume totale fino a 500 L. Rimuovere 5 L della soluzione da uno dei tubi e conservare a -20 gradi centigradi come A-485 Input.
    4. Utilizzando una pipetta, aggiungere l'anticorpo immunoprecipitation (IP) (ad esempio il controllo IgG non specifico o l'anticorpo specifico H3K27ac) ai tubi corrispondenti per i campioni DMSO e A-485: ip #1 cromatina DMSO con anticorpo IgG (5-10 g); IP #2 cromatina DMSO con anticorpo H3K27ac (5-10 g); IP #3 a-485 con anticorpo IgG (5-10 g); IP #4 a-485 con anticorpo H3K27ac (5-10 g).
    5. Aggiungere 20 L di proteina A perline magnetiche ad ogni tubo. Assicurati che le perline siano ben riesmesse.
    6. Ruotare i campioni durante la notte a 4 gradi centigradi.
    7. Pellet la proteina A perline magnetiche utilizzando un separatore magnetico e rimuovere il supernante. Non disturbare le perline.
    8. Lavare le perline con 500 l A 1 mL del tampone di lavaggio a basso contenuto di sale e ruotare per 5 minuti a 4 gradi centigradi. Eseguire un rapido spin verso il basso, pellet le perline utilizzando un separatore magnetico, e rimuovere il supernatant.
    9. Lavare le perline con 500 l A 1 mL del buffer di lavaggio ad alto contenuto di sale e ruotare per 5 minuti a 4 gradi centigradi. Eseguire un rapido spin verso il basso, pellet le perline utilizzando un separatore magnetico, e rimuovere il supernatant.
    10. Lavare le perline con 500 l A 1 mL del tampone di lavaggio LiCl e ruotare per 5 minuti a 4 gradi centigradi. Eseguire un rapido spin verso il basso, pellet le perline utilizzando un separatore magnetico, e rimuovere il supernatant.
    11. Lavare le perline con 500 l a 1 mL di buffer TE e ruotare per 5 min a 4 gradi centigradi. Eseguire un rapido spin verso il basso. Mantenere le perline nel buffer TE fino al passaggio 3.5.14.
    12. Rimuovere i campioni di ingresso (dai punti 3.5.2 e 3.5.3) dal congelatore e conservarsi sul ghiaccio.
    13. Scongelare un aliquot di Proteinase K.
    14. Pellet le perline utilizzando un separatore magnetico e rimuovere il buffer TE dalle perline (dal punto 3.5.11).
    15. Aggiungere a ogni campione, inclusi i campioni di input, aggiungere un buffer di eluizione ChIP di 100 L: 1 L di Proteinase K. Incubare i campioni con agitazione a 62 gradi centigradi per 2 h utilizzando un termociclo.
    16. Dopo 2 h, i campioni di calore a 95 gradi centigradi per 10 min utilizzando un termociclo.
    17. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente.
    18. Perline magnetiche pellet utilizzando un separatore magnetico e trasferire supernatant (contiene il DNA di interesse) in un nuovo tubo da 1,5 mL.
    19. Purificare il DNA utilizzando un kit di pulizia PCR standard.
    20. Il DNA purificato può essere conservato a -20 gradi centigradi e può essere utilizzato come modelli nei protocolli qPCR standard. Seguire i protocolli del produttore per l'esecuzione di qPCR.
  6. Analisi dei dati ChIP-qPCR
    NOTA: Due metodi comuni per analizzare i risultati di ChIP-qPCR sono l'arricchimento della piega sull'anticorpo IgG e il metodo di input dell'1%. Un modello eccellente per entrambi i metodi di analisi è fornito da una fonte commerciale può essere utilizzato per calcolare rapidamente l'arricchimento della piega per ogni anticorpo IP/obiettivo diinteresse 37.
    1. Per calcolare l'arricchimento della piega e l'input %, copiare e incollare i valori di zCt dai dati qPCR ottenuti per ogni anticorpo (IgG non specifico, l'anticorpo IP H3K27ac e l'input dell'1%) nell'area corrispondente nel modello di analisi e l'arricchimento di piegatura e l'input % di resa verranno popolati automaticamente.

Risultati

L'analisi dell'acetiltransferasi dell'istone in vitro (HAT) può essere utilizzata per sondare i composti che inibiscono l'attività p300 HAT verso un substrato istonetico. Figura 1A fornisce uno schema sperimentale per il test HAT. L'acido anacardico, un noto HATi3,38, è stato utilizzato in questo saggio in un intervallo di concentrazione da 12.5-100 . A 100 M, l'acido anacardico regola p300 catalizzato l'acetilazione istonetica a ...

Discussione

L'acetiltransferasi di l'acetilsione (KAT) acetilate diversi residui di litina sulle code dell'istoneo e sui fattori di trascrizione per regolare la trascrizionegenica 2,3. Il lavoro degli ultimi due decenni ha rivelato che i KAT, come CBP/p300, PCAF e GCN5, interagiscono con i fattori di trascrizione oncogenici e aiutano a guidare la crescita del tumore in diversi tipi di tumore solido4,5,

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse o divulgazioni da fare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di James ed Esther King Biomedical Research Program (6JK03 e 20K07), e Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 e 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation e UF Health Cancer Center. Inoltre, vorremmo ringraziare il Dr. Osking e il Dr. Andrea Lin per il loro sostegno durante il processo di pubblicazione.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubeFisher Scientific05-408-129For all methods
10 cm dishSarstedt AG & Co.83.3902For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tipsFisher Scientific02-707-454For all Methods
1000 ul tipsCorning4846For all Methods
10X Glycine bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running BufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBSTFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plateCorning3513For Method 2
15 cm dishSarstedt AG & Co.83.3903For Method 3
15 ml conical tubeSanta Cruz Biotechnologysc-200249For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium AzideFor Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milkFor Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tipsCorning4844For all Methods
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gelThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXFor Methods 1 and 2
5X Assay bufferFor Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis bufferFor Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibodyCell Signaling Technology4771For Method 1
Acetyl-CoASigma-AldrichA2056for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)Cell Signaling TechnologyCST 8173antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)Cell Signaling TechnologyCST 9675antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibodyMillipore SigmaT5168For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acidCayman Chemical13144For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibodyCell Signaling Technology7076For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibodyJackson ImmunoResearch711-035-152For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography filmMIDSCIBX810For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating PlatformStovall Life Science Incorporatednot availableFor Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)HyCloneSH30072.03cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153for buffer preparation
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for SDS sample buffer preparation
CDTASpectrum Chemical125572-95-4For buffer preparation
cell scraperMillipore SigmaCLS3010For Method 3
ChIP dilution bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution BufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 CellsFor Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBECovaris520045Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicatorCovarisS220DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich41639for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815for SDS sample buffer preparation
DMEMCorning10-013-CVcell culture media
EDTAFisher ScientificBP120-1for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatusBio-rad1704070For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation KitMillipore Sigma17-10086For Method 3
FK228 (Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solutionSigma-AldrichF8775for cell fixation
glycerolFisher ScientificBP229-1For buffer preparation
glycineSigma-AldrichG7126for buffer preparation
HEPESSigma-Aldrich54457for buffer preparation
High salt wash bufferFor Method 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP SubstrateMillipore SigmaWBKLS0500For Methods 1 and 2
KClFisher ScientificBP366-500for buffer preparation
LiClSigma-AldrichL9650For buffer preparation
LiCl wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic SeparatorPromegaZ5341For use in Method 3
MethanolSigma-Aldrich494437For buffer preparation
Mini gel tankInvitrogenA25977For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaClFisher Scientific7647-14-5for buffer preparation
NaOHFisher ScientificS318-100for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgGBethyl LaboratoriesP120-101Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup KitQiagen28104For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100XCorning30-002-CIcell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CVFor Methods 2 and 3
PIPESSigma-Aldrich80635for buffer preparation
powdered milkNestle CarnationFor Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transferBio-radFor Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel runningBio-radFor Methods 1 and 2
Prestained Protein LadderThermo Fisher26616For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor CocktailSigma-AldrichPI8340for use in Method 3
Protein A Magentic BeadsNew England BioLabsS1425SFor use in Method 3
Proteinase KNew England BioLabsP8107SFor use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal ControllerMJ Research Inc.PTC-100For Method 1
PVDF Transfer MembraneMillipore SigmaIEVH00005For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1New England BioLabsM2503Sfor use in Method 1
Recombinant p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium AzideFisher Scientific26628-22-8For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500for buffer preparation
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich71725for SDS sample buffer preparation
Standard HeatblockVWR Scientific ProductsMPN: 949030For Methods 1 and 2
Table top centrifugeEppendorf5417RFor all methods
TE bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer bufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin ACayman Chemical58880-19-6HDAC Inhibitor for use in Method 2
TrisFisher ScientificBP152-5for buffer preparation
Triton X-100Sigma-AldrichT8787for buffer preparation
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processorKonica Minolta Medical & Graphic, Inc.SRX-101AFor Methods 1 and 2

Riferimenti

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