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In diesem Artikel

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  • Offenlegungen
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  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Inhibitoren von Histonacetyltransferasen (HATs, auch bekannt als Lysin-Acetyltransferasen), wie CBP/p300, sind potenzielle Therapeutika zur Behandlung von Krebs. Es sind jedoch strenge Methoden zur Validierung dieser Inhibitoren erforderlich. Drei In-vitro-Methoden zur Validierung umfassen HAT-Assays mit rekombinanten Acetyltransferasen, Immunoblotting für Histonacetylierung in der Zellkultur und ChIP-qPCR.

Zusammenfassung

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) katalysieren die Acetylierung von Lysinrückständen auf Histonen und anderen Proteinen, um die Chromatindynamik und Genexpression zu regulieren. KATs, wie CBP/p300, werden aufgrund ihrer kritischen Rolle bei der Tumorgenese verschiedener Krebsarten intensiv als therapeutische Ziele untersucht. Die Entwicklung neuartiger kleiner Molekülinhibitoren, die auf die Histonacetyltransferase(HAT)-Funktion von KATs abzielen, ist anspruchsvoll und erfordert robuste Tests, die die Spezifität und Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren validieren können.

Dieser Artikel skizziert eine Pipeline von drei Methoden, die eine strenge In-vitro-Validierung für neuartige HAT-Hemmer (HATi) bieten. Diese Methoden umfassen einen Testfürhorn HAT, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) Assay, und Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). Im HAT-Test werden rekombinante HATs mit Histonen in einer Reagenzreaktion inkubiert, was eine Acetylierung spezifischer Lysinrückstände an den Histonschwänzen ermöglicht. Diese Reaktion kann durch ein HATi blockiert werden und die relativen Niveaus der standortspezifischen Histonacetylierung können mittels Immunoblotting gemessen werden. Inhibitoren, die im HAT-Test identifiziert wurden, müssen in der zellulären Umgebung bestätigt werden.

Der ChHAI-Assay verwendet Immunoblotting, um neuartige HATi zu prüfen, die die robuste Hyperacetylierung von Histonen dämpfen, die durch einen Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDACi) induziert wird. Die Zugabe eines HDACi ist hilfreich, da basalen Niveaus der Histon-Acetylierung kann schwierig sein, über Immunoblotting zu erkennen.

Die HAT- und ChHAI-Assays messen globale Veränderungen in der Histonacetylierung, liefern jedoch keine Informationen über die Acetylierung in bestimmten genomischen Regionen. Daher wird ChIP-qPCR verwendet, um die Auswirkungen von HATi auf Histon-Acetylierungsniveaus bei Gen-Regulierungselementen zu untersuchen. Dies wird durch selektive Immunpräzipitation von Histon-DNA-Komplexen und Analyse der gereinigten DNA durch qPCR erreicht. Zusammen ermöglichen diese drei Assays eine sorgfältige Validierung der Spezifität, Potenz und des Wirkmechanismus neuartiger HATi.

Einleitung

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) katalysieren die Acetylierung von Lysinrückständen auf Histon- und Nicht-Histonproteinen1,2,3,4. Jüngste Forschung zeigt, dass KATs und ihre Acetyltransferase-Funktion solidesTumorwachstum4,5,6,7,8,9fördern kann. Zum Beispiel sind CREB-bindendes Protein (CBP)/p300 zwei paralogende KATs, die zahlreiche Signalwege bei Krebs regulieren2,3. CBP/p300 haben eine gut charakterisierte Histon-Acetyltransferase (HAT)-Funktion und katalysieren Histon 3 Lysin 27 Acetylierung (H3K27ac)2,4,5,10,11, ein wichtiger Marker für aktive Enhancer, Promotorregionen und aktive Gentranskription12,13,14. CBP/p300 dienen als kritische Co-Aktivatoren für wachstumsfördernde Signalwege bei soliden Tumoren durch Aktivierung der Transkription von Onkogenen durch Acetylierung von Histonen und anderen Transkriptionsfaktoren4,9,15,16,17,18. Aufgrund ihrer Rolle bei der Tumorprogression werden CBP/p300 und andere KATs für die Entwicklung neuartiger Inhibitoren untersucht, die ihre onkogene Funktion blockieren4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 und GNE-049 stellen zwei erfolgreiche Versuche dar, potente und spezifische Inhibitoren für CBP/p3004,9zu entwickeln. Weitere Inhibitoren werden derzeit für CBP/p300 und andere KATs untersucht.

Die Qualität der zuvor beschriebenen KAT-Hemmer (KATi) wird in Frage gestellt, wobei viele Inhibitoren Zielwirkungen und eine schlechte Charakterisierung zeigen21. Daher ist eine strenge Charakterisierung und Validierung neuartiger Wirkstoffkandidaten für die Entwicklung hochwertiger chemischer Sonden unerlässlich. Hier sind drei Protokolle beschrieben, die eine Pipeline zum Screening bilden und die Wirksamkeit und Spezifität neuartiger KATi streng validieren, mit einem besonderen Schwerpunkt auf der Hemmung der HAT-Funktion (HATi) von KATs. CBP/p300 und ihre Inhibitoren werden als Beispiele verwendet, aber diese Protokolle können für andere KATs angepasst werden, die eine HAT-Funktion haben7.

Das erste Protokoll ist ein In-vitro-Histon-Acetyltransferase (HAT)-Assay, der gereinigte rekombinante p300 und Histone in einer kontrollierten Reagenzröhrenreaktion verwendet. Dieser Test ist einfach durchzuführen, ist kostengünstig, kann verwendet werden, um Verbindungen in einer niedrigen Durchsatzeinstellung zu überprüfen, und erfordert keine radioaktiven Materialien. In diesem Protokoll werden rekombinante p300 Katalysen Lysin-Acetylierung an Histonschwänzen während einer kurzen Inkubationszeit und die Konzentrationen der Histonacetylierung mit Standard-Immunoblotting-Verfahren gemessen. Die enzymatische Reaktion kann in Gegenwart oder Abwesenheit von CBP/p300-Inhibitoren durchgeführt werden, um auf Verbindungen zu überprüfen, die die Histonacetylierung reduzieren. Darüber hinaus kann der HAT-Test verwendet werden, um zu überprüfen, ob neuartige Verbindungen selektiv für CBP/p300 sind, indem ihre Aktivität mit anderen gereinigten KATs, wie PCAF, bewertet wird. Der HAT-Test ist ein ausgezeichneter Ausgangspunkt für die Untersuchung neuartiger Inhibitoren aufgrund seiner Einfachheit, niedrigen Kosten und der Fähigkeit, die Wirksamkeit/Selektivität eines Inhibitors zu bestimmen. Tatsächlich wird dieses Protokoll in der Literatur oft als In-vitro-Bildschirmverwendet 5,10. Jedoch, Inhibitoren im HAT-Assay identifiziert sind nicht immer wirksam in der Zellkultur, weil eine Reagenzglasreaktion ist viel einfacher als ein lebendes Zellsystem. Daher ist es wichtig, Inhibitoren in Zellkulturexperimenten weiter zu charakterisieren22,23.

Das zweite Protokoll in der Pipeline ist der Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) Assay. Dieser zellbasierte Assay nutzt Histon-Deacetylase-Inhibitoren (HDACi) als Werkzeug, um Histonen in Chromatin vor der Co-Inkubation mit einem HATi24zu hyperacetylate Histone in Chromatin. Basal-Histon-Acetylierung kann in der Zellkultur niedrig sein, was es schwierig macht, über Immunoblotting zu sondieren, ohne dass ein HDACi hinzugefügt wird, um die Acetylierung zu erhöhen. Der Zweck des ChHAI-Assays ist es, neuartige HATi zu identifizieren, die die Zunahme der Histonacetylierung durch HDAC-Hemmung abschwächen können. Die Vorteile dieses Tests sind seine niedrigen Kosten, relative Leichtigkeit zu erfüllen, und die Verwendung von Zellen in der Kultur, die mehr physiologische Relevanz als das Reagenzglas HAT Assay bietet. Ähnlich wie der HAT-Test verwendet dieses Protokoll Standard-Immunoblotting für die Datenerfassung.

Die HAT- und ChHAI-Assays liefern Daten über die Wirksamkeit neuartiger Verbindungen zur Hemmung der globalen Histonacetylierung, geben aber keinen Einblick, wie diese Verbindungen Modifikationen in bestimmten genomischen Regionen beeinflussen. Daher ist das endgültige Protokoll, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR), ein Zellkulturexperiment, das DNA-Protein-Wechselwirkungen an bestimmten Regionen des Genoms untersucht. Im ChIP-Protokoll ist Chromatin vernetzt, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu erhalten. Das Chromatin wird dann aus Zellen extrahiert und der DNA-Protein-Komplex erhält eine selektive Immunpräzipitation für das Protein von Interesse (z.B. mit einem Antikörper speziell für H3K27ac). Die DNA wird dann gereinigt und mit qPCR analysiert. Beispielsweise kann ChIP-qPCR verwendet werden, um festzustellen, ob ein neuartiges HATi die Histonacetylierung bei einzelnen Onkogenen, wie Cyclin D125, herunterreguliert. Während ChIP-qPCR eine gängige Technik ist, die im Feld verwendet wird, kann es schwierig sein,4,10,26zu optimieren. Dieses Protokoll enthält Tipps zur Vermeidung potenzieller Fallstricke, die bei der Ausführung der ChIP-qPCR-Prozedur auftreten können, und enthält Qualitätskontrollen, die für die Daten durchgeführt werden sollten.

Zusammen ermöglichen diese drei Protokolle die strenge Charakterisierung und Validierung neuartiger HATi. Darüber hinaus bieten diese Methoden viele Vorteile, da sie einfach durchzuführen, relativ günstig sind und Daten über globale sowie regionale Histon-Acetylierung liefern.

Protokoll

1. In-vitro-HAT-Test

  1. Puffervorbereitung
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Pufferrezepte.
    1. 5x Assaypuffer und 6x Natriumdodecylsulfat (SDS) vorbereiten und bei -20 °C lagern. Aliquot SDS in 1 ml Aliquots.
    2. 10x SDS-Gellaufpuffer und 10x TBST vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.
    3. 1x Transferpuffer vorbereiten und bei 4 °C lagern.
      VORSICHT: Überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt auf alle in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien. SDS, DTT und Bromphenolblau sind giftig und sollten nicht aufgenommen, eingeatmet oder der Haut oder den Augen ausgesetzt werden. Für ordnungsgemäße Handhabungsverfahren finden Sie ein Sicherheitsdatenblatt. Bitte verwenden Sie eine chemische Rauchhaube für den Umgang mit gefährlichen Chemikalien.
  2. HAT-Reaktion
    HINWEIS: Anacardinsäure ist ein bekannter p300-Hemmer3 und wird als Beispiel verwendet, um zu zeigen, wie der HAT-Assay neuartige p300-Inhibitoren identifizieren kann. Eine Schaltplanversion von Schritt 1.2.1 finden Sie unter Ergänzendes Protokoll (Schema 1).
    1. Bereiten Sie die folgende enzymatische Reaktion in einem 0,2 ml PCR-Rohr vor: 2 l 5x Assay-Puffer, 1 l gereinigte p300 (0,19 g/l), 1 l Anakardieinsäure (HATi) oder DMSO-Kontrolle verdünnt in 1x Assay-Puffer und 2 l autoklavierte ddH2O. Dann fügen Sie der Reaktion 3 l mit 100 m Acetyl-CoA und 1 l gereinigtem H3,1 (0,2 g/l) hinzu.
    2. Inkubieren Sie das komplette Reaktionsgemisch bei 30 °C für 1 h in einem PCR-Thermocycler.
    3. Fügen Sie 2-Mercaptoethanol im Verhältnis 1:10 zum 6x SDS-Probenpuffer hinzu.
    4. Entfernen Sie Proben aus dem PCR-Thermocycler und fügen Sie dem Reaktionsmix 2 l 6x SDS (mit 2-Mercaptoethanol zugesetzt) hinzu.
      VORSICHT: 2-Mercaptoethanol ist giftig und sollte in einer chemischen Rauchhaube verwendet werden. Zur ordnungsgemäßen Handhabung lesen Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt.
    5. Wärmeproben bei 95 °C für 5 min auf einem Wärmeblock und auf Eis abkühlen. Lagern Sie die Proben bei -20 oder -80 °C oder führen Sie Gelelektrophorese und Immunoblotting wie unten beschrieben durch.
  3. Gelelektrophorese und Immunoblotting
    HINWEIS: Wenn Sie mit Der Gelelektrophorese und Immunoblotting nicht vertraut sind, finden Sie dieses Standardverfahren27, um weitere Informationen zur Durchführung der Schritte 1.3.1-1.3.17 zu erhalten. Weitere Informationen finden Sie hier28,29,30,31,32,33.
    1. Pipette 10 l Proben (ab Schritt 1.2.5.) in die Brunnen eines 4-20% Gradienten Polyacrylamid-Gels. Pipette 5 l Proteinleiter in einen der Brunnen als Molekulargewichtsreferenz. Führen Sie das Gel bei 120 V für 90 min mit einem Geltank.
    2. Übertragen Sie das Gel mit einem Transfertank 70 min auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) membran bei 100 V.
    3. Entfernen Sie die Membran aus dem Transfergerät und legen Sie sie in einen Kunststoffbehälter. Blockieren Sie die Membran, indem Sie 1x TBST (mit 5% Milch) in den Behälter geben und bei Raumtemperatur 1 h sanft schütteln.
    4. Entfernen Sie den 1x TBST aus Schritt 1.3.3. Inkubieren Sie die Membran über Nacht mit ausgewählten ortsspezifischen Acetyl-Antikörpern (z.B. H3K18ac oder H3K27ac Primärantikörper bei einer Verdünnung von 1:5.000 in 1x TBST mit 5% Milch) bei 4 °C mit sanftem Schütteln.
    5. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran 2x mit 1x TBST (keine Milch) bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 15 min jede Wäsche.
    6. Den Sekundärantikörper bei 1:20.000 in 1x TBST (mit 5% Milch) verdünnen und die Membran bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln 1 h bebrüten.
    7. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran 2x mit 1x TBST (keine Milch) bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 15 min jede Wäsche.
    8. 1x TBST von der Membran abtropfen lassen. Mischen Sie HRP-Substratperoxidlösung und HRP-Substrat-Luminol-Lösung in einem Verhältnis von 1:1 (jeweils 1 ml) und Pipette 2 ml der kombinierten Lösung zur Membranoberfläche.
    9. Inkubieren Sie die Lösung mit der Membran für 5 min bei Raumtemperatur.
    10. Überschüssiges chemilumineszierendes Substrat aus der Membran auf ein Papiertuch abtropfen lassen und die Membran in Plastikfolie in einen Röntgenkassettenhalter legen.
    11. Bewegen Sie sich in einen dunklen Raum, der der Röntgenfilmverarbeitung gewidmet ist. Setzen Sie die Membran einem Röntgenfilm aus, indem Sie den Film auf die Membran legen und die Kassette für 30 s schließen.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt des Kontakts zwischen Film und Membran muss experimentell bestimmt werden. Starke Signale benötigen kurze Belichtungen (Sekunden) und schwächere Signale benötigen möglicherweise längere Belichtungen.
    12. Entfernen Sie den Röntgenfilm aus der Kassette und verarbeiten Sie ihn, indem Sie ihn über einen Röntgenfilmprozessor ausführen. In den Herstellerhandbüchern finden Sie spezifische Anweisungen zur Verarbeitung des Röntgenfilms.
    13. Entfernen Sie die Membran von der Kunststofffolie und waschen Sie sie mit ddH2O für 5 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.
    14. Inkubieren Sie die Membran mit 0,2 M NaOH für 5 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.
    15. Waschen Sie die Membran mit ddH2O für 5 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.
    16. Blockieren Sie die Membran, indem Sie 1x TBST (mit 5% Milch) in den Behälter geben und bei Raumtemperatur 1 h sanft schütteln.
    17. Fügen Sie die nächste primäre Antikörperverdünnung hinzu (z. B. Sonde für H3K27ac, wenn der erste Antikörper verwendet wurde H3K18ac) und schütteln Sie über Nacht bei 4 °C. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.4-1.3.17, bis alle Antikörpersonden abgeschlossen sind.

2. ChHAI-Test

  1. In-vitro-Arzneimittelbehandlungen und Analyse von acetylierten Histonen
    ANMERKUNG: A-485 ist ein potenter und gut charakterisierter p300 HATi2,4 . Dieser Inhibitor wird in den verbleibenden Assays aufgrund seiner Wirksamkeit und Spezifität in der Zellkultur verwendet werden. MS-275 (Entinostat)24 ist ein HDACi, das die Histon-Acetylierung deutlich erhöht und verwendet wird, um die leichtere Detektion von Acetylierungssonden mit Standard-Immunoblotting zu erleichtern. Siehe Zusatzprotokoll (Schemat 2) für ein Schema der in Schritt 2.1 verwendeten Arzneimittelverdünnungen.
    1. Samen 100.000 MCF-7-Zellen in einer 12-Well-Platte und lassen Sie Zellen bis zu 80-90% Konfluenz in 1 ml Zellkulturmedium wachsen. Markieren Sie die Brunnen für das folgende experimentelle Design: gut 1: DMSO-Steuerung (Referenzpunkt); gut 2: A-485 (3 m); gut 3: A-485 (10 m); gut 4: MS-275 (3 m); gut 5: MS-275 (3 m) + A-485 (3 m); gut 6: MS-275 (3 m) + A-485 (10 m).
      HINWEIS: Verwenden Sie für die Kultivierung von MCF-7-Zellen komplette DMEM-Medien und lassen Sie Zellen bei 37 °C mit 5%CO2wachsen. Siehe Tabelle 1 für das vollständige DMEM-Rezept.
    2. Bei 24 h nach der Aussaat Pipette 4 ml komplettes DMEM-Medium zu einem sterilen 15 ml konischen Rohr. Pipette 2 l MS-275 (6 mM in DMSO) auf das Medium 4 ml für eine Endkonzentration von 3 m MS-275.
    3. Pipette 2 l DMSO bis 4 ml Medium in einem separaten sterilen 15 ml konischen Rohr.
      VORSICHT: Bitte überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt auf ordnungsgemäße Handhabung von DMSO. Einige Handschuhtypen sind nicht für die Handhabung von DMSO bewertet.
    4. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium von den Brunnen 4-6 und der Pipette 1 ml von 3 m MS-275 in medium (Schritt 2.1.2) zu jedem Brunnen. Entsorgen Sie nicht verwendete verdünnte MS-275.
    5. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium von den Brunnen 1-3 und pipette 1 ml verdünntem DMSO (Schritt 2.1.3) zu jedem Brunnen. Entsorgen Sie nicht verwendete verdünnte DMSO.
    6. Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und brüten Sie 4 h, um die Ansammlung von acetylierten Histonen in Zellen zu ermöglichen, die MS-275 ausgesetzt sind (Brunnen 4-6).
      HINWEIS: MS-275 ist ein HDACi und wird Histon-Hyperacetylierung24verursachen. Diese 4 h Vorinkubation ist notwendig, damit MS-275 eine Hyperacetylierung vor der Zugabe von A-485 induzieren kann, wodurch die Histonacetylierung2,4reduziert wird.
    7. Nach 4 h Inkubation mit MS-275 die folgenden Verdünnungen in separaten sterilen 1,5 ml-Rohren durch Pipettieren vorbereiten: 1,0 l DMSO bis 1 ml DMEM-Medien; DMSO 0,5 l und DMEM-Medien von 0,5 l A-485 (6 mM) bis 1 ml; DMSO 0,5 l und 0,5 l A-485 (20 mM) bis 1 ml DMEM-Medien; DMSO 0,5 l und MS-275 (6 mM) bis 1 ml DMEM-Medien 0,5 l; 0,5 l A-485 (6 mM) und 0,5 l MS-275 (6 mM) bis 1 ml DMEM-Medien; 0,5 l A-485 (20 mM) und 0,5 l MS-275 (6 mM) bis 1 ml DMEM-Medien.
    8. Das Zellkulturmedium von den Brunnen 1-6 und die Pipette 1 ml Verdünnung 1 bis gut 1, Verdünnung 2 bis gut 2, Verdünnung 3 bis gut 3, Verdünnung 4 bis gut 4, Verdünnung 5 bis gut 5 und Verdünnung 6 bis gut 6.
      HINWEIS: Eine allgemeine Regel besteht darin, den DMSO-Gehalt (Lösungsmittel) zwischen versuchsweisen Gruppen auszugleichen und den DMSO-Gehalt in der Zellkultur nicht zu überschreiten, um zelluläre Toxizität und Veränderungen in der Proliferation zu vermeiden.
    9. Bringen Sie die Zellen für 20 h in den Inkubator und die Kultur zurück.
    10. Nach 20 h, aspirieren Sie die Zellkultur Medium aus Brunnen 1-6.
    11. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS auf die Bohrungen 1-6 pfeifen. Aspirieren Sie die PBS.
    12. Fügen Sie 100 l 1x passivelylyse Puffer (siehe Tabelle 1) zu Den Brunnen 1-6. Zellkulturplatte (mit Proben im passiven Lysepuffer) bei 80 °C über Nacht für Gefriertau und Lyse von Zellen lagern.
      VORSICHT: Bitte überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt auf alle Chemikalien, bevor Sie Puffer herstellen. CDTA kann schwere Augenschäden und Reizungen verursachen.
    13. Proben bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln 10 min auftauen. Proben in getrennte 1,5 ml-Rohre geben und sofort auf Eis legen.
    14. Messen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe. Die Proteinkonzentration kann mit mehreren etablierten Protokollen bestimmt werden34.
    15. Gleichgewichtsproteinkonzentration zwischen den Proben 1-6 (in gleichem Volumen) mit 1x passivem Lysepuffer, um sie bei Bedarf zu verdünnen.
    16. Fügen Sie 2-Mercaptoethanol im Verhältnis 1:10 zum 6x SDS-Probenpuffer hinzu.
    17. 6x SDS-Probenpuffer mit 2-Mercaptoethanol zu den Proben 1-6 zu einer Endkonzentration von 1x SDS-Probenpuffer hinzufügen.
    18. Wärmeproben bei 95 °C für 5 min auf einem Wärmeblock und auf Eis abkühlen. Die Proben können bis Schritt 2.1.19 bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden.
    19. Pipette ein Volumen, das 30 g Protein für Proben 1-6 zu den Brunnen in einem 4-20% Gradient polyacrylamidgel enthält. Durchführung eines Immunoblotting-Verfahrens gemäß protokollarisch, das in Protokoll 1 beschrieben ist.

3. ChIP-qPCR

HINWEIS: Das folgende Protokoll wird als Beispiel für Inhibitoren von p300 beschrieben.

  1. Puffervorbereitung
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Pufferrezepte. Die unten aufgeführten allgemeinen Schritte des ChIP-Protokolls (z.B. Pufferrezepte, Wasch- und Zentrifugationszeiten) werden an die Empfehlungen des Herstellers eines handelsüblichen Kits (siehe Materialtabelle)und aus der Literatur35,36angepasst.
    1. Bereiten Sie ChIP-Verdünnungspuffer, Kernschwellungspuffer, salzarmen Waschpuffer, hohen Salzwaschpuffer, LiCl-Waschpuffer und TE-Puffer vor. Bei 4 °C lagern.
    2. Bereiten Sie SDS-Lysepuffer, 10-fach-Glylyinpuffer und ChIP-Elutionspuffer vor. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
      VORSICHT: Bitte überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt für alle Chemikalien, bevor Sie Puffer herstellen, um eine ordnungsgemäße Handhabung zu gewährleisten.
  2. Drogenbehandlung
    HINWEIS: Siehe Zusatzprotokoll (Schematic 3) für einen Schaltplan der in Schritt 3.2 verwendeten Arzneimittelverdünnungen.
    1. Saat MCF-7 Zellen in zwei 15 cm Kulturschalen und wachsen Zellen zu 90% Konfluenz in 12 ml des gesamten DMEM Mediums. Markieren Sie die Gerichte für das folgende experimentelle Design: Schale 1: DMSO-Steuerung (Referenzpunkt); Schale 2: A-485 (3 m).
      HINWEIS: Für die Kultivierung von MCF-7-Zellen verwenden Sie komplette DMEM-Medien und wachsen bei 37 °C mit 5%CO2. Siehe Tabelle 1 für das vollständige DMEM-Rezept.
    2. In einem sterilen 15 ml konischen Rohr, Pipette 12 ml DMEM-Medien und Pipette 6 l DMSO. Gut mischen.
    3. In einem separaten sterilen 15 ml konischen Rohr, Pipette 12 ml DMEM-Medien und Pipette 6 l A-485 (6 mM in DMSO) um eine Endkonzentration von 3 m A-485 zu erhalten. Gut mischen.
    4. Aspirieren Sie die Medien von Dish 1 und 2.
    5. Fügen Sie die 12 ml verdünnter DMSO in DMEM (Schritt 3.2.2.) zu Schale 1 hinzu.
    6. Fügen Sie die 12 ml von 3 m A-485 in DMEM (Schritt 3.2.3.) zu Schale 2 hinzu.
    7. Die Zellkulturgerichte in den Inkubator zurückgeben und 24 Stunden lang brüten.
  3. Zellfixierung
    1. Pipette 330 l (27,5 l pro ml) von 37% Formaldehyd auf das gesamte Medium und wirbeln die Platte vorsichtig zu mischen.
      VORSICHT: Formaldehyd ist giftig. Für ordnungsgemäße Handhabungsverfahren finden Sie ein Sicherheitsdatenblatt.
    2. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Pipette 2 ml 10x Glycin auf die Platte und wirbeln zu mischen.
    4. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Nach der Inkubation Die Gerichte auf Eis legen und einen Aliquot-Von-Protease-Hemmer-Cocktail auftauen.
    6. Bereiten Sie die folgenden Lösungen sowohl für die DMSO- als auch für die A-485-Beispiele vor, indem Sie die in Schritt 3.1 vorbereiteten Puffer verwenden.
      1. 2 ml PBS mit einer Verdünnung des Protease-Inhibitor-Cocktails von 1:1.000
      2. 1 ml Kernschwellungspuffer mit einer Verdünnung des Proteaseinhibitor-Cocktails von 1:1.000
      3. 0,5 ml SDS-Lysepuffer mit einer Verdünnung des Protease-Inhibitor-Cocktails von 1:1.000
    7. Die Medien aus der Zellkultur zu aspirieren und die Zellen zweimal mit 15 ml kalten PBS zu waschen.
    8. Pipette 2 ml PBS mit dem Protease-Hemmer-Cocktail (Schritt 3.3.6.1) zu den Zellkulturgerichten. Heben Sie die Zellen mit einem Zellschaber in eine Lösung.
    9. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenrohr. Sammeln Sie ggf. die verbleibenden Zellen mit zusätzlichen PBS.
    10. Spin-Rohre bei 800 x g bei 4 °C für 5 min, um die Zellen zu pellet.
    11. Aspirieren Sie den Überstand und die Pipette 1 ml Kernschwellungspuffer mit dem Protease-Hemmer-Cocktail (Schritt 3.3.6.2) zum Pellet. Das Pellet wieder aufsetzen und 10 min auf Eis brüten.
    12. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 2.700 x g bei 4 °C für 5 min zu Pelletkernen.
    13. Aspirieren Sie den Überstand und die Pipette 0,5 ml SDS-Lysepuffer mit dem Protease-Hemmer-Cocktail (Schritt 3.3.6.3) zum Pellet. Das Pellet wieder aufsetzen und 10 min auf Eis brüten.
    14. Bewahren Sie die Chromatinproben bis Schritt 3.4.1 bei -80 °C auf oder fahren Sie sofort mit Schritt 3.4 fort.
  4. DNA-Beschallung
    1. Übertragen Sie 130 l Chromatin aus der DMSO-Probe (Schritt 3.3.14) mit einer Pipette (jeweils 130 l) auf zwei DNA-Beschallungsröhren.
    2. Übertragen Sie 130 l Chromatin aus der A-485-Probe (Schritt 3.3.14) mit einer Pipette (jeweils 130 l) auf zwei DNA-Beschallungsröhren.
    3. Beschallen Sie die DNA auf etwa 150-200 Basenpaarfragmente mit den folgenden Sonicator-Einstellungen: Peak Incident Power (W) von 175, Duty Factor von 10%, 200 Zyklen pro Burst und 430 s Behandlungszeit.
      HINWEIS: Die Sonication-Einstellungen können zwischen den Modellen variieren, und die Einstellungen müssen möglicherweise angepasst werden, um eine angemessene Fragmentgröße für verschiedene Zelllinien zu erreichen.
    4. Halten Sie Proben nach der Beschallung auf Eis.
    5. Das beschallte Chromatin mit einer Pipette und Zentrifuge bei 10.000 x g bei 4 °C 10 min in ein 1,5 ml-Rohr geben.
    6. Pipette der Überstand (enthält beschalltes Chromatin) zu einem neuen Rohr und entsorgen Sie die Trümmer. Beschalltes Chromatin kann bei -80 °C gelagert werden.
  5. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)
    HINWEIS: Siehe Ergänzendes Protokoll (Schematic 3) für einen Schaltplan der IP-Gruppen in Schritt 3.5.
    1. Messen Sie den Proteingehalt des beschallten Chromatins für die DMSO- und A-485-Proben aus Schritt 3.4.6. Der Proteingehalt kann mit den etablierten Protokollen34gemessen werden.
      HINWEIS: Der Einfachheit halber geht dieses Protokoll davon aus, dass der Proteingehalt gleich ist und 100 l beschalltes Chromatin verwendet werden. Andernfalls muss der Proteingehalt zwischen allen Proben in gleichem Volumen ausgeglichen werden.
    2. Pipette 100 l DMSO beschalltes Chromatin auf zwei 1,5 ml-Röhren (je 100 l). Pipette 400 l ChIP-Verdünnungspuffer (mit einer Verdünnung des Protease-Inhibitor-Cocktails von 1:1.000) zu jeder Röhre, um das Gesamtvolumen von bis zu 500 l zu bringen. Entfernen Sie 5 l der Lösung aus einem der Rohre und lagern Sie bei -20 °C als DMSO-Eingang.
    3. Pipette 100 l A-485 beschalltes Chromatin auf zwei 1,5 ml Röhren (je 100 l). Pipette 400 l ChIP-Verdünnungspuffer (mit einer Verdünnung des Protease-Inhibitor-Cocktails von 1:1000) zu jeder Röhre, um ein Gesamtvolumen von bis zu 500 l zu bringen. Entfernen Sie 5 l der Lösung aus einem der Rohre und lagern Sie bei -20 °C als A-485 Eingang.
    4. Mit einer Pipette den Immunpräzipitationsantikörper (z. B. unspezifische IgG-Kontrolle oder H3K27ac-spezifische Antikörper) in die entsprechenden Tuben für die DMSO- und A-485-Proben geben: IP-#1 DMSO-Chromatin mit IgG-Antikörper (5-10 g); IP-#2 DMSO-Chromatin mit H3K27ac-Antikörper (5-10 g); IP-#3 A-485-Chromatin mit IgG-Antikörper (5-10 g); IP-#4 A-485-Chromatin mit H3K27ac-Antikörper (5-10 g).
    5. Fügen Sie jeder Röhre 20 L Protein A-Magnetperlen hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Perlen gut resuspended sind.
    6. Drehen Sie die Proben über Nacht bei 4 °C.
    7. Pellet das Protein A magnetische Perlen mit einem magnetischen Separator und entfernen Sie den Überstand. Stören Sie die Perlen nicht.
    8. Waschen Sie die Perlen mit 500 l bis 1 ml des salzarmen Waschpuffers und drehen Sie sie 5 min bei 4 °C. Führen Sie einen schnellen Spin down durch, pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator, und entfernen Sie den Überstand.
    9. Waschen Sie die Perlen mit 500 l bis 1 ml des hochsalzigen Waschpuffers und drehen Sie sie 5 min bei 4 °C. Führen Sie einen schnellen Spin down durch, pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator, und entfernen Sie den Überstand.
    10. Waschen Sie die Perlen mit 500 l bis 1 ml des LiCl-Waschpuffers und drehen Sie sie 5 min bei 4 °C. Führen Sie einen schnellen Spin down durch, pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator, und entfernen Sie den Überstand.
    11. Waschen Sie die Perlen mit 500 l bis 1 ml TE-Puffer und drehen Sie sie 5 min bei 4 °C. Führen Sie einen schnellen Spin down durch. Bewahren Sie die Perlen bis Schritt 3.5.14 im TE-Puffer auf.
    12. Entfernen Sie Eingangsproben (ab Schritt 3.5.2 und 3.5.3) aus dem Gefrierschrank und halten Sie auf Eis.
    13. Tauen Sie ein Aliquot von Proteinase K.
    14. Pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator und entfernen Sie den TE-Puffer aus den Perlen (ab Schritt 3.5.11).
    15. Fügen Sie jeder Probe, einschließlich der Input-Proben, 100 L ChIP-Elutionspuffer + 1 L Proteinase K hinzu. Mit einem Thermocycler Proben mit Schütteln bei 62 °C für 2 h inkubieren.
    16. Nach 2 h, Wärmeproben auf 95 °C für 10 min mit einem Thermocycler.
    17. Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur.
    18. Pellet-Magnetperlen mit einem magnetischen Separator und Transferüberstand (enthält die DNA von Interesse) auf eine neue 1,5 ml Röhre.
    19. Reinigen Sie die DNA mit einem Standard-PCR-Reinigungskit.
    20. Die gereinigte DNA kann bei -20 °C gespeichert und als Schablone in Standard-qPCR-Protokollen verwendet werden. Befolgen Sie die Herstellerprotokolle zum Ausführen von qPCR.
  6. ChIP-qPCR Datenanalyse
    HINWEIS: Zwei gängige Methoden zur Analyse der ChIP-qPCR-Ergebnisse sind die Faltenanreicherung über den IgG-Antikörper und die 1%-Eingabemethode. Eine ausgezeichnete Vorlage für beide Analysemethoden wird von einer kommerziellen Quelle zur Verfügung gestellt, um schnell Faltenanreicherung für jeden IP-Antikörper / Ziel von Interesse37zu berechnen.
    1. Um die Falzanreicherung und % Input zu berechnen, kopieren und fügen Sie die "Ct-Werte" aus den qPCR-Daten für jeden Antikörper (unspezifisches IgG, IP H3K27ac Antikörper und 1% Input) automatisch in den entsprechenden Bereich in der Analysevorlage ein, und die Fold Enrichment und Yield % Input werden automatisch aufgepoplgen.

Ergebnisse

Der In-vitro-Histon-Acetyltransferase (HAT)-Assay kann verwendet werden, um nach Verbindungen zu suchen, die die p300 HAT-Aktivität in Richtung eines Histonsubstrats hemmen. Abbildung 1A enthält einen experimentellen Schaltplan für den HAT-Test. Anacardinsäure, eine bekannte HATi3,38, wurde in diesem Test in einem Konzentrationsbereich von 12,5-100 m verwendet. Bei 100 m reguliert Anacardinsäure p300 katalysierte Histon-Acetylie...

Diskussion

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) Acetylat mehrere Lysinrückstände an Histonschwänzen und Transkriptionsfaktoren zur Regulierung der Gentranskription2,3. Die Arbeit der letzten zwei Jahrzehnte hat gezeigt, dass KATs, wie CBP/p300, PCAF und GCN5, mit onkogenen Transkriptionsfaktoren interagieren und dazu beitragen, das Tumorwachstum in mehreren soliden Tumortypen4,5,9

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder Offenlegungen zu machen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Stipendien von James und Esther King Biomedical Research Program (6JK03 und 20K07) und Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 und 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation und UF Health Cancer Center unterstützt. Darüber hinaus möchten wir uns bei Dr. Zachary Osking und Dr. Andrea Lin für die Unterstützung während des Publikationsprozesses bedanken.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubeFisher Scientific05-408-129For all methods
10 cm dishSarstedt AG & Co.83.3902For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tipsFisher Scientific02-707-454For all Methods
1000 ul tipsCorning4846For all Methods
10X Glycine bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running BufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBSTFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plateCorning3513For Method 2
15 cm dishSarstedt AG & Co.83.3903For Method 3
15 ml conical tubeSanta Cruz Biotechnologysc-200249For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium AzideFor Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milkFor Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tipsCorning4844For all Methods
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gelThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXFor Methods 1 and 2
5X Assay bufferFor Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis bufferFor Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibodyCell Signaling Technology4771For Method 1
Acetyl-CoASigma-AldrichA2056for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)Cell Signaling TechnologyCST 8173antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)Cell Signaling TechnologyCST 9675antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibodyMillipore SigmaT5168For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acidCayman Chemical13144For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibodyCell Signaling Technology7076For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibodyJackson ImmunoResearch711-035-152For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography filmMIDSCIBX810For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating PlatformStovall Life Science Incorporatednot availableFor Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)HyCloneSH30072.03cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153for buffer preparation
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for SDS sample buffer preparation
CDTASpectrum Chemical125572-95-4For buffer preparation
cell scraperMillipore SigmaCLS3010For Method 3
ChIP dilution bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution BufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 CellsFor Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBECovaris520045Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicatorCovarisS220DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich41639for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815for SDS sample buffer preparation
DMEMCorning10-013-CVcell culture media
EDTAFisher ScientificBP120-1for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatusBio-rad1704070For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation KitMillipore Sigma17-10086For Method 3
FK228 (Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solutionSigma-AldrichF8775for cell fixation
glycerolFisher ScientificBP229-1For buffer preparation
glycineSigma-AldrichG7126for buffer preparation
HEPESSigma-Aldrich54457for buffer preparation
High salt wash bufferFor Method 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP SubstrateMillipore SigmaWBKLS0500For Methods 1 and 2
KClFisher ScientificBP366-500for buffer preparation
LiClSigma-AldrichL9650For buffer preparation
LiCl wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic SeparatorPromegaZ5341For use in Method 3
MethanolSigma-Aldrich494437For buffer preparation
Mini gel tankInvitrogenA25977For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaClFisher Scientific7647-14-5for buffer preparation
NaOHFisher ScientificS318-100for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgGBethyl LaboratoriesP120-101Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup KitQiagen28104For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100XCorning30-002-CIcell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CVFor Methods 2 and 3
PIPESSigma-Aldrich80635for buffer preparation
powdered milkNestle CarnationFor Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transferBio-radFor Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel runningBio-radFor Methods 1 and 2
Prestained Protein LadderThermo Fisher26616For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor CocktailSigma-AldrichPI8340for use in Method 3
Protein A Magentic BeadsNew England BioLabsS1425SFor use in Method 3
Proteinase KNew England BioLabsP8107SFor use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal ControllerMJ Research Inc.PTC-100For Method 1
PVDF Transfer MembraneMillipore SigmaIEVH00005For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1New England BioLabsM2503Sfor use in Method 1
Recombinant p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium AzideFisher Scientific26628-22-8For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500for buffer preparation
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich71725for SDS sample buffer preparation
Standard HeatblockVWR Scientific ProductsMPN: 949030For Methods 1 and 2
Table top centrifugeEppendorf5417RFor all methods
TE bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer bufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin ACayman Chemical58880-19-6HDAC Inhibitor for use in Method 2
TrisFisher ScientificBP152-5for buffer preparation
Triton X-100Sigma-AldrichT8787for buffer preparation
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processorKonica Minolta Medical & Graphic, Inc.SRX-101AFor Methods 1 and 2

Referenzen

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