数百个 C.白化病 细胞生物原子力显微镜测量自动化

摘要

该协议旨在自动化数百个微生物细胞上的自动对焦M测量。首先，微生物固定在PDMS标记显微结构中，然后在数百个固定细胞上自动进行力光谱测量。

摘要

本文介绍的方法旨在自动化生物-AFM实验和力曲线记录。使用此方法，可以自动在 4 小时内记录 1000 个单元上的力曲线。为了保持 4 小时的分析时间，每个单元格的力曲线数减少到 9 或 16。该方法结合了基于 Jython 的程序和在定义模式上组装单元的策略。该计划在商用 Bio-AFM 上实施，可以将尖端集中在阵列的第一个单元格上，然后自动从单元格移动到单元格，同时记录每个单元格上的力曲线。使用这种方法，可以访问细胞的生物物理参数，如其刚性、粘合特性等。通过自动化和分析大量的细胞，可以访问细胞群的行为。这是生物-AFM领域的一个突破，迄今为止，数据只记录在几十个细胞上。

引言

这项工作提供了一种方法，使用原子力显微镜（AFM）对数百个活细胞进行自动力测量。它还提供了一种在 PDMS 微结构盖章上固定微生物的方法，该印章与在液体环境中进行的 AFM 实验相容。

Bio-AFM 是一种高度专业化的技术，用于生物学应用，然后用于研究活细胞。它需要一个训练有素的工程师，他能够分析当时的一个单元格。在这些条件下，可以分析的不同细胞数量相当小，典型的5到10个细胞在4-5小时内。然而，记录在单个细胞上的力测量量通常非常高，并且很容易达到1000。因此，目前对活细胞进行 AFM 力测量的范式是记录数百个力曲线 （FCs），但在数量有限的细胞上。

从统计学上讲，这种方法是值得怀疑的，并提出了样本的代表性问题。事实上，即使在这几个细胞上记录了数百次测量，也很难通过测量几个细胞来评估细胞群的异质性。然而，正是根据这一范式，生物物理学、微生物学和纳米医学^1、2、3取得了重大进展。事实上，单细胞规模的纳米分析提供了关于细胞纳米力学、转膜蛋白组织或抗菌或抗癌药物^{4、5、6、7}的作用机制的新信息。然而，最近对细胞进行的几次高通量生物力学测试已经出现⁸项，表明科学界对改变这一模式和获取细胞群异质性感兴趣。这些测试都依赖于微流体系统来变形细胞，并在压力下光学测量其变形，以间接测量其整体表面弹性^8。然而，这些方法的一个重要问题是它们是单参数的:只有细胞弹性才能被探测到。此外，它们不允许测量附着细胞的机械参数，例如，这可能限制对非循环哺乳动物细胞或生物膜的研究。

涉及AFM的方法已经由S.舍林⁹ 和M.法夫尔¹⁰的团队开发。在纤维素模式⁹上固定细胞，迫使单个细胞采取模式⁹的形状。然后，这个团队绘制了几个单元格的机械特性来定义平均数据，代表14到18个细胞。Farve等人进行的发展旨在通过将AFM罐头¹⁰平行来使测量结果倍化。据我们所知，这种多重方向的工作并没有导致对活细胞的测量。

Dujardin 团队提出的一个有趣的方法是提供一种自动化 AFM，能够识别细胞并在定制井底成像。虽然这种方法不允许分析大量的细胞，它允许自动测试每个井¹¹的不同条件。

我们在这项工作中的目标是更加雄心勃勃，因为我们想要测量至少1000个细胞，以获得不是一个普通的细胞，而是相反，细胞之间的异质性。我们在这里开发的使用 AFM 访问细胞群异质性的战略基于对记录有限数量的力曲线的数百个细胞的分析。与记录有限数量的细胞上大量力曲线的"经典"方法相比，这种方法应被视为补充，因为它不提供相同的信息。事实上，虽然典型的方法允许人们探索单个细胞表面的异质性，使用我们的方法，我们能够访问整个细胞群的异质性。为了实现这一目标，我们结合了一种方法，将微生物（这里为酵母菌种 念珠菌）直接固定到PDMS微结构图章¹²的井中，并开发了一个原始程序，自动将AFM尖端从细胞移动到^细胞13， 并测量每个细胞的机械特性。

研究方案

1. 微生物细胞培养

1. 从甘油库存中恢复细胞。
   注 :C. 白化病 储存在 -80 °C 的甘油库存中，储存在大理石上。
   1. 在 -80 °C 库存中挑选大理石，然后用酵母肽脱克糖 （YPD） agar 擦一擦。在液体培养前，在30°C下将细胞生长2天。
2. 准备液体培养物。
   1. 用5mL的无菌YPD汤填充培养管，并加入一个在YPD agar板上生长的 C.藻类 细胞群。
   2. 在静态条件下在静态条件下生长20小时，然后通过离心收获（4000 x g，5分钟）。丢弃超自然物质，并消除为生物危害废物。
   3. 用10mL醋酸盐缓冲器（醋酸钠，1mCaCl 2，1mM MnCl_2，pH5.2）清洗颗粒₂倍。洗涤之间的离心机（4000 x g，5分钟）。
   4. 将颗粒重新喷入 2 mL 醋酸盐缓冲区，并使用此解决方案在 PDMS 盖章上进行细胞固定。
      注:此悬架无法存储，应为第 3 节准备新鲜。

2. PDMS 邮票准备

1. 硅主模具制备
   1. 使用计算机辅助设计 （CAD） 软件绘制所需的微观结构。
      注:设计井的大小应与捕获的微生物相似。设计应提供100×100井的大矩阵。最好围绕微生物的平均大小制作几个大小略有不同的阵列。
   2. 如果有洁净的房间，请按照先前公布的协议 12 的第 2 到¹²步操作。否则，硅主模具可以从商业洁净室设施中获取。
2. PDMS 邮票成型
   1. 准备55克PDMS预聚合物溶液，其中含有10比1的质量比，PDMS寡头和固化剂（材料表）的混合物。
   2. 在真空下（在 10^{-1 -10-2}条范围内）混合和除气此溶液，直到从 PDMS 解决方案（5 −10 分钟）中去除所有被困气泡。
   3. 再次将 20 克脱气溶液倒入硅主模具和脱气（在 10^{-1 -10-2}条范围内）。
      注:邮票厚度应约为2−3毫米。
   4. 当所有气泡都去除时，在 1 小时内在 80 °C 下对 PDMS 进行静音。
   5. 用手术刀（0.5 x 1.5 厘米^2）切割 PDMS 微结构盖章，方向与可见的微结构阵列平行。
   6. 从硅主模具上剥下邮票。
   7. 返回邮票，以展示其上侧的微观结构，并将其存放在玻璃滑梯上。确保微观结构正对着玻璃滑梯。将邮票上可见的微观结构与玻璃滑梯的侧面对齐，后者稍后将作为 AFM 自动化过程的参考。
      注:在现阶段，PDMS 邮票已准备好进行细胞固定。PDMS 邮票可以在硅主模具上存储数月。当所有 PDMS 从主模具中去除时，可以再次在主模具上铸造新的 PDMS 印章（为了保证主模具的安全，可以将其复制到聚氨酯中^）14。

3. 样品准备

1. 细胞固定
   1. 离心机（500 x g，5 分钟） 600 μL 的再悬浮细胞溶液，以分离缓冲区和细胞。
   2. 从步骤 3.1.1 到 PDMS 邮票上的超自然人 Pipet 200 μL，在真空下（在 10^{-1 -10-2}酒吧范围内）排气约 40 分钟。
      注:这一步骤对于改善井内的细胞固定非常重要。酵母细胞壁中的分子，存在于超自然物中，可能在这个预润湿步骤中沉积在PDMS表面。这些分子很可能增强细胞的粘附性，并有助于增加冲压率。
   3. 40 分钟后，使用移液器，从 PDMS 表面取出缓冲区并存放，用移液器将细胞溶液的 200 μL 从步骤 1.2.4 中取出，在室温下保存 15 分钟。
   4. 通过对流/毛细膜组装将细胞放入邮票的微观结构中。为此，使用两个方向的玻璃滑梯手动将 200μL 的细胞悬浮在邮票上，角度在 30 到 50°之间。可能需要在邮票上多次通过玻璃滑梯，以达到较高的灌装率。
      注:此方法的完整描述可于¹³日提供。
   5. 用移液器取出细胞悬架。用1mL醋酸盐缓冲器（pH 5.2）清洗邮票3倍，以去除未捕获的细胞。
   6. 用氮流擦干邮票的背面，以确保邮票粘在干燥的培养皿上。
   7. 最后将装满细胞的 PDMS 盖章存放在培养皿（材料表）中，并加满 2 mL 的醋酸盐缓冲器，以保持液体介质中的细胞。
2. 在 AFM 舞台上设置邮票
   1. 启动 AFM 操作时，将舞台中心在 0:0。
   2. 在未说等¹⁵中描述的玻璃和水中对悬臂的灵敏度和弹簧常数进行校准
   3. 拿印有邮票的培养皿，放在AFM培养皿架上。
   4. 将邮票边缘垂直于培养皿架 Y 轴。
      注意:可接受的倾斜角度低于图 1所示的 5° 。
   5. 将自动对焦头放在舞台上，小心步进马达是否足够扩展，以避免尖端在邮票上碰撞。

4. 运行自动对焦程序

注:AFM 计划作为 补充材料 提供 （自动软件2019.pdf）。它需要一个JPK-布鲁克AFM纳米维扎德II或I配备了一个电动舞台和JPK桌面软件版本4.3。该计划是在吉顿（基于蟒蛇2.7的版本）下开发的

1. 数据采集
   1. 使用 AFM 光学显微镜将 AFM 尖端放在 4.5 x 4.5 μm² 井的左角（与细胞大小相对应）上。如果需要另一口井的大小，则中心位于所需油井的左上角。
   2. 在 100 x 100 μm2 区域内执行 64 x 64 力图（Z 范围 = 4 μm，尖端速度 = 90μm_s-1，应用力 3 至 5 nN）。从测量模式下拉框中选择强制映射模式。在力控制映射面板中输入以下参数:Rel. 设定点 = 3 至 5 nN;z 长度 4μm;Z运动:持续时间:延长时间: 0.01s;延迟:0:延迟:0，延迟模式:恒定力，样本速率2048 Hz:Z 闭环取消选中:网格:检查方形图像，快速 100μm，慢:100μm，X 偏移:0μm;Y 偏移: 0μm;网格角度:0度:像素: 64x64;像素比: 1:1
      注:一个典型的结果显示在 图2中。此图像将有助于测量和验证两口井之间的间距。
   3. 注意左上井 （W1） 和左下井 （图 2 上的 W2）的坐标。要做到这一点，在井周围做一个方形的盒子。盒子中心的坐标显示在x，y坐标框中的自动对焦软件的左面板上。
   4. 要打开自动化软件（Automatip_scan.py）:在 JPK 桌面软件中，请单击顶部栏菜单中的"提前"，然后选择打开脚本。在打开的窗口中选择指向补充数据（Automatip_scan.py）中提供的脚本文件的路径。
   5. 在 Jython 脚本的输入框部分（图3 ）中实现 W1 和W2坐标值。在脚本的 P1 可变行 239 中输入 W1 坐标，在 P2 变量行 241 中输入 W2 坐标。 
      注:选择作为初始坐标（W1 和 W2）的油井不应离扫描区域边缘太近。否则，中心算法将无法正确执行，因为它需要测量井两侧 PDMS 表面的高度。例如，请参阅图 4。
   6. 将音高值归因于脚本的音高可变行 245。
   7. 输入 Ws 可变行 248 中的井维度。这从井模式的设计中知道，可以检查与用于验证间距的图像相同的图像（图 2）。
   8. 将保存目录的路径写入行 251，以便在所需的位置保存数据。
   9. 将 总区域 可变行 254 设置为 100 μm 的欲望多重"n"（即使用自动对焦的最大扫描区域）。将要探测的油井总数可以使用此值和间距计算:最大扫描面积/间距*n²。
      注:在 图3示例中，将分析 100 x 100 μm 2 的⁹ 个区域。
   10. 设置力曲线矩阵，行和列（3，3或4，4），记录在 数字扫描可 变行257每井。
       注:在 图 3示例中，每口井将记录 3 x 3 = 9 FCs 的矩阵。
   11. 运行程序。单击 "开始" 按钮。
       注:程序首先自动执行中心算法，以更好地确定 W1 和 W2 井的中心（第 1 步）。然后，它会自动获取第一个扫描区域（第 2 步）每个井上的原力曲线 （FCs） 矩阵。当探测该区域的所有油井时，脚本会自动将 AFM 尖端移动到下一个扫描区域的第一口井。尖端被收回，显微镜阶段移动到下一个区域，尖端再次接近邮票，中心算法再次执行，以自动重新中心在该区域的第一口井 （1'） （步骤 3）上。第一个区域由用户定义，第二个区域位于右侧等，直到到达 n。n+1 区域位于 n 下方，n+2 位于 n+1 的左侧，等，直到达到 2n。2n=1在2n以下，2n+2在2n的右边，等等。在全球范围内，尖端蛇纹穿过整个区域。步骤 2 和 3 会自动重复，直到扫描区域的总数字"n^2"被探测到。 图 5 显示程序的流程图。完成该计划需要大约4小时。
2. 数据分析
   1. 执行"复制文件"蛇脚本（Copy_files_L.py，在 补充数据中提供），将 FCs 文件组织成一个文件夹。此脚本是与 Python 2.7 和 SciPy 模块一起开发的。使用视觉工作室代码软件打开巨蛇脚本。输入路径到一般文件夹（补充数据中提供的脚本的第 67 行）及其存储位置（行 73）。
   2. 打开 AFM 制造商数据处理软件来分析力曲线。在顶部菜单 文件中，选择打开的"光谱曲线批次"。
   3. 在批处理窗口中，选择 补充数据 （硬度处理.jpk-proc-force）中提供的流程。选择过程的最后一步，然后单击 "保留"并"应用到所有人"。所有力曲线都将接受相同的处理。
      注:该过程使用 FCs 文件中的校准将偏转曲线转换为牛顿校准的力曲线;应用数据平滑算法（平均连续 3 个点）:基线被转换为零轴休息;将联系点推断为联系点，并抵消FC以将联系点置于坐标位置（0，0）:悬臂的弯曲减去到氟氯化碳，缩回坡度安装。在数据处理结束时，软件生成一个文件，其中包含每个 FCs 的表:其名称、年轻的 Modulus、接触点、粘附力、斜坡等。
   4. 对于所有实验，重复步骤 4.2.1 到 4.2.3。小心将数据保存在不同的文件夹中（即:"已处理"和"已处理"）。
   5. 使用 补充数据 中提供的 R 脚本绘制直方图和框图并执行 ANOVA 统计处理。
      1. 要打开 R 脚本（DataAnalisys.R），请使用 R 工作室软件并加载包含与数据处理软件 （.tsv） 提取的信息的文件。
      2. 在环境窗口上使用 导入数据集 按钮，从显示的列表 中从文本（读取器） 中选择，并在新窗口中选择 浏览器 按钮并查找。tsv 文件。
      3. 加载文件后，选择要包含的列（刚度和粘连性）进行分析。要运行所有代码，按 Ctrl+阿尔特\R。
         注:该脚本适用于4个数据集，考虑两个实验，既有未经处理的细胞，也包括未经处理的细胞。可以执行脚本块，并查看变量如何根据执行的功能变化。

结果

我们使用上述协议来分析卡波芬金对机会性人类病原体C.白化病菌在其酵母形式的生物物理特性的影响。卡斯波芬金是当其他药物因细胞向抗真真药发展而无效时使用抗真果分子的最后机会。其作用机制基于对负责 é glucan 合成的复杂 fks1/Fks2 的子单位 Fks2 的抑制。由于胶质是真菌细胞壁^16、17的主要成分，我们预计细胞壁的生物物理特性会改变:刚...

讨论

这种方法提供的主要改进是在确定的时间内测量的细胞数量显著增加。对应项是减少每个单元格测量的点数。这意味着这种方法不是为提供单个细胞的详细分析而设计的。该方法仅适用于可安装在 PDMS 盖章井中的细胞。邮票是相当通用的，而它包含1.5 x 1.5 μm² 至6 x 6 μm²的井。仍然不可能固定杆菌或更大的细胞。邮票和毛细管对流沉积不能用来固定更大的哺乳动物细胞（长度约100?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM cantilever	Bruker AFM probes	MLCT	The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m
AFM data analysis	JPK-Bruker	JPK Data processing version minimum 5.1.8	Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount
AFM Petri dishes	WPI	FluoroDish FD35-100	The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Atomic force Microscope (AFM)	JPK-Bruker	Nanowizard II or III	the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage
Caspofungin	Sigma-Aldrich	SML0425-5MG	Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)
Code editor	Microsoft	Visual Studio Code version 1.40.1	https://code.visualstudio.com/
Cryobeads	IFU	CB12
Dessicator/Degassing chamber	Fisherbrand	15594635	The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.
Petri dish heater	JPK-Bruker	PetriDishHeater	This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Sodium acetate buffer pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899	The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months
Statistical analysis language	https://www.r-project.org	R version 3.6.1	R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment
Statistical analysis software	https://rstudio.com	R studio version 1.1.463	collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028	Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set
Yeast Peptone D Broth	Difco	242820
YPD Agar	Difco	DF0427-17-6