Автоматизация измерений биоатомным силовым микроскопом на сотнях клеток C. albicans

Резюме

Этот протокол направлен на автоматизацию измерений AFM на сотнях микробных клеток. Сначала микробы иммобилизуются в микроструктуры штампа PDMS, а затем измерения силовой спектроскопии выполняются автоматически на сотнях иммобилизованных клеток.

Аннотация

Метод, представленный в этой статье, направлен на автоматизацию экспериментов Bio-AFM и регистрацию кривых силы. Используя этот метод, можно автоматически записывать кривые сил на 1000 ячейках за 4 часа. Для поддержания 4-часового времени анализа количество кривых силы на ячейку уменьшается до 9 или 16. Метод сочетает в себе программу на основе Jython и стратегию сборки ячеек по определенным шаблонам. Программа, реализованная на коммерческом Bio-AFM, может центрировать наконечник на первой ячейке массива, а затем автоматически перемещаться от ячейки к ячейке, записывая кривые силы на каждой клетке. Используя эту методологию, можно получить доступ к биофизическим параметрам клеток, таким как их жесткость, их адгезионные свойства и т. Д. Благодаря автоматизации и большому количеству проанализированных клеток можно получить доступ к поведению клеточной популяции. Это прорыв в области Bio-AFM, где данные до сих пор были записаны только на нескольких десятках клеток.

Введение

Эта работа предоставляет методологию для выполнения автоматических измерений силы на сотнях живых клеток с использованием атомно-силового микроскопа (AFM). Он также предоставляет метод иммобилизации микробов на микроструктурированной марке PDMS, который совместим с экспериментами AFM, проводимыми в жидкой среде.

Bio-AFM - это узкоспециализированная технология, разработанная для применения в биологии, а затем используемая для изучения живых клеток. Для этого требуется обученный инженер, который может анализировать одну клетку в то время. В этих условиях количество различных клеток, которые могут быть проанализированы, довольно мало, типично от 5 до 10 клеток за 4-5 часов. Однако количество измерений силы, регистрируемых на одной ячейке, обычно очень велико и может легко достигать 1000. Таким образом, текущая парадигма измерения силы AFM на живых клетках заключается в регистрации сотен кривых силы (ФК), но на ограниченном числе клеток.

Статистически такой подход вызывает сомнения, и поднимает вопрос о репрезентативности выборки. Действительно, трудно, например, оценить гетерогенность клеточной популяции, измеряя только несколько клеток, даже если на этих нескольких клетках регистрируются сотни измерений. Однако именно на основе этой парадигмы были достигнуты значительные успехи в биофизике, микробиологии и наномедицине^1,2,3. Действительно, нанометровый анализ в масштабе одиночных клеток дал новую информацию по клеточной наномеханике, об организации трансмембранных белков или механизме действия противомикробных или противоопухолевых препаратов^4,5,6,7. Однако в последнее время появилось несколько высокопроизводительных биомеханических тестов, проведенных на клетках^8,показывающих заинтересованность научного сообщества в изменении этой парадигмы и доступе к гетерогенности клеточной популяции. Все эти тесты полагаются на микрофлюидные системы для деформирования клеток и оптического измерения их деформации под напряжением для получения косвенной меры их общей поверхностной^{эластичности 8.} Однако важной проблемой этих методов является то, что они являются монопараметрическими: можно исследовать только эластичность клеток. Более того, они не позволяют измерять механические параметры адгезивных клеток, что может быть ограничено для исследований нециркулирующих клеток млекопитающих или биопленок, например.

Подходы с участием AFM были разработаны командами S. Scheuring⁹ и M. Favre^10. Scheuring et al. иммобилизовалы клетки на фибронектиновых паттернах^9,заставляя отдельные клетки принимать форму паттерна^9. Затем эта команда наметила механические свойства нескольких ячеек, чтобы определить средние данные, представляющие от 14 до 18 клеток. Разработка, выполненная Farve et al., направлена на мультиплексирование измерений путем распараллеливания кантилеверов AFM^10. Насколько нам известно, эта работа в направлении мультиплексирования не привела к измерениям на живых клетках.

Интересный подход, предложенный командой Дюжардена, представляет собой автоматизированный AFM, способный идентифицировать клетки и визуализывать их на дне изготовленных на заказ скважин. Хотя этот метод не позволяет проводить анализ большой популяции клеток, он позволяет автоматически тестировать различные условия в каждой скважине^11.

Наша цель в этой работе более амбициозна, так как мы хотели измерить не менее 1000 клеток для доступа не к средней клетке, а, наоборот, к гетерогенности между клетками. Стратегия, которую мы разработали здесь для доступа к гетерогенности клеточной популяции с помощью AFM, основана на анализе сотен клеток, на которых регистрируется ограниченное количество кривых силы. По сравнению с «классическим» подходом, записывающим большое количество кривых силы на ограниченном числе ячеек, этот подход следует рассматривать как комплементарный, поскольку он не дает такой же информации. Действительно, в то время как типичный метод позволяет исследовать гетерогенность отдельной клеточной поверхности, используя наш подход, мы можем получить доступ ко всей гетерогенности клеточной популяции. Для достижения этой цели мы объединили метод, который непосредственно обездвиживает микробов (здесь дрожжевой вид Candida albicans)в колодцы PDMS микроструктурированного штампа^12,и разработали оригинальную программу для автоматического перемещения наконечника AFM из клетки в клетку¹³ и измерения механических свойств каждой клетки.

протокол

1. Культура микробных клеток

1. Оживите клетки из глицеринового запаса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: C. albicans хранят при -80 °C в глицериновых бульонах, на мраморе.
   1. Выберите шарик при -80 °C и натрите его дрожжевым агаром пептон декстрозы (YPD). Выращивайте клетки в течение 2 дней при 30 °C, перед жидким культивационным культивированием.
2. Подготовьте жидкие культуры.
   1. Заполните культуральный пробирку 5 мл стерильного отвара YPD и добавьте одну колонию клеток C. albicans, выращенных на агаревой пластине YPD.
   2. Выращивать культуру в статических условиях при 30 °С в течение 20 ч перед сбором урожая центрифугированием (4000 х г,5 мин). Выбросьте супернатант и устраните как биологические отходы.
   3. Гранулы промыть 2x с 10 мл ацетатного буфера (8 мМ ацетата натрия, 1 мМ CaCl_2,1 мМ_MnCl2,рН 5,2). Центрифуга (4000 х г,5 мин) между стирками.
   4. Повторно суспендировать гранулу в 2 мл ацетатного буфера и использовать этот раствор для иммобилизации клеток на штампе PDMS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта суспензия не может храниться и должна быть приготовлена свежей для раздела 3.

2. Подготовка штампа PDMS

1. Подготовка силиконовой формы
   1. Нарисуйте нужные микроструктуры с помощью программного обеспечения автоматизированного проектирования (CAD).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спроектированные колодцы должны быть такого же размера, как и микроб для ловушки. Конструкция должна предусматривать большую матрицу скважин 100 х 100 по списку. Лучше всего сделать несколько массивов с немного разными размерами вокруг среднего размера микроба.
   2. Если чистая комната доступна, выполните шаги 2-12 ранее опубликованного протокола^12. В противном случае силиконовая мастер-форма может быть приобретена в коммерческих помещениях чистых помещений.
2. Формование штампов PDMS
   1. Готовят 55 г раствора преполимера PDMS, содержащего смесь 10 к 1, массовое соотношение, олигомеров PDMS и отверждающего агента(Таблица материалов).
   2. Перемешайте и дегазируйте этот раствор в вакууме (в диапазоне 10^-1-10^-2 бар) до тех пор, пока все захваченные пузырьки не будут удалены из раствора PDMS (5−10 мин).
   3. Вылейте 20 г дегазированного раствора на кремниевую главную форму и снова дегазуйте (в диапазоне 10^-1-10^-2 бар).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина штампа должна составлять около 2−3 мм.
   4. Когда все пузырьки удалены, сетчатый PDMS при 80 °C в течение 1 ч.
   5. Вырежьте микроструктурированную печать PDMS скальпелем (0,5 х 1,5^см2)в направлении, параллельном видимым массивам микроструктур.
   6. Снимите штамп с силиконовой мастер-формы.
   7. Верните штамп, чтобы выставить микроструктуры на его верхнюю сторону и нанесите его на стеклянный слайд. Убедитесь, что микроструктуры обращены вверх от стеклянной горки. Выровняйте микроструктуры, которые можно увидеть на штампе, со стороны стеклянного слайда, который впоследствии послужит ориентиром для процедуры автоматизации AFM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе штамп PDMS готов к иммобилизации клеток. Штампы PDMS могут храниться на силиконовой мастер-форме в течение нескольких месяцев. Когда все PDMS удалены из основной формы, новый штамп PDMS может быть отлит снова на мастер-форму (чтобы сохранить мастер-форму в безопасности, можно воспроизвести ее в полиуретане)^14.

3. Пробоподготовка

1. Иммобилизация клеток
   1. Центрифуга (500 х г,5 мин) 600 мкл раствора повторно суспендированной ячейки для отделения буфера от клеток.
   2. Пипетка 200 мкл супернатанта со стадии 3.1.1 на штамп PDMS и дегаз под вакуумом (в диапазоне 10^{-1 -10-2} бар) в течение примерно 40 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для улучшения иммобилизации клеток внутри колодцев. Молекулы из клеточной стенки дрожжей, присутствующие в надводном веществе, вероятно, осаждаются на поверхности PDMS во время этой предварительной смачивания. Эти молекулы, скорее всего, усиливают адгезию клеток и способствуют увеличению скорости заполнения штампа.
   3. Через 40 мин пипеткой вынимают буфер с поверхности PDMS и наносим пипеткой 200 мкл клеточного раствора со ступени 1.2.4 в течение 15 мин при комнатной температуре.
   4. Поместите клетки в микроструктуры штампа конвективным/капиллярным сбором. Для этого вручную распределите 200 мкл суспензии ячеек по штампу, используя стеклянный слайд в обоих направлениях с углом от 30 до 50°. Возможно, потребуется пройти стеклянный слайд несколько раз на штампе, чтобы добиться высокой скорости заполнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полное описание этого метода доступно¹³.
   5. Снимите суспензию ячейки пипеткой. Промыть штамп 3x 1 мл ацетатного буфера, рН 5,2, чтобы удалить клетки, которые не были захвачены.
   6. Высушите заднюю часть штампа с помощью потока азота, чтобы убедиться, что штамп будет прилипать к сухой чашке Петри.
   7. Наконец, нанесите штамп PDMS, заполненный ячейками, в чашку Петри(Таблица материалов)и заполните ее 2 мл ацетатного буфера для поддержания клеток в жидкой среде.
2. Установка штампа на сцене AFM
   1. Центр дела в центре в 0:0 при запуске операций AFM.
   2. Калибровка чувствительности и постоянной пружины консольного инструмента на стекле и в воде, как описано в Unsay et al.¹⁵
   3. Возьмите чашку Петри со штампом и поместите ее в держатель чашки AFM Petri.
   4. Выровнять край штампа перпендикулярно оси Y держателя чашки Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимый угол наклона составляет менее 5°, как показано на рисунке 1.
   5. Поместите головку AFM на сцену и будьте осторожны, чтобы шаговые двигатели были достаточно вытянуты, чтобы избежать падения наконечника на штамп.

4. Запуск программы AFM

ПРИМЕЧАНИЕ: Программа AFM предоставляется в качестве дополнительного материала (AutomatipSoftware2019.pdf). Для этого требуется JPK-Bruker AFM Nanowizard II или III, оснащенный моторизованной ступенью и настольным программным обеспечением JPK версии 4.3. Программа была разработана под Jython (версия на основе python 2.7)

1. сбор данных
   1. Центрировать наконечник AFM в верхней части левого угла скважин размером 4,5 x 4,5 мкм² (соответствующих размеру ячейки) с помощью оптического микроскопа AFM. Если нужен другой размер скважины, центр в левом верхнем углу нужной скважины.
   2. Выполните карту сил 64 x 64 (диапазон Z = 4 мкм, скорость наконечника = 90 мкм·с^-1,приложенная сила от 3 до 5 нН) на площади 100 x 100 мкм². Выберите Режим принудительного сопоставления в раскрывающемся разделе Режим измерения. В панель отображения силы введите следующие параметры: Rel. Setpoint = от 3 до 5 нН; z длина 4 мкм; Движение Z: постоянная длительность; время продления: 0.01s; внешняя задержка:0; Задержка Retr: 0, Режим задержки: Постоянная сила, Частота дискретизации 2048 Гц; Z замкнутый цикл снят с флажка; Сетка: контрольное квадратное изображение, быстрое 100 мкм, медленное: 100 мкм, X смещение: 0 мкм; Смещение Y: 0 мкм; угол сетки: 0 градусов; Пиксели: 64x64; соотношение пикселей: 1:1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный результат показан на рисунке 2. Это изображение поможет измерить и проверить шаг между двумя скважинами.
   3. Обратите внимание на координаты центра верхней левой скважины (W1) и нижней левой скважины (на рисунке 2она называется W2). Для этого сделайте квадратный ящик вокруг колодца. Координата центра поля отображается на левой панели программного обеспечения AFM в полях координат x,y.
   4. Чтобы открыть программное обеспечение автоматизации(Automatip_scan.py):в настольном программном обеспечении JPK нажмите на кнопку вперед в меню верхней панели и выберите открыть скрипт. В открывшемся окне выберите путь к файлу скрипта, указанному в разделе Дополнительные данные (Automatip_scan.py).
   5. Реализуйте значения координат W1 и W2 в разделе Inputs box скрипта Jython(рисунок 3). Введите координаты W1 в строку переменной P1 239 скрипта и координаты W2 в строку переменной P2 241.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины, выбранные в качестве начальных координат (W1 и W2), не должны находиться слишком близко от края зоны сканирования. В противном случае алгоритм центрирования не будет работать правильно, потому что ему нужно измерить высоту на поверхности PDMS с каждой стороны скважины. Пример см. на рисунке 4.
   6. Привяжу значение pitch к переменной pitch строке 245 скрипта.
   7. Введите размер скважины в переменной линии Ws 248. Это известно из конструкции схем скважины и может быть проверено на том же изображении, что и то, которое используется для проверки шага(рисунок 2).
   8. Запишите путь к каталогу сохранения в строке 251, чтобы сохранить данные в нужном месте.
   9. Установите переменную totalArea в строке 254 на желаемую кратную "n" 100 мкм (то есть максимальную область сканирования используемой AFM). Общее количество скважин, которые будут прощупываться, может быть рассчитано с использованием этого значения и шага: максимальная площадь сканирования/шаг*n^2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В примере с рисунком 3будут проанализированы 9 областей размером 100 х 100 мкм2.
   10. Задайте кривые силы матрицы, строки и столбца (3, 3 или 4, 4), записанные на скважину в переменной строке 257 numScans.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В примере на рисунке 3для каждой скважины будет записана матрица 3 x 3 = 9 ФК.
   11. Запустите программу. Нажмите на кнопку Пуск.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Программа сначала автоматически выполняет алгоритм центрирования для лучшего определения центра скважин W1 и W2 (шаг 1). Затем он автоматически получает матрицу кривых силы (ФК) на каждой скважине первой области сканирования (шаг 2). Когда все скважины этой области прощупываются, сценарий автоматически перемещает наконечник AFM в первую скважину следующей зоны сканирования. Наконечник втягивается, ступень микроскопа перемещается в следующую область, наконечник снова приближается к штампу и алгоритм центрирования выполняется снова для автоматического повторного центрирования на первой скважине (1') этой области (шаг 3). Первая область определяется пользователем, вторая - справа и т.д. до тех пор, пока не будет достигнуто n. область n+1 находится под n, n+2 слева от n+1 и т.д. до достижения 2n. 2n+1 находится под 2n, а 2n+2 справа на 2n и т.д. Глобально наконечник серпантинов проходит через общую площадь. Этапы 2 и 3 повторяются автоматически до тех пор, пока не будет исследовано общее количество"n2"областей сканирования. На рисунке 5 представлена блок-схема программы. Для завершения программы требуется ~ 4 ч.
2. анализ данных
   1. Выполните скрипт python "Copy files"(Copy_files_L.py,предоставленный в разделе Дополнительные данные),чтобы упорядочить файлы FCs в одну папку. Этот скрипт был разработан на основе Python 2.7 и модуля SciPy. Используйте программное обеспечение Visual Studio Code для открытия скрипта python. Введите путь к общей папке (строка 67 скрипта, представленная в дополнительных данных) и где она будет храниться (строка 73).
   2. Откройте программное обеспечение для обработки данных производителя AFM для анализа кривых силы. В верхнем меню Файлвыберите открыть 'пакет кривых спектроскопии.
   3. В окне пакетной обработки выберите процесс, указанный в разделе Дополнительные данные (StiffnessProcess.jpk-proc-force). Выберите последний шаг процесса и нажмите Сохранить и применить ко всем. Все силовые кривые будут получать одинаковую обработку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс использует калибровку из файлов FCs для преобразования кривых отклонения в кривые силы, откалиброванные в Ньютоне; применяется алгоритм сглаживания данных (в среднем 3 последовательных пункта); базовая линия преобразуется в покои на нулевой оси; точка контакта экстраполируется, а КС смещен для размещения точки контакта в точке координаты (0,0); изгиб консольного наклона вычитается из ФК, устанавливается уклон втягивания. В конце обработки данных программное обеспечение генерирует файл, который содержит таблицу, дающую для каждого ФК: его название, модуль Юнга, контактную точку, силу сцепления, уклоны и т. Д.
   4. Повторите шаги с 4.2.1 по 4.2.3 для всех экспериментов. Будьте осторожны при сохранении данных в разных папках (например: "...\TREATED\" и "...\UNTREATED\")
   5. Используйте скрипт R, приведенный в разделе Дополнительные данные, для построения гистограмм и коробчатых графиков и выполнения статистической обработки ANOVA.
      1. Чтобы открыть скрипт R (DataAnalisys.R), используйте программное обеспечение R studio и загрузите файлы, содержащие информацию, извлеченную с помощью программного обеспечения для обработки данных (.tsv).
      2. В окне среды используйте кнопку Импорт набора данных, из отображаемого списка выберите из текста (readr) и в новом окне нажмите кнопку Браузер и найдите файл .tsv.
      3. После загрузки файла выберите столбцы (жесткость и адгезия), которые будут включены для анализа. Чтобы выполнить весь код, нажмите клавиши CTRL+ALT+R.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт работает с 4 наборами данных, рассмотрим два эксперимента, как с необработанными, так и с обработанными клетками. Можно выполнить блоки скрипта и посмотреть, как изменяются переменные в соответствии с выполняемыми функциями.

Результаты

Мы использовали описанный протокол для анализа влияния каспофунгина на биофизические свойства условно-патогенного микроорганизма человека C. albicans в его дрожжевой форме. Каспофунгин является противогрибковой молекулой последнего шанса, используемой, когда другие препараты неэф?...

Обсуждение

Основным улучшением, обеспечиваемым данной методологией, является значительное увеличение количества измеряемых клеток за определенный промежуток времени. Аналогом является уменьшение количества точек, измеренных на ячейку. Это означает, что этот метод не предназначен для обеспече?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM cantilever	Bruker AFM probes	MLCT	The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m
AFM data analysis	JPK-Bruker	JPK Data processing version minimum 5.1.8	Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount
AFM Petri dishes	WPI	FluoroDish FD35-100	The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Atomic force Microscope (AFM)	JPK-Bruker	Nanowizard II or III	the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage
Caspofungin	Sigma-Aldrich	SML0425-5MG	Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)
Code editor	Microsoft	Visual Studio Code version 1.40.1	https://code.visualstudio.com/
Cryobeads	IFU	CB12
Dessicator/Degassing chamber	Fisherbrand	15594635	The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.
Petri dish heater	JPK-Bruker	PetriDishHeater	This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Sodium acetate buffer pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899	The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months
Statistical analysis language	https://www.r-project.org	R version 3.6.1	R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment
Statistical analysis software	https://rstudio.com	R studio version 1.1.463	collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028	Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set
Yeast Peptone D Broth	Difco	242820
YPD Agar	Difco	DF0427-17-6