Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

Resumo

Este protocolo visa automatizar as medições de AFM em centenas de células microbianas. Primeiro, micróbios são imobilizados em microestruturas de selo PDMS e, em seguida, as medições de espectroscopia de força são realizadas automaticamente em centenas de células imobilizadas.

Resumo

O método apresentado neste artigo visa automatizar experimentos Bio-AFM e o registro de curvas de força. Usando este método, é possível registrar curvas de forças em 1000 células em 4 horas automaticamente. Para manter um tempo de análise de 4 horas, o número de curvas de força por célula é reduzido para 9 ou 16. O método combina um programa baseado em Jython e uma estratégia para a montagem de células em padrões definidos. O programa, implementado em um Bio-AFM comercial, pode centralizar a ponta na primeira célula da matriz e, em seguida, mover-se, automaticamente, de célula para célula enquanto grava curvas de força em cada célula. Utilizando essa metodologia, é possível acessar os parâmetros biofísicos das células, como sua rigidez, suas propriedades adesivas, etc. Com a automação e o grande número de células analisadas, pode-se acessar o comportamento da população celular. Este é um avanço no campo Bio-AFM onde os dados foram, até agora, registrados em apenas algumas dezenas de células.

Introdução

Este trabalho fornece uma metodologia para realizar medições automáticas de força em centenas de células vivas usando um microscópio de força atômica (AFM). Também fornece um método para imobilizar micróbios em um selo microestruturado PDMS compatível com experimentos AFM realizados em um ambiente líquido.

Bio-AFM é uma tecnologia altamente especializada concebida para aplicações em biologia e, em seguida, usada para estudar células vivas. Requer um engenheiro treinado que possa analisar uma célula no momento. Nessas condições, o número de células diferentes que podem ser analisadas é bastante pequeno, típico de 5 a 10 células em 4-5 horas. No entanto, a quantidade de medidas de força registradas em uma única célula são geralmente muito altas e podem facilmente chegar a 1000. Assim, o paradigma atual das medições de força afm em células vivas é registrar centenas de curvas de força (FCs), mas em um número limitado de células.

Estatisticamente, essa abordagem é questionável e levanta a questão da representatividade da amostra. De fato, é difícil, por exemplo, avaliar a heterogeneidade de uma população celular medindo apenas algumas células, mesmo que centenas de medidas sejam registradas nessas poucas células. No entanto, é com base nesse paradigma que grandes avanços têm sido feitos na biofísica, microbiologia e nanomedicina^1,2,3. De fato, a análise de nanômetros na escala de células únicas forneceu novas informações sobre a nanomecânica celular, sobre a organização de proteínas transmembranas, ou o mecanismo de ação de drogas antimicrobianas ou anticancerígenas^4,5,6,7. Recentemente, no entanto, vários testes biomecânicos de alto rendimento realizados em células surgiram⁸, mostrando o interesse da comunidade científica em mudar esse paradigma e acessar a heterogeneidade da população celular. Todos esses testes dependem de sistemas microfluidos para deformar as células e medir opticamente sua deformação sob estresse para obter uma medida indireta de sua elasticidade superficial global⁸. No entanto, uma questão importante com esses métodos é que eles são mono-paramétricos: apenas a elasticidade celular pode ser sondada. Além disso, não permitem a medição dos parâmetros mecânicos das células aderentes, o que pode ser limitador para os estudos de células mamíferas não circulantes ou biofilmes, por exemplo.

Abordagens envolvendo AFM foram desenvolvidas pelas equipes de S. Scheuring⁹ e M. Favre¹⁰. Scheuring et al. células imobilizadas nos padrões de fibronectina⁹, forçando as células individuais a tomar a forma do padrão⁹. Em seguida, esta equipe mapeou as propriedades mecânicas de algumas células para definir dados médios, representativos de 14 a 18 células. O desenvolvimento realizado pela Farve et al. teve como objetivo multiplexar as medidas, paralelaizando as cantilevers AFM¹⁰. Pelo que sabemos, esse trabalho na direção multiplexa-se não levou a medições em células vivas.

Uma abordagem interessante proposta pela equipe de Dujardin apresenta um AFM automatizado capaz de identificar células e imagens na parte inferior de poços feitos sob medida. Embora este método não permita a análise de uma grande população de células, permite o teste automático de diferentes condições em cada poço¹¹.

Nosso objetivo neste trabalho é mais ambicioso, pois queríamos medir pelo menos 1000 células para acessar não uma célula média, mas, pelo contrário, a heterogeneidade entre as células. A estratégia que desenvolvemos aqui para acessar a heterogeneidade da população celular usando a AFM baseia-se na análise de centenas de células nas quais um número limitado de curvas de força são registradas. Em comparação com a abordagem "clássica" de registrar um grande número de curvas de força em um número limitado de células, essa abordagem deve ser considerada complementar, uma vez que não fornece as mesmas informações. De fato, enquanto o método típico permite sondar a heterogeneidade da superfície celular individual, usando nossa abordagem, somos capazes de acessar toda a heterogeneidade da população celular. Para alcançar esse objetivo, combinamos um método que imobiliza diretamente micróbios (aqui a espécie de levedura Candida albicans) nos poços de um selo microestruturado PDMS¹², e desenvolve um programa original para mover a ponta AFM, automaticamente, de célula para célula¹³ e medir as propriedades mecânicas de cada célula.

Protocolo

1. Cultura celular microbiana

1. Reviva células de um estoque de glicerol.
   NOTA: Os albicanos C. são armazenados a -80 °C em estoques de glicerol, em mármores.
   1. Escolha uma bola de gude no caldo -80 °C e esfregue-o no ágar peptone dextrose (YPD) de levedura. Cresça as células por 2 dias a 30 °C, antes do cultivo líquido.
2. Prepare culturas líquidas.
   1. Encha um tubo de cultura com 5 mL de caldo YPD estéril e adicione uma única colônia de células C. albicans, cultivadas na placa de ágar YPD.
   2. Cresça a cultura em condições estáticas a 30 °C por 20 h antes de colher por centrifugação (4000 x g, 5 min). Descarte o supernatante e elimine como resíduos de risco biológico.
   3. Lave as pelotas 2x com 10 mL de tampão de acetato (acetato de sódio de 8 mM, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, pH 5.2). Centrífuga (4000 x g, 5 min) entre as lavagens.
   4. Resuspenda a pelota em 2 mL de tampão de acetato e use esta solução para imobilização celular no selo PDMS.
      NOTA: Esta suspensão não pode ser armazenada e deve ser preparada fresca para a seção 3.

2. Preparação do selo PDMS

1. Preparação do molde mestre do silício
   1. Desenhe as microestruturas desejadas usando o software CAD (Computer Assisted Design, design assistido por computador).
      NOTA: Os poços projetados devem ter tamanho semelhante ao micróbio a prender. O design deve fornecer uma grande matriz de poços 100 x 100 na lista. É melhor fazer várias matrizes com tamanhos ligeiramente diferentes em torno do tamanho médio do micróbio.
   2. Se houver uma sala limpa, siga as etapas 2 a 12 do protocolo¹²publicado anteriormente . Caso contrário, o molde mestre de silício pode ser adquirido a partir de instalações comerciais de sala limpa.
2. Moldagem de selo PDMS
   1. Prepare 55 g de solução prepolímero PDMS contendo uma mistura de 10 a 1, proporção de massa, de oligômeros PDMS e agente de cura(Tabela de Materiais).
   2. Misture e desgase esta solução sob vácuo (na faixa de 10^-1-10^-2 barras) até que todas as bolhas presas sejam removidas da solução PDMS (5-10 min).
   3. Despeje 20 g da solução desgaseada no molde mestre de silício e degas novamente (na faixa de 10^-1-10^-2 barras).
      NOTA: A espessura do selo deve ser em torno de 2-3 mm.
   4. Quando todas as bolhas forem removidas, reticule o PDMS a 80 °C durante 1 h.
   5. Corte o selo microestruturado PDMS com um bisturi (0,5 x 1,5 cm²) em direção paralela às matrizes de microestrutura visível.
   6. Descasque o carimbo do molde mestre de silício.
   7. Devolva o selo para exibir as microestruturas em sua parte superior e deposite-o em um escorregador de vidro. Certifique-se de ter as microestruturas voltadas para longe da lâmina de vidro. Alinhe as microestruturas que podem ser vistas no selo com a lateral do escorregador de vidro, que mais tarde servirá de referência para o procedimento de automação AFM.
      NOTA: Nesta fase, o selo PDMS está pronto para imobilização celular. Os selos PDMS podem ser armazenados no molde mestre de silício por vários meses. Quando todo o PDMS é removido do molde mestre, um novo selo PDMS pode ser lançado novamente no molde mestre (para manter o molde mestre seguro, é possível replicá-lo em poliuretano)¹⁴.

3. Preparação da amostra

1. Imobilização celular
   1. Centrífuga (500 x g, 5 min) 600 μL da solução celular resuspended para separar o buffer das células.
   2. Pipet 200 μL do supernaspeuta do passo 3.1.1 para o selo PDMS, e degas sob vácuo (na faixa de 10^-1-10^-2 barras) por cerca de 40 min.
      NOTA: Este passo é importante para melhorar a imobilização celular dentro dos poços. Moléculas da parede celular de levedura, presentes no supernasce, provavelmente são depositadas na superfície do PDMS durante este passo pré-molhada. Essas moléculas, provavelmente, aumentam a adesão das células e contribuem para o aumento da taxa de enchimento do selo.
   3. Após 40 min, com uma pipeta, remova o tampão da superfície do PDMS e deposite, com uma pipeta, 200 μL da solução celular da etapa 1.2.4 para 15 min a temperatura ambiente.
   4. Coloque as células nas microestruturas do selo por meio de montagem convectiva/capilar. Para isso, espalhe manualmente 200 μL de suspensão de células através do selo usando um slide de vidro em ambas as direções com um ângulo entre 30 e 50°. Pode ser necessário passar o slide de vidro várias vezes no selo para obter uma alta taxa de enchimento.
      NOTA: A descrição completa deste método está disponível¹³.
   5. Remova a suspensão da célula com uma pipeta. Lave o carimbo 3x com 1 mL de tampão de acetato, pH 5.2 para remover as células que não estavam presas.
   6. Seque a parte de trás do selo usando o fluxo de nitrogênio, a fim de garantir que o carimbo adere à placa de Petri seca.
   7. Por fim, deposite o selo PDMS cheio de células em uma placa de Petri(Tabela de Materiais) e preencha-o com 2 mL de tampão de acetato para manter as células em meio líquido.
2. Definindo o carimbo no estágio AFM
   1. Centro do palco em 0:0 quando iniciar as operações AFM.
   2. Calibrar a sensibilidade e a constante de mola do cantilever no vidro e na água, conforme descrito em Unsay et al.¹⁵
   3. Pegue a placa de Petri com o carimbo e coloque-a no porta-pratos AFM Petri.
   4. Alinhe a borda do selo perpendicular ao eixo Y do suporte da placa de Petri.
      NOTA: Um ângulo de inclinação aceitável está abaixo de 5° como ilustrado na Figura 1.
   5. Coloque a cabeça AFM sobre o palco e tenha cuidado para que os motores do estepe estejam suficientemente estendidos para evitar que a ponta caia no carimbo.

4. Executando o programa AFM

NOTA: O programa AFM é fornecido como material suplementar (AutomatipSoftware2019.pdf). Ele requer um JPK-Bruker AFM Nanowizard II ou III equipado com um estágio motorizado e software de desktop JPK versão 4.3. O programa foi desenvolvido sob Jython (versão baseada em python 2.7)

1. Aquisição de dados
   1. Centralizar a ponta AFM em cima do canto esquerdo dos poços de 4,5 x 4,5 μm² (correspondente ao tamanho da célula) usando o microscópio óptico AFM. Se for necessário outro tamanho de poço, centralizará no canto superior esquerdo dos poços desejados.
   2. Realize um mapa de força de 64 x 64 (faixa Z = 4 μm, velocidade de ponta = 90 μm·s^-1, força aplicada de 3 a 5 nN) sobre uma área de 100 x 100 μm². Selecione o modo de mapeamento de força na caixa de drop-down do modo de medição. No painel de mapeamento de controle de força inserindo os seguintes parâmetros: Rel. Setpoint = 3 a 5 nN; z comprimento 4 μm; Movimento Z: duração constante; tempo de extensão: 0.01s; ramal. atraso:0; Atraso do Retr: 0, Modo de atraso: Força Constante, Taxa de Amostra de 2048 Hz; Z loop fechado sem verificação; Grade: verifique imagem quadrada, Rápido 100 μm, lento: 100μm, X offset: 0 μm; Y offset: 0 μm; ângulo da grade: 0 grau; Pixels: 64x64; proporção de pixels: 1:1
      NOTA: Um resultado típico é mostrado na Figura 2. Esta imagem ajudará a medir e verificar o arremesso entre dois poços.
   3. Observe as coordenadas do centro do poço superior esquerdo (W1) e do fundo esquerdo bem (referido como W2 na Figura 2). Para isso, faça uma caixa quadrada ao redor do poço. A coordenada do centro da caixa aparece no painel esquerdo do software AFM em caixas de coordenadas x,y.
   4. Para abrir o software de automação (Automatip_scan.py): no software de desktop JPK clique com antecedência no menu da barra superior e selecione abrir o script. Na janela que abre selecione o caminho para o arquivo de script fornecido em Dados Complementares (Automatip_scan.py).
   5. Implementar valores de coordenadas W1 e W2 na seção Caixa de Entradas do script Jython(Figura 3). Insira as coordenadas W1 na linha variável P1 239 do script e as coordenadas W2 na linha variável P2 241.
      NOTA: Os poços selecionados como coordenadas iniciais (W1 e W2) não devem estar muito próximos da borda da área de digitalização. Caso contrário, o algoritmo de centralação não seria executado corretamente porque precisa medir a altura na superfície PDMS em cada lado do poço. Por exemplo, veja a Figura 4.
   6. Atribua o valor do pitch à linha variável de tom 245 do script.
   7. Insira a dimensão do poço na linha variável Ws 248. Isso é conhecido pelo design dos padrões do poço e pode ser verificado na mesma imagem usada para verificar o tom (Figura 2).
   8. Escreva o caminho para o diretório de salvamento na linha 251 para salvar os dados no local desejado.
   9. Defina a linha variável totalArea 254 para o desejo múltiplo "n" de 100 μm (que é a área máxima de varredura do AFM usado). O número total de poços que serão sondados pode ser calculado usando este valor e o campo: área máxima de varredura/pitch*n².
      NOTA: No exemplo da Figura 3,serão analisadas 9 áreas de 100 x 100 μm^2.
   10. Defina a matriz de curvas de força, linha e coluna (3, 3 ou 4, 4), registrada por poço na linha variável numScans 257.
       NOTA: No exemplo da Figura 3,uma matriz de 3 x 3 = 9 FCs será registrada para cada poço.
   11. Executar o programa. Clique no botão Iniciar.
       NOTA: O programa primeiro executa automaticamente um algoritmo de centralização para determinar melhor o centro dos poços W1 e W2 (passo 1). Em seguida, adquire automaticamente a matriz Force Curves (FCs) em cada poço da primeira área de digitalização (passo 2). Quando todos os poços dessa área são sondados, o script move automaticamente a ponta AFM para o primeiro poço da próxima área de digitalização. A ponta é retraída, o estágio do microscópio se move para a próxima área, a ponta é novamente abordada no carimbo e o algoritmo de centralização é executado novamente para reincêncer automaticamente no primeiro poço (1') dessa área (passo 3). A primeira área é definida pelo usuário, a segunda, está à direita etc. até que n seja atingida. n+1 área está abaixo n, n+2 à esquerda de n+1, etc. até que 2n seja atingido. 2n+1 está abaixo de 2n, e 2n+2 está à direita em 2n, etc. Globalmente, a ponta serpentina atravessa a área total. Os passos 2 e 3 são repetidos automaticamente até que o número total "n²" das áreas de varredura tenham sido sondados. A Figura 5 apresenta o fluxograma do programa. Leva ~4h para completar o programa.
2. análise de dados
   1. Execute o script python "Copiar arquivos"(Copy_files_L.py, fornecido em Dados Complementares) para organizar os arquivos FCs em uma pasta. Este script foi desenvolvido com Python 2.7 e o módulo SciPy. Use o software Visual Studio Code para abrir o script python. Caminho de entrada para a pasta geral (linha 67 do script fornecido em dados complementares) e onde será armazenado (linha 73).
   2. Abra o software de processamento de dados do fabricante AFM para analisar as curvas de força. No menu superior Arquivo,selecione abrir 'lote de curvas de espectroscopia.
   3. Na janela de processamento em lote, selecione o processo fornecido em Dados Suplementares (RigidezProcess.jpk-proc-force). Selecione a última etapa do processo e clique em Manter e Aplicar a Todos. Todas as curvas de força receberão o mesmo tratamento.
      NOTA: O processo usa a calibração dos arquivos FCs para converter as curvas de deflexão em curvas de força calibradas em Newton; um algoritmo de alisamento de dados é aplicado (média de 3 pontos consecutivos); a linha de base é traduzida para descansar no eixo zero; o ponto de contato é extrapolado e o FC é deslocado para colocar o ponto de contato na coordenada (0,0); a dobra do cantilever é subtraída para os FCs, a inclinação de retração é montada. No final do tratamento de dados, o software gera um arquivo que contém uma tabela dando para cada FCs: seu nome, Young Modulus, ponto de contato, força de adesão, encostas, etc.
   4. Repita os passos 4.2.1 a 4.2.3 para todos os experimentos. Tenha cuidado para salvar os dados em diferentes pastas (ou seja: "...\TRATADO\" e "...\NÃO TRATADO\")
   5. Use o script R fornecido em Dados Suplementares para traçar histogramas e enredos de caixa e realizar tratamentos estatísticos ANOVA.
      1. Para abrir o script R (DataAnalisys.R),use o software de estúdio R e carregue os arquivos contendo as informações extraídas com o software de processamento de dados (.tsv).
      2. Na janela do ambiente use o botão Importação Dataset, a partir da lista exibida selecionar a partir de texto (leiador) e na nova janela selecione o botão Navegador e encontre o arquivo .tsv.
      3. Uma vez que o arquivo tenha carregado, selecione as colunas (rigidez e adesão) a serem incluídas para a análise. Para executar todo o código, pressione Ctrl+Alt+R.
         NOTA: O script funciona com 4 conjuntos de dados, considere dois experimentos com células não tratadas e tratadas. É possível executar blocos do script e ver como as variáveis mudam de acordo com as funções executadas.

Resultados

Utilizamos o protocolo descrito para analisar o efeito da caspofungin nas propriedades biofísicas do patógeno humano oportunista C. albicans em sua forma de levedura. Caspofungin é uma última chance de molécula antifúngica usada quando outras drogas são ineficazes devido aos mecanismos de resistência que as células desenvolvem em relação aos antifúngicos. Seu mecanismo de ação baseia-se na inibição da subunidade Fks2 do complexo fks1/Fks2 responsável pela síntese ß glucan. Como os glucas são ...

Discussão

A principal melhoria proporcionada por essa metodologia é um aumento significativo no número de células medidas em um determinado período de tempo. A contrapartida é a redução do número de pontos medidos por célula. Significa que este método não foi projetado para fornecer uma análise detalhada de uma única célula. O método só se aplica a células que podem caber nos poços do selo PDMS. O selo é bastante versátil, enquanto contém poços de 1,5 x 1,5 μm² até 6 x 6 μm². Ainda as...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM cantilever	Bruker AFM probes	MLCT	The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m
AFM data analysis	JPK-Bruker	JPK Data processing version minimum 5.1.8	Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount
AFM Petri dishes	WPI	FluoroDish FD35-100	The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Atomic force Microscope (AFM)	JPK-Bruker	Nanowizard II or III	the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage
Caspofungin	Sigma-Aldrich	SML0425-5MG	Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration)
Code editor	Microsoft	Visual Studio Code version 1.40.1	https://code.visualstudio.com/
Cryobeads	IFU	CB12
Dessicator/Degassing chamber	Fisherbrand	15594635	The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do.
Petri dish heater	JPK-Bruker	PetriDishHeater	This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment
Sodium acetate buffer pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899	The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months
Statistical analysis language	https://www.r-project.org	R version 3.6.1	R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment
Statistical analysis software	https://rstudio.com	R studio version 1.1.463	collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028	Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set
Yeast Peptone D Broth	Difco	242820
YPD Agar	Difco	DF0427-17-6