研究冻结和飞行行为的新型帕夫洛夫恐惧调理范式

摘要

防御行为反应取决于威胁强度、接近程度和暴露背景。基于这些因素，我们开发了一个经典的调理范式，在单个受试者中引起有条件的冻结和飞行行为之间的明显过渡。这个模型对于理解焦虑、恐慌和创伤后应激障碍的病理学至关重要。

摘要

与恐惧和焦虑有关的行为显著有助于生物体的生存。然而，对感知到的威胁的夸张防御反应是各种焦虑症的特点，而焦虑症是美国最常见的精神疾病形式。发现负责防御行为的神经生物学机制将有助于开发新的治疗干预措施。帕夫洛维安恐惧调理是研究与恐惧相关的学习和记忆的实验室范式。传统的巴甫洛夫恐惧调理模式的一个主要局限性是，冻结是唯一被监视的防御行为。我们最近开发出一种经过修改的帕夫洛夫恐惧调理范式，使我们能够研究个别受试者体内的有条件冻结和飞行（也称为逃生）行为。这种模式采用更高的强度脚震和更多的配对之间的条件刺激和无条件的刺激。此外，这种有条件的飞行模式利用纯音和白噪声听觉刺激的连续呈现作为条件刺激。在这种模式下进行调理后，小鼠表现出冻结行为，以响应语气刺激和白噪声期间的飞行反应。这种调理模型可用于研究生存所需的行为反应之间的快速和灵活过渡。

引言

恐惧是一种进化保存的适应性反应，对眼前的威胁^1，2。虽然生物体对威胁具有与生俱来的防御反应，但学会的关联对于^对危险3的刺激预测做出适当的防御反应至关重要。控制防御性反应的大脑回路调节不良可能导致与多重衰弱焦虑症相关的不适应反应，如创伤后应激障碍（PTSD）、恐慌障碍⁴和特定恐惧症^5、6。美国成人焦虑症的患病率为19.1%，7、8岁的青少年为31.9%。这些疾病对个人日常生活的负担极高，对他们的生活质量产生负面影响。

在过去的几十年里，帕夫洛维安恐惧调理一直是一个强大的模型系统，以获得巨大的洞察神经机制背后的恐惧相关的学习和记忆^{9，10，11。}帕夫洛夫人担心，调理需要将有条件的刺激（CS，如听觉刺激）与逆向无条件刺激（例如，电脚休克）^配对。由于冻结是标准巴甫洛夫调理范式中唤起和测量的主要行为，因此逃逸/逃跑反应等主动防御行为形式的神经控制机制基本上尚未探索。先前的研究表明，不同形式的防御行为，如飞行，是根据威胁强度，接近和上下文^13，14引起。研究大脑如何控制不同类型的防御行为可能显著有助于理解在恐惧和焦虑障碍中调节不良的神经元过程。

为了解决这一迫切需要，我们开发了一个修改的帕夫洛夫调理范式，除了冻结^15，引起飞行和逃生跳跃。在这个范式中，小鼠被一个序列复合刺激（SCS）所制约，由纯色调和白噪声组成。经过两天的配对SCS与强烈的电脚休克，老鼠表现出冻结，以回应音色成分和飞行期间的白噪声。有条件的冻结和飞行行为之间的行为切换是快速和一致的。有趣的是，只有当白噪声 CS 与之前传递的脚部休克（调理上下文）处于同一上下文中，而不是在中性上下文中出现时，小鼠才会表现出飞行行为。相反，冻结响应在此中性环境中占主导地位，与音调相比，对白噪声的反应冻结程度要高得多。这与上下文在调节防御性反应强度方面的作用一致，也符合背景信息在传统威胁调理范式^16、17中与恐惧相关的学习和记忆中的调节作用。此模型允许以特定于上下文的方式对多个防御行为进行直接、主题内比较。

研究方案

经杜兰大学机构动物护理和使用委员会批准后，按照机构准则执行了以下步骤/程序。

1. 准备老鼠

1. 使用年龄在3-5个月的雄性和/或雌性成年小鼠。在本研究中，我们使用了从杰克逊实验室获得的雄性C57BL/6J小鼠，但任何来自信誉良好的供应商的小鼠菌株都可以使用。
2. 至少在实验前一周，在整个研究中，所有老鼠分别以12:12小时的光/暗周期进行。为小鼠提供食物和水的利 比图姆 。
3. 在光周期内执行所有行为实验。在单个队列中在同一时间执行所有会话。例如，如果在第 1 天上午 9 点开始实验，则继续从该时间开始，直到实验完成。

2. 编写学习材料

1. 研究背景
   1. 选择两个不同的上下文来执行实验。
   2. 使用由透明丛（直径 30 厘米）组成的圆柱形腔室作为上下文 A，具有光滑的 Plexiglas 地板。房间的高度应足以防止逃生（至少30厘米高）。
   3. 对于上下文 B，使用矩形外壳（25 厘米 x 30 厘米）与电网地板用于提供交替的当前脚部休克。这个房间的高度是非常重要的，应该至少35厘米高。或者，使用透明屋顶（确保视频可以通过此材料录制）。
      注意:使用墙面光滑、易于清洁的腔室。
   4. 使用不同的清洁解决方案来清洁上下文。例如，清洁上下文 A 与 1% 醋酸和上下文 B 与 70% 乙醇。在开始第一节课之前、测试单个小鼠之间以及完成一天的会话后，先清理上下文。这对于去除以前老鼠的嗅觉线索至关重要。彻底清洁也有助于防止尿液在冲击网格上缩放，这将危及调理会话。
      注意:清洁解决方案也作为嗅觉提示，因此在特定上下文中使用相同的清洁液。
   5. 在各自的研究过程中，将上下文 A 或上下文 B 放在声音衰减框中。
2. 音频生成器
   1. 在上下文上方安装一个头顶扬声器，以在 75 dB 下提供听觉刺激。
   2. 使用可编程音频生成器在预先定义的时间表上生成听觉刺激。7.5 kHz 纯音是带有鼻窦波形的声音，而白噪声是不同频率的等强度的随机信号，范围为 1-20，000 Hz。
   3. 使用 TTL 脉冲以时间精度传递听觉刺激和冲击信号。
      注:在开始实验之前，使用 dB 仪表测量每个腔室中安装扬声器的声音强度输出。
3. 休克器:将冲击器与用于提供 0.9 mA 交流冲击的电网地板连接起来。定义计算机程序中冲击的频率、发病和持续时间。在每个 SCS 结束时提供每个冲击刺激，持续时间为 1 秒，每个调理会话总共提供 5 个 SCS 冲击配对。

3. 计算机程序和视频跟踪的准备

1. 使用软件程序中的编码生成行为协议。
2. 在程序中，定义序列复合刺激 SCS。此刺激是 10 秒纯音的连续呈现（每个点以 500 毫秒的价格呈现，频率为 7.5 kHz，速率为 1 Hz）和 10 秒白噪声（1 Hz 的 500 毫秒点）。
3. 假象地定义每次试验后呈现的试用间隔 （ITI）。
4. 在研究期间，将所有鼠标行为记录到视频中，以进行后续分析。
   注:商业上可用的恐惧调理盒可能无法通过顶置摄像头记录行为。这是非常重要的，因为录制的视频用于计算水平运动，速度和动物旅行的总距离。
5. 要设置软件跟踪，在每个相关上下文中放置一个测试鼠标，调整轮廓跟踪灵敏度，并定义重心。这将确保获得有关相对位置的可靠数据。此外，定义主题可访问的整个上下文区域。
   注:两个上下文的轮廓大小的调整非常重要，因为不同上下文中的亮度变化将改变轮廓大小。
6. 使用腔室的已知大小和摄像机的像素尺寸确定校准系数，可用于计算速度（cm/s）。
7. 将数据采集计算机的时间戳事件与实时事件同步。

4. 行为实验

1. 打开所有设备:计算机、恐惧调理盒控制器、休克器以及视频和时间戳记录软件。确保仪器按适当的顺序打开。
2. 检查所有功能，包括音调、白噪声和冲击传递，并设置数据采集系统。
3. 将动物从储藏室运送到调节室。允许他们在那里适应至少10分钟。
4. 将动物从家里的笼子里拿出来，轻轻地放在各自的环境中，然后立即激活计算机程序。
   注:恐惧调理系统和数据收集（时间戳、鼠标跟踪和视频录制）软件的初始化可以同时使用 TTL 脉冲介导激活。
5. 预调理/暴露前
   1. 第 1 天，将主题放入上下文 A（中性上下文）。允许它适应室3分钟（基线期），然后暴露在4个试验的SCS20的总持续时间（图1A-1B）。
   2. 保持90年代的平均伪ITI（范围80-100s）。每次暴露前会话的总持续时间为 590 s。
6. 恐惧调理
   1. 在第2天和第3天，将主题放入上下文B。在 3 分钟的基线周期后，将受试者暴露在 SCS 的五对组合中，并伴有 1 秒 0.9 mA 交流脚部休克。
   2. 保持 120 年代的平均伪 ITI（范围 90-150 s）。每个调理会话总共持续 820 s （图 1A）。
   3. 根据实验目标，第4天对老鼠进行召回测试（见第4.7步）或担心灭绝（见第4.8步）。
7. 恐惧召回（以测试上下文依赖性）
   1. 第 4 天，将主题放入上下文 A。在3分钟的基线期后，提出4个试验的SCS没有脚休克，超过590秒。
   2. 保持90年代的平均伪ITI（范围80-100s）。
8. 害怕灭绝
   1. 第 4 天，将主题放入上下文 B。在3分钟的基线期之后，在1910年代，对SCS进行了16次无脚休克的试验。
   2. 保持 90 年代的平均伪 ITI（范围为 60-120 s）。
9. 将动物送回家笼，并重复所有动物的程序。

5. 行为量化

1. 让观察者对实验视而不见，使用自动冻结探测器阈值对录制的视频进行冻结行为评分，然后逐帧分析像素变化。
   注:其他软件包也可用于使用2个摄像头系统自动计算冻结。观察者也可以手动对冻结行为进行评分。
2. 将冻结定义为完全停止身体运动，但呼吸所需的运动除外，至少为 1 s。
3. 当所有 4 只爪子离开地板时，分数会跳动，从而产生垂直和/或水平运动。
4. 导出带有冻结、跳跃和事件标记的标记文件。
5. 从定义的时间段（例如，每次试用前 SCS、音色和白噪声的 10s 持续时间）中提取相关事件（冻结和跳跃）。
6. 使用电子表格文件中提取的事件的启动停止持续时间，通过从结束时间减去从相应的试用期中减去启动时间来计算冻结的持续时间。
7. 通过总结所有试验的冻结持续时间来代表此数据在试验中或按天进行。
   注:根据研究目的，飞行或冻结行为可以从研究会话的任何试验/持续时间进行评分和计算。
8. 将特定试用期的跳跃总数相总和。
9. 从鼠标重心的 X-Y 轴运动框架中逐帧提取鼠标跟踪坐标生成的文件，并计算鼠标的速度（cm/s）。
   注:速度数据可能以厘米/s 或像素/s 格式显示。使用视频中为该测试上下文定义的英寸或厘米/像素值将像素/s 单位转换为厘米/s（请参阅第 3.6 节）。
10. 根据视频的帧速率（最好是 30 帧/s）提取动物帧移动的速度数据后，计算特定帧数括号中动物的平均速度（将开始和结束时间乘以 s 30 以获取开始和结束帧数）。
11. 通过将每个 SCS 中的平均速度除以 10 s SCS 前（基线、BL）期间的平均速度来计算飞行分数，然后为每次逃生跳跃添加 1 分（速度/速度BL + 跳跃的 # ）。因此，飞行分数为 1 表示与 SCS 前期间的飞行行为没有变化。
12. 可选，手动为其他行为（如饲养和梳妆）评分视频。

6. 统计分析

1. 使用统计分析软件分析具有统计意义的数据。对于所有测试，统计意义的定义是 P<0.05。
2. 使用夏皮罗-威尔克正常度测试（α=0.05）检查数据以获得正常分布。
3. 要测试提示的效果，请使用适当的参数（配对 t 测试）或非参数（Wilcoxon 签名等级测试）测试进行对比比较。
4. 要评估因子的双向相互作用（Cue X 试验），请执行双向 ANOVA，然后进行事后测试（例如，邦费罗尼的多重比较测试/Tukey 的测试）。

结果

如图所述（图1A），会话从预暴露（第 1 天）开始，然后是恐惧调理（第 2 天和第 3 天），然后是灭绝或检索（第 4 天）。

SCS在暴露前（第1天）会话中的演示没有引起小鼠的飞行或冻结反应（图2A-2B）。调理期间的行为分析（第2天和第3天）显示，与前SCS（图2B，2E）期间的冻结相比，SCS

讨论

所述的声音和冲击参数是此协议的重要元素。因此，在开始实验之前测试冲击振幅和声压水平至关重要。恐惧调理研究通常使用 70-80 dB 声压水平和 0.1-1 mA 冲击强度^18:因此，所述参数在传统恐惧调理范式的范围内。在以前的CS-唯一（无脚震）控制实验中，我们没有观察到小鼠的飞行或冻结反应，这表明听觉刺激在如描述的¹⁵时并不具有逆向性。将 80 dB 以上的白?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neutral context			Plexiglass cylinder 30 X 30 cm
Fear conditioning box	Med Associates, Inc.	VFC-008	25 X 30 X 35 cm dimentions
Audio generator	Med Associates, Inc.	ANL-926
Shocker	Med Associates Inc.	ENV-414S	Stainless steel grid
Speaker	Med Associates, Inc.	ENV-224AM	Suitable for pure tone and white noise
C57/BL6J mice	Jackson laboratory, USA	664	Aged 3-5 month
Cineplex software (Editor/ studio)	Plexon	CinePlex Studio v3.8.0	For video tracking and behavioral scoring analysis
MedPC software V	Med Associates, Inc.	SOF-736
Neuroexplorer	Plexon		Used to extract the freezing data scored in PlexonEditor
GraphPad Prism 8	GraphPad Software, Inc.	Version 8	Statistical analysis software